Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile
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TRANSGENESI IN M. musculus Creazione di animali geneticamente modificati per: - conferma di gene candidato responsabile patologia umana - studio della funzione e della regolazione genica - modelli animali per lo studio delle malattie umane - modelli animali sperimentali: per la correzione del difetto genetico (“rescue” fenotipico), per messa a punto terapia farmacologica Un organismo si considera transgenico quando il gene esterno è: • integrato nel suo genoma; • espresso correttamente e selettivamente in uno o più tessuti dell'animale; • integrato nella linea germinale e quindi trasmissibile dall’animale fondatore alla progenie. TRANSGENESI IN M. musculus KNOCK IN Introduzione di sequenza genica (può appartenere alla stessa specie o può derivare da specie differenti) da esprimere nel topo. L’inserzione di un gene esogeno può contemporaneamente determinare l’inattivazione del gene endogeno attraverso il suo inserimento. KNOCK OUT Introduzione di sequenza genica per l’abolizione della funzione genica endogena TRANSGENESI IN M. musculus METODI DI TRASFERIMENTO GENICO 1) Trasferimento genico diretto: -Trasfezione DNA libero con microiniezione 2) Trasferimento tramite vettori (adenovirus, virus adeno associati, retrovirus): infezione virale 3) Metodi: - Microiniezione nel pronucleo maschile in oocita fecondato - Trasferimento nucleare di cellula con transgene in oocita fecondato privo di nucleo e reimpianto in madre surrogata. -Trasferimento genico in cellule Embrionali Staminali (ES) e reimpianto in blastocisti 4) Tipi di inserzione: - ectopica - mirata Inserzione ectopica: effetto di posizione Influenza di elementi di regolazione endogeni (enhancer, silenziatori) Influenza struttura cromatina (eterocromatina, DNA ipermetilato) Inserzione mirata Inserimento nel genoma in una posizione occupata da sequenza omologa Controllo di espressione del transgene Uso di promotori costitutivi (es: promotore + enhancer di SV40) per geni sempre attivi e molto espressi Uso di promotori inducibili specifici per tipo cellulare o stadio di sviluppo Uso di proteine di fusione rilevabili facilmente TRANSGENESI IN M. musculus - Gene da esprimere fuso con cDNA proteina GFP - Gene da esprimere fuso con peptidi target di anticorpi fluorescenti. Produzione di organismo Knock-in o Knock-out per ricombinazione omologa DNA esogeno DNA genomico Produzione di organismo Knock-out per ricombinazione Produzione di organismo Knock-out/in per ricombinazione Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile Oocita fecondato Accoppiate con maschi vasectomizzati Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile Si microiniettano molti oociti Trasferimento genico tramite trasferimento nucleare fecondato Riprogrammazione del nucleo che ripercorrerà l’intero sviluppo Metodi per produzione di topi transgenici - Microiniezione nel pronucleo: se l’inserimento riesce, tutto l’animale che ne deriva è transgenico (comprese cellule germinali) - Trasferimento nucleare: se l’inserimento riesce, tutto l’animale che ne deriva è transgenico - Trasfezione (o elettroporazione) di cellule Embrionali Staminali (ES) e reimpianto in blastocisti, l’animale che ne deriva è chimerico (produrrà transgenici solo se le sue cellule germinali sono transgenizzate) Mutagenesi di cellule ES NO è una CHIMERA!!! Zigote Mutazione genetica Zigote 1(blastocisti) Zigote 2 (cellule ES) due popolazioni cellulari Mosaico due popolazioni cellulari Chimera Mutagenesi di ES con inserzione mirata per produzione topo KO Si controlla il corretto inserimento attraverso la metodica della selezione positivanegativa con G418 e ganciclovir Vettore con: gene tk (timidino-chinasi) (tk+ ) dell’Herpes virus (tk HSV), gene della Neomicina resistenza = neoR Gene endogeno inattivato per inserzione mirata del gene neoR Tk = pathway di recupero dei nucleotidi: converte la timidina libera in monofosfato per la sintesi DNA Selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovir G418: analogo della neomicina Ganciclovir (Gcv): analogo del nucleoside erpetico: uccide le cellule tk+, ovvero con il vettore virale inserito Tk HSV Gcv Tk mammifero Gcv-P Gcv-PPP Incorporazione DNA Terminazione catena rottura DNA Selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovir Cellule ES con mutazione impiantate in blastociti di madre surrogata Mutagenesi di ES con inserzione mirata per produzione topo ko Cellule ES con mutazione impiantate in blastociti di madre surrogata Produzione di topo ko (in omozigosi) successivo a mutazione mirata Aguti Fenotipo ko = Coda arricciata CREAZIONE TOPO KnockOut 1) Ricombinazione omologa nelle cellule staminali embrionali (topo marrone) 2) Selezione con G418 e gancyclovir 3) Iniezione delle cellule transgeniche in una blastocisti e impianto in una madre pseudogravida (topo nero) 4) Progenie chimerica 5) Incrocio di eterozigoti per ottenere topo omozigote ESEMPI DI MODELLI MURINI DI PATOLOGIE UMANE OTTENUTI CON METODI TRANSGENETICI Malattia Gene Metodo Fibrosi cistica CFTR Inattivazione da inserzione mirata Beta talassemia Beta globina Inattivazione da inserzione mirata Malattia di Gaucher GBA Inattivazione da inserzione mirata Sindrome dell’X fragile FMR1 Inattivazione da inserzione mirata Sindrome da prioni umana PRNP Integrazione del gene murino mutante della proteina prionica Atassia spinocerebellare I SCA1 (atassina) Integrazione del gene umano espanso I topi sono sempre un buon modello? Mutazioni spontanee in topi, patologie spesso diverse dalle umane Topo NOD: diabetico ma senza obesità. Assomiglia al diabete insulinodipendente umano Topo mdx: mutazione nonsenso nel gene mdx, distrofia molto più lieve della DMD Modelli per malattie con perdita di funzione: identificazione ortologo e creazione topo knock-out. Produzione di: alleli nulli (assenza completa di funzione), mutazioni leaky, (inattivazione geni con funzione simile) Differenza nel fenotipo possibile per presenza di geni modificatori in differenti ceppi murini Modelli per malattie umane con acquisto di funzione: topo knock-in (es inserimento di oncogeni, geni con triplette espanse) I topi sono sempre un buon modello? Differenze nelle vie biochimiche Differenze nei percorsi di sviluppo Durata della vita media (esordio tardivo nell’uomo) Differenze nel contesto genetico
