Lez_Esercitaz_19-4
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Lez Esercitazioni 19-20 e 26-27 Aprile 2007 Il sistema regolatorio “cis acting” delle catene pesanti delle Ig umane I geni della catena pesante delle immunoglobuline mappano sul cromosoma 14 q32 Il verso di orientamento della trascrizione è lo stesso del riarrangiamento e class switch. Il sistema di trascrizione, riarrangiamento (ricombinazione), switch isotipico, maturazione del linfocita vanno di pari passo, per cui c’è interazione tra antigeni di membrana (IgM prima e IgX dopo lo switch) e cellula B e anche tra cellula B con gli altri recettori per interleukine ed altri fattori intra ed extra cellulari. Come funziona il controllo “cis” della catena pesante delle Ig Aggiornamenti dopo il sequenziamento del genoma umano e di topo Sequenze“cis” regolative genomiche (né tradotte né trascritte) servono da segnale per i fattori ed enzimi per : - i riarrangiamenti delle regioni variabili e lo switch isotipico - la trascrizione dei geni sia in fase di maturazione (trascritti sterili) che nella plasmacellula e della memoria - interagisce con i sistemi di controllo extra ed intra-cellulare di maturazione e proliferazione con feed-back per segnali verso altre cellule e da altre cellule forse con segnali di molecole che fungono da secondi messaggeri - con i fattori di trascrizione rende mobile la cromatina intorno Importanza della regolazione delle Ig I - interazione col sistema immune nelle funzioni fisiologiche e patologiche Come in ogni sistema l’importanza primaria stà nella funzione primaria in se (in questo caso le Ig) Poi ci sono le funzioni che sono correlate e dipendono da questa prima funzione Interazioni con le funzioni dei linfociti B, T, ecc. Altri sistemi correlati (snc, digerente …) Chi dice al linfocita quale “switch” fare E se lo “switch” è casuale quale è il segnale selettivo per cui nei distinti distretti restano i linfociti che producono un certo tipo di Ig Molte risposte sembrano essere correlate con gli effettori ed effetti della trascrizione delle Ig Cosa si può chiedere A monte e a valle della trascrizione delle Ig cosa c’è e quali metafunzioni svolge Avolte si conosce l’esecutore e non il mandante, spesso nessuno dei due. Per ora cerchiamo dei possibili esecutori Le tracce che stiamo cercando nel nostro caso sono sulla organizzazione della regione regolatrice e quindi sul genoma direttamente sul locus delle Ig Forse è un quadro intermedio con responsabilità del settore “risposta umorale” L’organizzazione genomica Il sito delle catene pesanti delle Ig sta sul crms 14 q32, anche le catene leggere hanno la loro importanza relativa Stiamo studiando la regione regolativa della trascrizione delle catene pesanti Lo studio è iniziato con la descrizione da parte di tre gruppi che lavorano sulle immunoglobuline umane del polimorfismo dell’enhancer centrale del complesso regolatore. 2 americani ed 1 francese Il sito delle Ig umane è poco diverso dal topo Nei primati (dalle scimmie antropomorfe) è presente la duplicazione dei 4 geni delle regioni costanti Ig3, Ig1, Ig, Ig1 vedi la figura della mappa del locus Nel topo la regione regolativa che ha un enhancer in più è definita LCR, ma per analogia non si può dire lo stesso nell’uomo finchè non si dimostri che è locus indipendente e numero dipendente (effetto quantitativo) secondo la definizione di LCR, perciò si definisce Regulative Region RR strutture regolatrici delle catene pesanti delle Ig umane geni della regione costante al 3’ delle regioni variabili * reg. variab.* VDJ * regione duplicata regione duplicata 3 1 1 enhancer 5’ Chromosome 14q32 3 enhancers 2 4 a2 3 enhancers telomero Strutture regolative della trascrizione Elementi regolativi “cis acting” a partire della regione 5’ Somatic hypermutation (SHM) class switch recombination (CSR) 3 regioni regolative principali: promotore di ogni gene V Sequenza conservata evolutivamente delle IgH (ECS) interna (I) al promotore al 5’ di ogni gene costante (C H) e nelle IgH l’enhancer intronico (iE) L’esistenza della regione regolativa al 3’ fu ipotizzata in linee cellulari con delezioni di iE in cui c’era trascrizione e per delezioni al 3’ in cui diminuiva la trascrizione bibliografia Henderson and Calame 1998 Ann.rev. Immunol 16, 163-200 Max E.E. 1999, Fundamental Immunol. Paul W.E. editor 4th edit. 148-163, Lippincott-Raven, Philadelphia Stavnezer J. 2000, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 245, 127-168 Honjo T. et al. 2002, Annu. Rev. Immunol. 20, 165-196 Birshtein B.K.et al 1997, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 224, 73-80 Khamlichi A.A. et al. 2000, Adv. Immunol. 75,317-345 SA2.5 Poly A site H B 1 U3 U5 U1R1 R2 U4 U2 A B R3 U6 R3r U7 HS3 X76785 IgH3’EC-1 H* E B B Ua1 A2R U8 U6r R4 Ua2 U9 Ua4 U 14 R6 R5 Ua3 R5 U11 U12 U13 U10 HS1,2 Y14407 HH B U5r END OF HOMOLOGY WITH ALFA2 Alu U15 LTR U16 AL928767 AL928765 ELK2 K10 retrovirus HS4 H Ua5 U64453 CHR77 (35.616 kb) Chromosome 14 3 1 1 2 4 B 2 Telomere IgH3’EC-2 SF AL928742 (40 kb) Poly A site H BB E H B U 2 R1 Ub1 U5 R3 U4-5 8r U1 U 2 UU 34 HS3 SA2.5 U6 U R3 7 B B U6r Ub2 R4 U7r R3r U5r HS1,2 A2R U 9 Ub3 A2F H H R5 R6 R5 U U U 10 11 12 HS4 END OF HOMOLOGY WITH ALFA1 Alu U13 U14 U15 LTR U16 Ub4 A B Selective amplification of HS1,2-A downstream C1 (IgH3’EC-1) Poly A site Poly A site H B B H* B Selective amplification of HS1,2-B downstream C2 (IgH3’EC-2) E B BB H Ua1 1m R1 R2 U2 R3 U5 U3 U4 U6 U8 U1 R1 R3 r 2m U7 Ub1 U2 U5 UU 34 HS 1,2 H E HS 3 HS 3 U1 B R3 U8 R3 r U6 U4-5 B U7r R3r HS 1,2 Ub2 U6r U5r R4 SA2.5 5402 bp HS 3 HS1,2 HS1,2 A2R SA2.5 ALLELE 1A HS1,2 P3Frw ALLELE 2A ALLELE 3A A2R EcoRI A2F D3Rev EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI HS1,2 D3Rev ALLELE 3B P3Frw ALLELE 4B ALLELE 4A Core of enhancer HS1,2 External element - 31 bp 4420 bp Repeated element - 38 bp External element -17 bp 14bp 16bp 20bp Internal spacers Conserved sequence Unit CM11 A M1 ALLELE ALLELE ALLELE ALLELE G A CM 4 B G A CM 5 B G A B M2 400 bp 300 bp 200 bp 4 3 2 1 100 bp B ALLELE 1A 38bp Rp 17bp El. CORE enhancer 17bp El. END HS1,2 14bp Sp. ALLELE 2A 16bp Sp. ALLELE 3A 31bp El 20bp Sp. ALLELE 3B ALLELE 4A ALLELE 4B Sites for :CEBP; CETS1P54 (-); CMYB; HSF; MEF2; OCT1; SR-Y; STAT; TH1E47; YY1 (-) Sites for :IK2; MZF1; NF-kB (P50) Sites for : AP4; E47; MYOD; E5 Sites for : CMYB Sites for : NF-kB (Q6) LCR (nel topo 4 enhancers) IgH3’EC-1/-2 (nell’uomo 3 enhancers/locus) HS3A HS1,2 HS3B HS4 mouse Ig heavy locus VDJ a b L C R human chromosome 14 q 32 HS3 HS1,2 3 1 1 copia 1 HS4 HS3 HS1,2 2 4 a2 copia 2 HS4 telomere cluster della catena pesante delle Ig X76785 Y14407 Chromosome 14 3 AL928767 AL928765 CHR77 (35.616 kb) U64453 IgH3’EC-1 1 1 2 4 2 IgH3’EC-2 SF AL928742 (40 kb) Telomere PLASMACELLULE Cellule B proliferanti IgG2a o IgG3 Cellula B attivata (centroblasto) IgA o IgG2b IL-2; IL-4; IL-5; IgE o IgG1 Citokine proliferanti: IL-2; IL-4; IL-5; Citokine per il differenzamento: IL-2; IL-4; IL-5; IFN-; TNF-b; IL-2; IL-4; IL-5; Fig. Azione delle citochine sulla ricombinazione class switching (CSR) IgM LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig Locus catena leggera l Cromosoma 22 Locus catena leggera k Cromosoma 2 Locus catena pesante Cromosoma 14 Locus Catene leggere D-J processing V-DJ VDJ processing riarrangiato VDJ riarrangiato VJ riarrangiato VJ riarrangiato VDJ riarrangiato. IgM prodotto in membrana VDJ riarrangiato. IgM prodotto in membrana. Lo splicing produce anche IgD CELLULE B Locus Catene pesanti V-J processing ANTIGENE INDIPENDENTE ANTIGENE DIPENDENTE Fig. 5A Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B. Locus Catene leggere CELLULE B Locus Catene pesanti VJ riarrangiato VJ riarrangiato Ipermutazioni somatiche VJ riarrangiato Ipermutazioni somatiche VDJ riarrangiato. Le catene prodotte in forma di membrana Switch isotipico a C, C o C . Ipermutazione somatica Switch isotipico. Ipermutazione somatica. Catene pesanti prodotte in forma di membrana Switch isotipico. Catene pesanti prodotte in forma secreta. VDJ riarrangiato Catene prodotte in forma secreta. Centrociti Cellule Memoria Plasmacellule Plasmacellule Cellule B attivate ANTIGENE DIPENDENTE VJ riarrangiato Ipermutazioni somatiche VJ riarrangiato DIFFERENZAZIONE FINALE Fig. 5B Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B. VH DH JH CH Ricombinazione V(D)J V(D)J b • Consiste di sequenze ripetute tra 1 e 10 kb Ricombinazione class switching (CSR) IgM V(D)J a Switch region: 2a IgE Risultato dello switch 2b • Il filamento non stampo è ricco in G Cricolo exciso Fig. 9 Ricombinazione class switching (CSR) nel topo. • S , S ed S hanno un repeat di 5 bp. S ha un repeat di 49 bp. Trascrizione regione S 1 A CSR ricombinasi? CSR ricombinasi? A B B C C D E F AID? AID? 2 Modifica l’RNA e/o le strutture del DNA delle regioni S accessibili RNA editing ? Riconoscimento delle regioni S accessibili A B Formazione di strutture secondarie (R loop?) D C A F B Formazione di breaks al DNA E AID? una regione S S A B C Delezioni intra-switch Riparazione dei breaks due regioni S C D F E Attivazione dei sistemi di riparazione del DNA A AID? B C Switch su un altro cromosoma S S A B E F Class switching recombination A S c-myc traslocazione Modelli che spiegano la Ricombinazione class switching (CSR). La risposta immunitaria cellulo mediata (linfociti T) umorale (non dell’umore) I linfociti B producono le immunoglobuline della risposta umorale, per poter produrre gli anticorpi specifici devono incontrare l’antigene e deve avvenire una reazione di riconoscimento. Per poi produrre gli anticorpi specifici i linfociti B vanno incontro ad una serie di processi maturativi iniziati prima con l’ematopoiesi e poi con il differenziamento verso cellule pre-B ed infine plasmacellule producenti Ig o cellule memoria (immunita’ acquisita) specifica. L’anticorpo per essere prodotto deriva da una serie di riarrangiamenti somatici dei geni delle immunoglobuline (Ig). Prima si riarrangiano le regioni variabili che corrispondono al 5’ del messaggero che trascrive la Ig e poi con lo switch isotipico la parte costante. La catena leggera non specifica la classe delle Ig. Fig. 1 Se il riarrangiamento della regione variabile e’ produttivo ed ha una reading frame traducibile si ha la produzione di IgM che migrano in membrana per riconoscere un antigene. Il processo e’stocastico. A che serve lo studio della (aforismi) struttura? La struttura e’ alla base della funzione, senza anatomia non si capisce la fisiologia. La struttura di questa regione e’ strettamente collegata alla funzione del sistema. Questa struttura viene sottoposta a riarrangiamento genomico I processi che si attivano devono parallelamente essere coordinati con la maturazione dei linfociti Dopo il riarrangiamento della regione variabile e la presentazione dell’anticorpo IgM deve avvenire o meno lo switch, il linfocita deve morire sopravvivere o proliferare e c’e’ un turn over enorme Ai cambiamenti strutturali corrispondono quelli funzionali Figura 1 (non voglio farvi una lezione di immunologia e passiamo alla struttura del locus della catena pesante Ig, crms 14 q32 subtelomerico) Mappa della catena pesante delle IG Al 5’ ci sono le parti variabili V, poi D e J che servono di collegamento alla regione costante, lo switch isotipico, tramite le regioni S che stanno al 5’ di ogni gene costante, genera l’attacco ad una sequenza costante. Noi parliamo delle regioni costanti che caratterizzano le Ig per la funzione : IgM per la risposta umorale primaria, IgG del sangue e tessuti in generale, IgA mucosa intestinale, IgE risposta allergica, IgD funzione ancora non del tutto chiara. V D J 4 cluster della catena pesante delle immunoglobuline Confronto tra i geni che costituiscono il locus IGHC nell’uomo e nel topo TOPO b a 5’ 3’ LCR UOMO 4 3’ 5’ LCR-B LCR-A Eag I VH 120 Kb NaeI Eag I j 180 Kb 3 1 1 NaeI Eag I LCR-A MluI 130 Kb 2 4 SacII NaeI Eag I 2 LCR-B 350 kb MluI 50 kb Studio della Struttura: clonaggi e sequenziamento Confronti in silicio : omologie di struttura ricerca cloni EST Filogenesi, clonaggio da altre specie della LCR (conservazione) Specie note: topo, ratto, coniglio, cavallo, bovini, primati Conservazione e variazione delle strutture (come cercare mutanti) I polimorfismi (mutazioni nell’uomo) studio di popolazione Associazione dei polimorfismi alle patologie, screening (autoimm.) Studio della variabilita’ dell’ espressione delle Ig Studio della diversa funzionalita’ Studio di espressione dei markers della maturazione Studio della induzione della maturazione e switch in vitro Finalita’ Tutto questo per arrivare a capire la regolazione fine delle Ig La struttura con attivita’cis e’ polimorfica, quanto influenza l’espressione ed il funzionamento del sistema fisiologico e patologico Le attivita’ coinvolte in questo modello sono: a) la regolazione della trascrizione ed altro (globulinemia) b) la proliferazione cellulare (linfomi) c) disregolazione delle interazioni con gli altri sistemi (allergie e malattie autoimmuni) Tanto per fare un esempio: topi knock out per il gene Ras sviluppano autoimmunita’. Cellule epiteliali tumorali possono produrre immunoglobuline attivando sistemi che non le sono specifici. Attraverso interazioni si puo’ arrivare a modificare una attivita’ che e’ strettamente collegata con il differenziamento di un altro “tessuto”. Cadono dei dogmi. !!! Si parte sempre da cellule staminali ????
