Diapositiva 1 - e

Il DNA mobile: gli elementi trasponibili ed
il loro utilizzo in genomica
Mutagenesi inserzionale mediata da elementi trasponibili;
il vantaggio della mutagenesi inserzionale mediata da
elementi trasponibili permette una facile mappatura
dell’inserzione e un rapido clonaggio del gene alterato
Mutagenesi inserzionale
La mutagenesi inserzionale con elementi trasponibili modificati (P in Drosophila)
è una strategia utilizzata prima in genetica diretta e dopo in genetica inversa
Genetica diretta:
Induzione di mutazioni inserzionali in geni essenziali (vitalità, fertilità)
precedentemente identificati da analisi mutazionale e con fenotipo mutante noto
Scopo: di isolare la sequenza di DNA e delucidare la funzione del gene e del suo
prodotto
Genetica inversa:
Induzione di mutazioni inserzionali in geni putativi identificati dall’analisi bioinformatica della sequenza del genoma di cui non sono disponibili alleli mutanti.
Scopo: verificare se il gene putativo è essenziale e identificare la funzione del
prodotto proteico
Gli elementi genetici trasponibili
(trasposoni, elementi mobili, elementi nomadici)
Definizione: Sequenze di DNA in grado di variare la propria localizazione
all’interno del genoma (sia all’interno di uno stesso cromosoma che tra
cromosomi diversi).
Presenza: gli elementi trasponibili sono componenti ubiquitari e abbondanti dei
genomi eucariotici, 15% in Drosophila, 45% nella specie umana, 50% nel Mais e
addirittura 90% in altre piante.
La scoperta degli elementi
trasponibili
Elementi di controllo nel mais
1950 Barbara McClintock
Studiando fenomeni di instabilità genetica nel granturco
scopre un fattore genetico Ds (Dissociatore) e Ac (Attivatore)
“Bisogna sempre credere alle nostre osservazioni, per
quanto bizzarre possano essere, forse stanno cercando di
dirci qualcosa” (Barbara McClintock)
Il lavoro di Barbara McClintock
‘
Classificazione degli elementi trasponibili
Meccanismo di trasposizione delle due classi
La % dei vari elementi trasponibili nella specie umana
Gli elementi trasponibili violano le leggi della Genetica
La scoperta di sequenze mobili di DNA, e gli effetti genetici da essi
prodotti rappresentano una significativa eccezione al mendelismo e ai
principi della Genetica classica che vede i geni come entità a
localizzazione fissa sui cromosomi.
I movimenti degli elementi trasponibili
generano mutazioni
Gli elementi trasponibili possono causare:
1)Mutazioni da inserzione all’interno di geni strutturali o in porzioni regolative
2)Mutazioni cromosomiche (delezioni, duplicazioni, inversioni, traslocazioni,)
3)Aumento ricombinazione
Interazioni con il genoma ospite: controllo della trasposizione
Significato:
1) Sono parassiti molecolari (DNA egoista)
2) Sono fonte di variabilità genetica e quindi collaborano all’evoluzione del genoma
3) Possono acquisire funzioni essenziali per la cellula e per la sopravvivenza dell’ospite
Effetti genetici: le mutazioni indotte dai trasposoni
Inserzioni negli esoni: copia e P nel gene white; Ds in waxy
Inserzioni nelle regioni regolative: P, gypsy, Tam3
Inserzioni negli introni: Mu in knotted, I in white e rolled
}
mutazioni nulle
mutazioni ipomorfe,
ipermorfe, neomorfe
Inserzioni nell’eterocromatina
Mutazioni cromosomiche: inversioni, delezioni, duplicazioni
Effetti delle inserzioni sull’espressione del gene
Esone interrotto
Esone aberrante
Deregolazione
Effetti sulla regolazione
L’esempio di Gypsy
Elementi trasponibili “addomesticati”: il caso dei
telomeri di Drosophila
Het-A e TART: gli elementi richiesti per la formazione dei telomeri in
Drosophila sono uno degli esempi più evidenti di trasposoni che possono
acquisizione funzioni essenziali nel corso dell’evoluzione
Localizzazione di Het-A e TART nel telomero di
3L
Metodi diagnostici CLASSICI per rivelare eventi di trasposizione
La disgenesi dell’ibrido P-M: quando i trasposoni si attivano
(Margaret Kidwell anni ‘70)
Incapacità di ceppi di Drosophila di incrociarsi in modo produttivo: gli ibridi non sono fertili
Elevata sterilità
Elevata frequenza mutazioni
Segregazione meiotica alterata
La scoperta degli elementi P (Bingham, Kidwell e Rubin, 1981)
Analisi molecolare di alleli white
indotti in disgenesi
Isolamento di una sequenza di 2,9 Kb
presente in diversi alleli
Elemento P
disgenesi P-M
white +
white
white
P
M
fino a 50 copie nei
ceppi P,
assente nei ceppi M
La disgenesi dell’ibrido P-M: il controllo genetico
della trasposizione in Drosophila
La disgenesi P-M: basi molecolari
L’elemento P
P è un elemento trasponibile di classe 2 e codifica una trasposasi responsabile della sua
mobilizzazione. In presenza della trasposasi , qualsiasi frammento di DNA posto tra le regioni
terminali invertite (IR) puo’ essere trasposto
L’elemento P si integra preferibilmente nelle estremità 5’ del gene ospite e nelle vicinanze o
all’interno di altri elementi P.
E’ stata messa in evidenza una leggera preferenza per sequenze target GGCCAGAC
Le due classi di elementi trasponibili eucariotici
Meccanismo di trasposizione di P
Gli elementi P si
muovono mediante
un meccanismo di
TAGLIA e INCOLLA
Splicing alternativo e trasposizione di P
STOP
http://www.oup.co.uk/best.textbooks/
Gli elementi P sono
presenti nei cromosomi
di cellule somatiche
germinali ma la
TRASPOSASI è attiva
solo in quelle germinali
Trasferimento orizzontale di P
Utilizzo pratico degli elementi P per
transgenesi e mutagenesi inserzionale
Elementi P “ingegnerizzati” per transgenesi in Drosophila
(Spradling and Rubin 1982)
Spradling and Rubin utilizzano gli elementi P come vettori per trasformare le cellule della linea
germinale con DNA esogeno ed inserirlo stabilmente nei cromosomi.
Elementi P “ingegnerizzati” per transgenesi in Drosophila
PLASMIDE DONATORE:
1) Transgene di interesse (tra seq ripetute
invertite 5’P-3’P)
2) gene reporter (LacZ)
3) gene marcatore fenotipico (w+ occhi rossi)
Embrione wt -/-
PLASMIDE con gene della TRASPOSASI:
1) Codifica per trasposasi
2) Sequenza IR 5‘ difettiva TRASPOSiZIONE
INATTIVA
Iniezione dei 2 vettori in embrione precoce
Il vettore P con il DNA esogeno si integra in
alcune della linea germinale
Elementi P “ingegnerizzati” per transgenesi in Drosophila
Mutagenesi inserzionale
La mutagenesi inserzionale con elementi trasponibili modificati (P in Drosophila) è una
strategia utilizzata prima in genetica diretta e successivamente in genetica inversa
Genetica diretta:
Induzione di mutazioni inserzionali in geni essenziali (vitalità, fertilità) precedentemente
identificati da analisi mutazionale e con fenotipo mutante noto.
Mutagenesi inserzionale generalizzata e selezione di alleli.
Scopo: di isolare la sequenza di DNA e delucidare la funzione del gene e del suo
prodotto
Genetica inversa:
Induzione di mutazioni inserzionali in geni putativi identificati dall’analisi bio-informatica
della sequenza del genoma di cui non sono disponibili alleli mutanti.
Mutagenesi sito-specifica; Gene disruption
Scopo: analisi funzionale di geni e loro prodotti
Elementi P “ingegnerizzati”
Elementi enhancer trap
I costrutti enhancer trap: permettono in particolare di “pescare” sequenze regolative di DNA
Il costrutto di questo tipo è formato da:
•Una coppia di IR che rappresentano le estremità di un elemento trasponibile P.
•Un promotore minimo
•Un gene reporter (lac Z oppure GFP) posto all'estremità del costrutto per renderlo il
più sensibile possibile quando si trova nelle vicinanze di un enhancer (non viene mai
posizionato al centro). Il promotore minimo, infatti, non consente un' espressione
rilevabile del reporter.
•Un gene marcatore fenotipico (rosy+ o white+)
•Sequenze necessarie per la replicazione e selezione del DNA plasmidico in E.coli
Espressione del gene reporter lacZ in ghiandole salivari
Quando il elemento P si inserisce vicino ad un sito enhancer, il gene reporter lac
Z viene espresso e acquisisce il pattern di espressione stadio e tessuto specifico
determinato dall’enhancer
Espressione del gene reporter lacZ (b-gal) “guidata” da
specifici enhancer durante l’embriogenesi di Drosophila
mesoderma viscerale
ectoderma laterale
ibridazione in situ RNA-RNA
disco imaginale della zampa
Elementi P (EP) per missespression
I costrutti P(EP): modificano il profilo di espressione del gene in cui si inseriscono utilizzando
sequenze regolative UAS di lievito
Il costrutto è formato da:
•Sequenze UAS (upstream activator sequence)
•Gene marcatore fenotipico (rosy o white)
•Sequenze necessarie per la propagazione del DNA plasmidico in E.coli
Quando il costrutto si inserisce al 5’ di un gene nell’orientamento corretto, l’espressione
del gene può essere indotta esprimendo contemporaneamente un driver GAL4.
L’espressione anomala del gene può produrre un fenotipo anomalo
Elementi per Gene Disruption Project
Elemento P(GT1)
Il GAL4 è privo di un promotore ma possiede
un sito accettore di splicing (GU), quindi si
esprime solo quando si inserisce a valle di un
promotore o di una sequenza “splice donor”
(AG).
Il mini-white ha un promotore proprio e un
sito donatore di splicing al 3’ (AG), ma è
privo di una sequenza-segnale di
poliadenilazione (il mini-white viene espresso
quando si viene a trovare a monte di una
sequenza di poliadenilazione).
lac-z
Elementi per Gene Disruption Project
Elemento P(SUPor-P)
Il mini-white è delimitato da sequenze “insulator” derivate dal
retrotrasposone gipsy che bloccano l’interazione enhancer-promotore.
Se il costrutto si inserisce nelle regioni regolative al 5’ di un gene causa
una mutazione di tipo regolativo con una frequenza maggiore rispetto ad altri
costrutti che non bloccano l’interazione fra sequenze regolatrici
Dove mappa la mutazione ?
(sul cromosoma 2 o sul 3?)
Incroci per mappare la mutazione inserzionale
Mappatura per ibridazione in situ sui
cromosomi politenici usando come
probe il DNA di P
Localizzazione delle inserzioni di P mediante FISH
Verificare che fenotipo mutato sia
effettivamente causato dall’inserzione
dell’elemento P.
Escissione dell’inserzione dell’elemento P
e reversione del fenotipo mutante
Allele inserzionale di partenza
(mini-white dà occhi rossi )
Perdita del’inserzione (occhi
bianchi); confermata per FISH
escissione
Test di complementazione con
allele inserzionale originale per
verificare effettiva reversione
Clonaggio del gene
Se la mutazione è causata dall’inserzione di un elemento P il gene si può
clonare mediante:
• Plasmid rescue
• PCR inversa
Plasmid rescue
DNA genomico
trasposone
ampR
DNA genomico
OriC
X
Digestione con X
ampR
X
OriC
X
Ligazione
X
ampR
X
OriC
Trasformazione in cellule E.coli
PCR inversa
DNA genomico
trasposone
DNA genomico
X
X
Digestione con X
A
Genomic DNA is digested into
fragments of a few kilobases by a
usually low-moderate frequency (6-8
base) cutting restriction enzyme
X
Under low DNA concentrations, selfligation is induced to give a circular
DNA product.
PCR is carried out as usual, with
primers complementary to sections
of the known internal sequence.
X
X
Ligazione
X
PCR inversa
B
A
B
P-element Gene Disruption Project
L’escissione imprecisa di P
c) Riparazione “Homology-directed” da cromatide fratello
d) Riparazione “Homology-directed” da cromosoma omologo
e) Riparazione “Non-homologous end-joining” lascia un “impronta “ che contiene sequenze di una o
entrambe le IR contains inverted repeats
f) Piccole delezioni
g) Gap repair utilizzando uno stampo “ectopico” per introdurre sequenze specifiche
Mutagenesi inserzionale random mediata da piggyBac
La mutagenesi inserzionale mediata dall’elemento P, pur avendo permesso di
mutagenizzare su larga scala più del 40% dei geni di Drosophila ha, tuttavia, una
forte limitazione legata al fatto che l’elemento P non si integra in maniera random
nel genoma, ma ha dei siti preferenziali di inserzione (hotspots)
Per questo motivo è stato sviluppato e messo a punto da Hacker e coll. un
nuovo sistema di mutagenesi inserzionale random basato sull’utilizzo
dell’elemento piggyBac
TTAA
TTAA
Mutagenesi inserzionale random mediata da piggyBac
Trasposone a DNA identificato nel lepidottero Trichoplusia ni.
L’efficienza di mutagenesi è paragonabile a quella indotta da P
L’elemento piggyBac è:
•stabile nel genoma di Drosophila anche in presenza di elementi P
•meno suscettibile agli hotspots
•si integra preferenzialmente in sequenze non target di P
•produce escissione precisa
Specie trasformate con piggyBac
Il sistema è basato sull’utilizzo degli elementi trasponibili piggyBac (l’elemento
“mutator”) e Hermes (l’elemento jump-starter) opportunamente ingegnerizzati
per la trasformazione della linea germinale.
Il costrutto piggyBac mutator è formato da:
•ITR (inverted terminal repeat) di piggyBac
•Un gene marker (EYFP) sotto il controllo del
promotore di Pax6
•Un gene reporter (GAL4)
Il costrutto Hermes jump-starter è formato da:
•ITR (inverted terminal repeat) di Hermes
•Un gene marker (ECFP) sotto il controllo del
promotore di Pax6
•Il gene che codifica per la trasposasi di
piggyBac sotto il controllo del promotore di
a tubulina
La specificità di inserzione di piggyBac è diversa da quella di P
Table 1. Statistical overview over piggyBac insertions on the third chromosome
Il 57% delle inserzioni di
piggyBac si trova in geni non
target di P
Category
n
Single male crosses
%
2,5
Independent insertions recovered
1,741
70
Insertions on third chromosome
798
46
Insertions sequenced
604
Repetitive
46
Unique
558
Intergenic insertions
254
Insertions in transcripts
304
Previously hit by P elements
132
43
No P element hit reported
172
57
Lethal insertions
131 (72)
16 (9)
Excised
39
Reverted
22
56
Gli elementi P tendono a trasporsi prefenzialmente
in siti genomici vicini
Per indurre alleli inserzionali di un gene di cui è nota la sequenza, ma non la funzione è
consigliabile una mutagenesi mirata, con un singolo elemento P che mappa in siti adiacenti
Local jumping
3 kb
Elemento P
gene
gene
Inattivazione dell’espressione genica mediante RNAi
Gli elementi trasponibili nei mammiferi
Meccanismo di trasposizione di L1H
Le malattie da retrotrasposoni
Inserzione di L1 nell’esone 14 del gene per il fattore VIII
Retrotrasposizione e malattie umane
Circa 100 casi noti di varie malattie
umane ereditarie causate da inserzioni
de novo di L1, Alu and SVA: emophilia,
fibrosi cistica, Apert syndrome,
neurofibromatosi, Distrofia muscolare
Duchenne, beta-thalassemia,
ipercholesterolemia, cancro del seno e
del colon.
E’ stato stimato che ~0.3% di tutte le
mutazioni presenti nella specie umana
è attribuibile a inserzioni de novo L1, Alu
e SVA.
Trasferimento orizzontale di L1H in N. gonorrhoeae
Una sequenza di 685 bp con un’identità nucleotidica del 98–100%
Retrotrasposizione di L1 in sistemi transgenici di
mammifero (Kazazian& co)
Retrotrasposizione di L1 in sistemi transgenici di
mammifero (Kazazian& co)
Modelli transgenici di topo e ratto con L1 umani o di topo guidati da promotori endogeni
I transgeni utilizzati sono rappresentati da un elemento L1 (umano o di topo) che nella regione
3’ UTR contiene una “cassetta di retrotrasposizione” seguita da un poly(A) di SV40
Eventi di retrotrasposizione nelle F1 di vari incroci
La progenie di animali transgenici per L1 umano mostrano una elevata attività di retrotrasposizione.
Nei topi, gli eventi di retrotrasposizione di L1 sono stati osservati in 133 su 208 individui (64%) della
progenie che ha ereditato il transgene e nel 9% di quella che ne era priva.
I ratti transgenici hanno mostrato un’attività di retrotrasposizione più elevata rispetto ai topi.
Gli eventi di retrotrasposizione di L1 umano sono stati identificati in tutti i 197 ratti che hanno ereditato
il transgene e nel 6% di quelli che ne erano privi.
In totale, sono stati identificati 35 animali (topi e ratti) che erano transgene-negative, retrotransposition
event-positive.
Retrotrasposizione in sistemi transgenici di mammifero
19 animali transgenici analizzati presentano eventi de novo di retrotrasposizione di L1
Retrotrasposizione di L1 e mosaicismo
1) I topi 11* e 17* non hanno transgene (L1tg), ma mostrano la banda di retrotrasposizione (L1Rtn),
sono detti transgene-negative, retrotransposition event-positive
2) Nessuno dei loro figli mostra retrotrasposizione
3) Se ne deduce che 11 e 17 sono un mosaico. Ovvero la retrotrasposizione è avvenuta nelle
cellule somatiche d i11 e 17, ma non in quelle della linea germinale.
Trascritti di L1 in vari tessuti e stadi di sviluppo
I trascritti sono abbondanti in cellule spermatogeniche e in vari stadi embrionali, mentre
non si rivelano in tessuti/organi differenziati, con l’eccezione di polmone e rene nel ratto dove è
presente una debole amplificazione.
Eventi di retrotranspositione di L1 in vari tessuti e stadi
di sviluppo
La retrotransposizione di L1
si osserva raramente nelle cellule
spermatogeniche, ma è
frequente negli embrioni preimpianto (blastocisti e morula)
CONCLUSIONI
•
Quantità abbondanti di L1 RNA si trovano principalmente nella frazione di cellule
spermatogeniche, dove non si osserva retrotrasposizione.
•
Malgrado l’abbondante quantità di L1RNA nelle cellule spermatogeniche, la quota maggiore di
retrotrasposizione avviene dopo la fecondazione (stadi di morula e blastocisti) e potrebbe
continuare nel corso dello sviluppo
•
La frequenza stimata di retrotrasposizione di L1 è circa 10 volte maggiore in cellule somatiche di
animali che hanno il transgene rispetto a quelli che ne sono privi.
•
La maggior parte degli eventi di trasposizione somatici sono dovuti a L1 trascritto dopo al
fecondazione, dando luogo a mosaicismo.
•
I risultati suggeriscono che le cellule germinali hanno un meccanismo di difesa posttrascrizionale che previene l’integrazione di L1 nel genoma.
•
Cellule germinali embrionali hanno abbondanti quantità di RNA di L1 in conseguenza della
demetilazione nei testicoli fetali (Kuramochi-Miyagawa et al. 2008), mentre gli L1 nei tessuti
somatici differenziati sono silenziati.
•
Possibile ruolo della retrotrasposizione somatica di L1 nello sviluppo precoce con effetti
sull’apprendimento e sul comportamento
Trascrizione e retrotrasposizione di L1 in cellule
germinali e sviluppo precoce
Retrotrasposizione di L1 nel cervello umano
Retrotrasposon capture (RC) high-throughput assays
Campioni di DNA di ippocampo e
nucleo caudato di 3 donatori
Retrotrasposizione di L1 nel cervello umano
24,540 inserzioni tra cui L1 (32.2%) e Alu (60.9%). 8.4% di Alu e 1.9% di L1 sono identiche a
quelle già annotate in vari cataloghi/database di popolazioni umane e quindi si deduce che derivino
da eventi germinali presistenti. La rimanente quota di inserzioni è di natura somatica
Geni coinvolti nella neurogenesi e funzioni neurali sono target preferenziali.
L’ippocampo sembra particolarmente predisposto alla mobilizzazione somatica di L1; questo è
particolarmente interessante visto che la zona subgranulare dell’ippocampo è la principale fonte che
contribuisce alla neurogenesi adulta.
Mosaicismo somatico
La mobilizzazione somatica di L1 è correlata alla plasticità neurale?
Ovvero, alla capacità dei neuroni di cambiare le connessioni dei dentriti
e neuriti e creare nuove sinapsi.