Lez_Esercitaz_19-4

Lez Esercitazioni 19-20 e 26-27
Aprile 2007
Il sistema regolatorio “cis acting” delle catene
pesanti delle Ig umane
I geni della catena pesante delle immunoglobuline mappano
sul cromosoma 14 q32
Il verso di orientamento della trascrizione è lo stesso del
riarrangiamento e class switch.
Il sistema di trascrizione, riarrangiamento (ricombinazione),
switch isotipico, maturazione del linfocita vanno di pari passo,
per cui c’è interazione tra antigeni di membrana (IgM prima e
IgX dopo lo switch) e cellula B e anche tra cellula B con gli altri
recettori per interleukine ed altri fattori intra ed extra cellulari.
Come funziona il controllo “cis” della
catena pesante delle Ig
Aggiornamenti dopo il sequenziamento del genoma
umano e di topo
Sequenze“cis” regolative genomiche (né tradotte né trascritte)
servono da segnale per i fattori ed enzimi per :
- i riarrangiamenti delle regioni variabili e lo switch isotipico
- la trascrizione dei geni sia in fase di maturazione (trascritti
sterili) che nella plasmacellula e della memoria
- interagisce con i sistemi di controllo extra ed intra-cellulare di
maturazione e proliferazione con feed-back per segnali verso
altre cellule e da altre cellule forse con segnali di molecole che
fungono da secondi messaggeri
- con i fattori di trascrizione rende mobile la cromatina intorno
Importanza della regolazione
delle Ig
I - interazione col sistema immune nelle funzioni
fisiologiche e patologiche
Come in ogni sistema l’importanza primaria stà nella funzione
primaria in se (in questo caso le Ig)
Poi ci sono le funzioni che sono correlate e dipendono da
questa prima funzione
Interazioni con le funzioni dei linfociti B, T, ecc.
Altri sistemi correlati (snc, digerente …)
Chi dice al linfocita quale
“switch” fare
E se lo “switch” è casuale quale è il segnale
selettivo per cui nei distinti distretti restano i
linfociti che producono un certo tipo di Ig
Molte risposte sembrano essere correlate con gli effettori ed
effetti della trascrizione delle Ig
Cosa si può chiedere
A monte e a valle della trascrizione delle Ig
cosa c’è e quali metafunzioni svolge
Avolte si conosce l’esecutore e non il mandante, spesso
nessuno dei due.
Per ora cerchiamo dei possibili esecutori
Le tracce che stiamo cercando nel nostro caso sono sulla
organizzazione della regione regolatrice e quindi sul
genoma direttamente sul locus delle Ig
Forse è un quadro intermedio con responsabilità del
settore “risposta umorale”
L’organizzazione genomica
Il sito delle catene pesanti delle Ig sta sul crms 14
q32, anche le catene leggere hanno la loro
importanza relativa
Stiamo studiando la regione regolativa della trascrizione delle
catene pesanti
Lo studio è iniziato con la descrizione da parte di tre gruppi che
lavorano sulle immunoglobuline umane del polimorfismo
dell’enhancer centrale del complesso regolatore.
2 americani ed 1 francese
Il sito delle Ig umane è poco
diverso dal topo
Nei primati (dalle scimmie antropomorfe) è
presente la duplicazione dei 4 geni delle
regioni costanti Ig3, Ig1, Ig, Ig1
vedi la figura della mappa del locus
Nel topo la regione regolativa che ha un enhancer in più è
definita LCR, ma per analogia non si può dire lo stesso
nell’uomo finchè non si dimostri che è locus indipendente e
numero dipendente (effetto quantitativo) secondo la
definizione di LCR, perciò si definisce Regulative Region RR
strutture regolatrici delle catene
pesanti delle Ig umane
geni della regione costante al 3’ delle regioni variabili *
reg. variab.*
VDJ
*

regione duplicata
regione duplicata
3 1 1
enhancer 5’
Chromosome 14q32

3 enhancers
2 4  a2
3 enhancers
telomero
Strutture regolative della
trascrizione
Elementi regolativi “cis acting” a partire della regione 5’
Somatic hypermutation (SHM)
class switch recombination (CSR)
3 regioni regolative principali: promotore di ogni gene V
Sequenza conservata evolutivamente delle IgH (ECS)
interna (I) al promotore al 5’ di ogni gene costante (C H)
e nelle IgH l’enhancer intronico (iE)
L’esistenza della regione regolativa al 3’ fu ipotizzata in
linee cellulari con delezioni di iE in cui c’era
trascrizione e per delezioni al 3’ in cui diminuiva la
trascrizione
bibliografia
Henderson and Calame 1998 Ann.rev. Immunol 16, 163-200
Max E.E. 1999, Fundamental Immunol. Paul W.E. editor 4th edit. 148-163,
Lippincott-Raven, Philadelphia
Stavnezer J. 2000, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 245, 127-168
Honjo T. et al. 2002, Annu. Rev. Immunol. 20, 165-196
Birshtein B.K.et al 1997, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 224, 73-80
Khamlichi A.A. et al. 2000, Adv. Immunol. 75,317-345
SA2.5
Poly A
site
H B
1
U3 U5
U1R1 R2 U4
U2
A
B
R3
U6
R3r
U7
HS3
X76785
IgH3’EC-1
H* E
B
B
Ua1
A2R
U8
U6r
R4
Ua2
U9 Ua4
U
14
R6
R5
Ua3 R5
U11 U12 U13
U10
HS1,2
Y14407
HH
B
U5r
END OF
HOMOLOGY
WITH ALFA2
Alu
U15
LTR
U16
AL928767
AL928765
ELK2
K10
retrovirus
HS4
H
Ua5
U64453
CHR77 (35.616 kb)
Chromosome 14
 
3

1  1
2
4
B
 2
Telomere
IgH3’EC-2
SF AL928742 (40 kb)
Poly A
site
H BB
E H
B
U
2 R1 Ub1 U5 R3 U4-5 8r
U1 U
2
UU
34
HS3
SA2.5
U6
U R3
7
B
B
U6r Ub2 R4
U7r R3r U5r
HS1,2
A2R
U
9 Ub3
A2F
H H
R5 R6
R5 U U U
10 11 12
HS4
END OF
HOMOLOGY
WITH ALFA1
Alu
U13 U14
U15
LTR
U16
Ub4
A
B
Selective amplification of HS1,2-A
downstream C1 (IgH3’EC-1)
Poly A site
Poly A site
H
B
B
H*
B
Selective amplification of HS1,2-B
downstream C2 (IgH3’EC-2)
E
B
BB
H
Ua1
1m R1
R2
U2
R3
U5
U3
U4
U6
U8
U1 R1
R3 r
2m
U7
Ub1
U2
U5
UU
34
HS 1,2
H
E
HS 3
HS 3
U1
B
R3
U8
R3 r
U6 U4-5
B
U7r R3r
HS 1,2
Ub2
U6r U5r
R4
SA2.5
5402 bp
HS 3
HS1,2
HS1,2
A2R
SA2.5
ALLELE 1A
HS1,2
P3Frw
ALLELE 2A
ALLELE 3A
A2R
EcoRI
A2F
D3Rev EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
HS1,2
D3Rev
ALLELE 3B
P3Frw
ALLELE 4B
ALLELE 4A
Core of enhancer HS1,2
External element - 31 bp
4420 bp
Repeated element - 38 bp
External element -17 bp
14bp
16bp 20bp Internal spacers
Conserved sequence Unit
CM11
A
M1
ALLELE
ALLELE
ALLELE
ALLELE
G
A
CM 4
B
G
A
CM 5
B
G
A
B
M2
400 bp
300 bp
200 bp
4
3
2
1
100 bp
B
ALLELE 1A
38bp Rp
17bp El.
CORE enhancer
17bp El.
END HS1,2
14bp Sp.
ALLELE 2A
16bp Sp.
ALLELE 3A
31bp El
20bp Sp.
ALLELE 3B
ALLELE 4A
ALLELE 4B
Sites for :CEBP; CETS1P54 (-); CMYB; HSF;
MEF2; OCT1; SR-Y; STAT; TH1E47; YY1 (-)
Sites for :IK2; MZF1; NF-kB (P50)
Sites for : AP4; E47; MYOD; E5
Sites for : CMYB
Sites for : NF-kB (Q6)
LCR (nel topo 4 enhancers)
IgH3’EC-1/-2 (nell’uomo 3 enhancers/locus)
HS3A HS1,2 HS3B
HS4
mouse Ig heavy locus
VDJ

  a b   L C R
human chromosome 14 q 32
HS3 HS1,2

3 1 1
copia 1
HS4

HS3 HS1,2
2 4  a2
copia 2
HS4
telomere
cluster della catena pesante delle Ig
X76785
Y14407
Chromosome 14
 
3
AL928767
AL928765
CHR77 (35.616 kb)
U64453
IgH3’EC-1
1  1

2
4
 2
IgH3’EC-2
SF AL928742 (40 kb)
Telomere
PLASMACELLULE
Cellule B proliferanti
IgG2a o IgG3
Cellula B attivata
(centroblasto)
IgA o IgG2b
IL-2; IL-4;
IL-5;
IgE o IgG1
Citokine proliferanti:
IL-2; IL-4; IL-5;
Citokine per il differenzamento:
IL-2; IL-4; IL-5; IFN-; TNF-b;
IL-2; IL-4;
IL-5;
Fig. Azione delle citochine sulla ricombinazione class switching (CSR)
IgM
LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig
Locus catena leggera l
Cromosoma 22
Locus catena leggera k
Cromosoma 2
Locus catena pesante
Cromosoma 14
Locus
Catene
leggere
D-J
processing
V-DJ
VDJ
processing riarrangiato
VDJ
riarrangiato
VJ
riarrangiato
VJ
riarrangiato
VDJ
riarrangiato.
IgM prodotto
in membrana
VDJ
riarrangiato.
IgM prodotto
in membrana.
Lo splicing
produce anche
IgD
CELLULE B
Locus
Catene
pesanti
V-J
processing
ANTIGENE INDIPENDENTE
ANTIGENE DIPENDENTE
Fig. 5A Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in
correlazione con la maturazione dei linfociti B.
Locus
Catene
leggere
CELLULE B
Locus
Catene
pesanti
VJ
riarrangiato
VJ riarrangiato
Ipermutazioni
somatiche
VJ riarrangiato
Ipermutazioni
somatiche
VDJ
riarrangiato.
Le catene 
prodotte in
forma di
membrana
Switch isotipico
a C, C o C .
Ipermutazione
somatica
Switch isotipico.
Ipermutazione
somatica. Catene
pesanti prodotte in
forma di membrana
Switch isotipico.
Catene pesanti
prodotte in forma
secreta.
VDJ riarrangiato
Catene  prodotte
in forma secreta.
Centrociti
Cellule Memoria
Plasmacellule
Plasmacellule
Cellule B
attivate
ANTIGENE DIPENDENTE
VJ riarrangiato
Ipermutazioni
somatiche
VJ
riarrangiato
DIFFERENZAZIONE FINALE
Fig. 5B Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in
correlazione con la maturazione dei linfociti B.
VH
DH
JH
CH
Ricombinazione
V(D)J
V(D)J  

 b


• Consiste di sequenze
ripetute tra 1 e 10 kb
Ricombinazione class
switching (CSR)
IgM
V(D)J 
a
Switch region:


2a

IgE
Risultato dello switch
2b

• Il filamento non
stampo è ricco in G

Cricolo exciso
Fig. 9 Ricombinazione class switching (CSR) nel topo.
• S , S ed S hanno
un repeat di 5 bp. S
ha un repeat di 49 bp.
Trascrizione regione S
1
A
CSR
ricombinasi?
CSR
ricombinasi?
A
B
B
C
C
D
E
F
AID?
AID?
2
Modifica l’RNA e/o le
strutture del DNA delle
regioni S accessibili
RNA
editing ?
Riconoscimento delle
regioni S accessibili
A
B
Formazione di strutture secondarie (R loop?)
D
C
A
F
B
Formazione di breaks al DNA
E
AID?
una regione S
S
A B C
Delezioni intra-switch
Riparazione
dei breaks
due regioni S
C
D
F
E
Attivazione dei sistemi
di riparazione del DNA
A
AID?
B
C
Switch su un altro cromosoma
S S
A B E F
Class switching recombination
A
S
c-myc
traslocazione
Modelli che spiegano la Ricombinazione class switching (CSR).
La risposta immunitaria
cellulo mediata (linfociti T)
umorale (non dell’umore)
I linfociti B producono le immunoglobuline della risposta umorale, per
poter produrre gli anticorpi specifici devono incontrare l’antigene e deve
avvenire una reazione di riconoscimento. Per poi produrre gli anticorpi
specifici i linfociti B vanno incontro ad una serie di processi maturativi
iniziati prima con l’ematopoiesi e poi con il differenziamento verso
cellule pre-B ed infine plasmacellule producenti Ig o cellule memoria
(immunita’ acquisita) specifica.
L’anticorpo per essere prodotto deriva da una serie di riarrangiamenti
somatici dei geni delle immunoglobuline (Ig).
Prima si riarrangiano le regioni variabili che corrispondono al 5’ del
messaggero che trascrive la Ig e poi con lo switch isotipico la parte
costante. La catena leggera non specifica la classe delle Ig. Fig. 1
Se il riarrangiamento della regione variabile e’ produttivo ed ha una
reading frame traducibile si ha la produzione di IgM che migrano in
membrana per riconoscere un antigene. Il processo e’stocastico.
A che serve lo studio della
(aforismi)
struttura?
La struttura e’ alla base della funzione, senza anatomia non si capisce la
fisiologia.
La struttura di questa regione e’ strettamente collegata alla funzione del
sistema.
Questa struttura viene sottoposta a riarrangiamento genomico
I processi che si attivano devono parallelamente essere coordinati con
la maturazione dei linfociti
Dopo il riarrangiamento della regione variabile e la presentazione
dell’anticorpo IgM deve avvenire o meno lo switch, il linfocita deve
morire sopravvivere o proliferare e c’e’ un turn over enorme
Ai cambiamenti strutturali corrispondono quelli funzionali
Figura 1 (non voglio farvi una lezione di immunologia e passiamo
alla struttura del locus della catena pesante Ig, crms 14 q32 subtelomerico) Mappa della catena pesante delle IG
Al 5’ ci sono le parti variabili V, poi D e J che servono di
collegamento alla regione costante, lo switch isotipico, tramite le
regioni S che stanno al 5’ di ogni gene costante, genera l’attacco ad
una sequenza costante.
Noi parliamo delle regioni costanti che caratterizzano le Ig per la
funzione : IgM per la risposta umorale primaria, IgG del sangue e
tessuti in generale, IgA mucosa intestinale, IgE risposta allergica,
IgD funzione ancora non del tutto chiara.
V D J

      4  
cluster della catena pesante delle immunoglobuline
Confronto tra i geni che costituiscono il locus IGHC
nell’uomo e nel topo
TOPO
 


b
a


5’
3’
LCR 
UOMO
 

  

 4
 
3’
5’
LCR-B
LCR-A
Eag I
VH
120 Kb
NaeI
Eag I
j  
180 Kb
3 1 1
NaeI
Eag I

LCR-A
MluI
130 Kb
2 4
SacII
NaeI
Eag I
 2
LCR-B
350 kb
MluI
50 kb
Studio della Struttura: clonaggi e sequenziamento
Confronti in silicio : omologie di struttura
ricerca cloni EST
Filogenesi, clonaggio da altre specie della LCR (conservazione)
Specie note: topo, ratto, coniglio, cavallo, bovini, primati
Conservazione e variazione delle strutture (come cercare mutanti)
I polimorfismi (mutazioni nell’uomo) studio di popolazione
Associazione dei polimorfismi alle patologie, screening (autoimm.)
Studio della variabilita’ dell’ espressione delle Ig
Studio della diversa funzionalita’
Studio di espressione dei markers della maturazione
Studio della induzione della maturazione e switch in vitro
Finalita’
Tutto questo per arrivare a capire la regolazione fine delle Ig
La struttura con attivita’cis e’ polimorfica, quanto influenza
l’espressione ed il funzionamento del sistema fisiologico e patologico
Le attivita’ coinvolte in questo modello sono:
a) la regolazione della trascrizione ed altro (globulinemia)
b) la proliferazione cellulare (linfomi)
c) disregolazione delle interazioni con gli altri sistemi (allergie e
malattie autoimmuni)
Tanto per fare un esempio: topi knock out per il gene Ras sviluppano
autoimmunita’. Cellule epiteliali tumorali possono produrre
immunoglobuline attivando sistemi che non le sono specifici. Attraverso
interazioni si puo’ arrivare a modificare una attivita’ che e’ strettamente
collegata con il differenziamento di un altro “tessuto”.
Cadono dei dogmi. !!! Si parte sempre da cellule staminali ????