4 Diagnostica batterica II
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Identificazione dei microrganismi 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. esame microscopico diretto del materiale in esame Caratteristiche morfologiche Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen Caratteristiche colturali Caratteristiche biochimiche Tipizzazione fagica Caratteristiche antigeniche (Diagnosi sierologica) Antibiogramma Paziente (sospetta malattia infettiva) Via immunologica Prelievo di sangue Via microbiologica Sangue Feci Urine Biopsia Ricerca di anticorpi contro il sospetto patogeno Prove sierologiche (RIA, ELISA) Microbiologia tradizionale Coltura in un terreno selettivo Microbiologia innovativa Immunologia (ricerca del patogeno: batteri o virus) Immunofluorescenza ELISA Isolamento Identificazione Prove selettive Identificazione immunologica Sensibilità agli antibiotici (decisione sulla chemioterapia) Biologia molecolare (ricerca del genoma del patogeno) DNA-probes PCR Diagnosi sierologica di infezione batterica DIRETTA: ricerca di proteine o altri componenti (=antigeni) del microrganismo A tale scopo devono essere disponibili sieri iperimmuni o anticorpi monoclonali che reagiscono specificamente solo con il patogeno che si ricerca. La disponibilità di sieri iperimmuni e di anticorpi monoclonali, specifici per i vari antigeni presenti sul corpo batterico (antigeni dei flagelli H, dei pili F, delle strutture pilo- simili K/F, della capsula K, della parete cellulare O), permette di eseguire prove immunologiche specifiche adatte a identificare con precisione un microrganismo. INDIRETTA: ricerca di anticorpi specifici per il batterio d’interesse Metodi diretti Identificazione con sieri iperimmuni o anticorpi Agglutinazione ELISA Immunofluorescenza IFA monoclonali Metodi indiretti Fissazione del complemento Agglutinazione Precipitazione ELISA Immunofluorescenza IFA Western blot Scelta del metodo diagnostico DIAGNOSI DIRETTA: maggiore specificità ma… DIAGNOSI INDIRETTA: generalmente meno costosa, e più accessibile La scelta dipende da: •FASE DELLA MALATTIA •Il batterio o gli anticorpi devono essere presenti nel campione da analizzare •CARATTERISTICHE del batterio •Il batterio, se si sceglie il metodo diretto, deve essere coltivabile (isolam) o in grande quantità (ELISA) •VALORE DIAGNOSTICO DI UN EVENTUALE TITOLO ANTICORPALE •Gli Ac devono, se presenti, voler dire qualcosa… •TIPO DI TEST •Screening, test su caso sospetto e conferma? CAMPIONI CLINICI per la diagnosi diretta CAMPIONI MONOMICROBICI DAL SANGUE Plasma Frazione liquida del sangue non coagulato. importante l’anticoagulante Siero Frazione liquida del sangue coagulato LIQUOR CEFALORACHIDIANO Usare tale e quale CAMPIONI CLINICI per la diagnosi diretta CAMPIONI POLIMICROBICI: di solito vanno trattati TAMPONI immersi in liquido di trasporto (PBS, 20% FCS o BSA, antibiotici, antimicotici) URINA diluita 1:2 in VIB Filtrata, centrif a 15000 Semina del pellet FECI Diluite 1:5 o 10 in VIB. Centrif a bassa velocità. Supernatante centrif a alta velocità. Semina del pellet (cloroformio) BRONCOLAVAGGI GARGARIZZATI BIOPSIE diluiti, rimosso muco. Tenute le cellule omogenate in VIB, centrif. Diagnosi diretta Nella diagnosi diretta, la sierologia è deputata al riconoscimento del germe. Si acquistano già pronti anticorpi di origine animale, marcati diversamente a seconda del loro uso. Molto usati sono gli ANTICORPI MONOCLONALI. AGGLUTINAZIONE (metodo diretto) L'agglutinazione permette di individuare anche antigeni solubili multivalenti (antigeni capsulari) avvalendosi di matrici inerti al lattice ( di forma generalmente sferica) coniugate con immunoglobuline specifiche note sensibilizzate (le immunoglobuline sono legate sulla superficie delle sfere) dirette contro un certo antigene. L'agglutinazione si visualizza con formazione di granuli sul fondo della provetta o su particolari cartoncini a fondo scuro. Una colonia del batterio in esame viene stemperata in una goccia di antisiero o di anticorpo monoclonale, specifico per il batterio sospettato (Salmonella, Brucella) posta su vetrino: se l'anticorpo riconosce il microrganismo reagisce con i corpi batterici, causando, entro pochi minuti, la loro agglutinazione visibile ad occhio nudo. Le reazioni di agglutinazione su vetrino possono essere rese più evidenti impiegando anticorpi preventivamente coniugati con particelle di lattice; in tal modo l'agglutinazione può essere osservata agevolmente a occhio nudo anche quando gli anticorpi reagiscono con specifiche strutture antigeniche poco rappresentate nel corpo batterico. L'agglutinazione con anticorpi coniugati a particelle di lattice viene impiegata con successo per la diagnosi rapida di Staphylococcus aureus, Streptococchi patogeni, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Cryptococcus neoformans, Candida albicans. A A g gA g A g A g Ab REAZIONI ANTIGENE-ANTICORPO ELISA (ENZYME LINKED IMMUNOASSORBENT (metodo diretto) ASSAY) •E’ una tecnica fra le più usate: Semplice, sensibile, veloce (2 ore alla risposta), economica, reagenti stabili. •Puo’ essere resa quantitativa con una curva di taratura. Campione Es: feci,urina etc microrganismo Anticorpo che “cattura” Perossidasi o Fosfatasi alcalina Anticorpo marcato con enzima “ELISA diretto” per la ricerca di antigeni nei campioni biologici FASE 1: L’ anticorpo di cattura immobilizzato su fase solida lega l’ antigene se questo è presente nel campione FASE 2: dopo lavaggio viene aggiunto il secondo anticorpo che lega l’ antigene solo se questo è stato precedentemente legato FASE 3: dopo ulteriore lavaggio viene aggiunto il substrato. Si sviluppa una reazione colorimetrica solo in presenza dell’ enzima perossidasi. Se il pozzetto si colora, la reazione è positiva FASE 4: Si blocca la reazione e si effettua la lettura fotometrica IMMUNOFLUORESCENZA (metodo diretto) E’ una delle tecniche più sensibili (fino a 1000 molecole antigeniche se localizzate). Serve per rilevare antigeni (si adoperano anticorpi noti) anche a localizzazione intracellulare (Chlamidia, Rickettsiae). Permette di: •visualizzare la localizzazione di un antigene (citoplasmatica, di membrana, nucleare). •determinare più antigeni o marcatori sulla stessa cellula, utilizzando fluorocromi diversi Immunofluorescenza diretta Immunofluorescenza diretta Immunofluorescenza diretta Immunofluorescenza diretta Metodi indiretti Fissazione del complemento Agglutinazione Precipitazione ELISA Immunofluorescenza IFA Western blot SIERODIAGNOSI indiretta Per la ricerca delle IgG occorrono campioni appaiati: A 7 gg dalla comparsa dei sintomi IN FASE ACUTA A 1-2 settimane dal primo IN CONVALESCENZA E’ considerato indicativo di infezione un titolo almeno 4 volte maggiore nel secondo campione Per la ricerca delle IgM basta un campione solo. Compaiono nei primi giorni Il picco è dopo 7-10 gg Scompaiono nei mesi successivi. SONO QUINDI INDICATORI DI INFEZIONE ACUTA Ricompaiono durante le infezioni ricorrenti e riacutizzazioni Determinate nel sangue cordale, indicano infezione neonatale SIERODIAGNOSI indiretta Gli anticorpi possono essere chiamati diversamente a seconda del saggio usato per determinarli e della loro funzione : Agglutinanti o opsonizzanti (agglutinine e opsonine) Fissanti il complemento …compaiono più lentamente e spariscono prima.. I test disponibili danno come risultato il titolo delle Ig totali. Poco sensibili. Ig totali – …misurate con RIA o ELISA o IFA. – I test possono determinare anche la classe IgM, IgG, IgA. Test di conferma: Western blot o Immunoblot TEST DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO Originariamente messo a punto da Wassermann per la diagnosi di sifilide. Misura IgG e IgM (ossia gli anticorpi in grado di attivare o fissare il complemento C’) nel siero Vantaggi: stessi reagenti eccetto l’antigene, per tutti i test Svantaggi: componenti labili, stretto margine di condizioni ottimali TEST DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO C’ Antigeni virali batterici EMAZIE INTERE + Sistema rivelatore Ab non specifici + EMAZIE LISATE Sistema rivelatore: un altro complesso antigene anticorpo VISIBILE, cioè globuli rossi con anticorpi anti-globulo rosso (si dicono sensibilizzati) TEST DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO +/- + Reazione di Wassermann Diagnosi sierologica della sifilide; utilizza sia l’antigene lipoideo che l’antigene proteico AGGLUTINAZIONE e PRECIPITAZIONE (metodo indiretto) Reazione antigene-anticorpo applicata a scopo sierodiagnostico per individuare la presenza di agglutinine (anticorpi agglutinanti) nel siero di pazienti. PRECIPITAZIONE (in cui si utilizzano antigeni solubili non legati a cellule) AGGLUTINAZIONE ( in cui sono necessarie cellule nella loro interezza per formare un reticolo dato dall'unione dell'anticorpo a due cellule contigue). * A differenza dell'agglutinazione, la precipitazione è più rapida (15 min.) anche a temperatura ambiente (20-25°C) ma risente in maggior misura del rapporto ottimale antigene-anticorpo, inoltre non si manifesta quando i sieri campione sono diluiti oltre 10-50 volte AGGLUTINAZIONE (metodo indiretto) LA SIEROAGGLUTINAZIONE DI WRIGHT E’ LA RICERCA DI AGGLUTININE NEL SIERO DEL PAZIENTE NEI CONFRONTI DI UNA SOSPENSIONE DI BRUCELLE IN FASE S. SI PREPARANO DILUIZIONI SCALARI DEL SIERO (1:50 a 1:3200) E SI AGGIUNGE UNA OPPORTUNA QUANTITA’ DI SOSPENSIONE ANTIGENE. LA LETTURA SI ESEGUE DOPO 48h A 37°C INDICANDO IL TITOLO SIGNIFICATIVO CIOE’ UN TITOLO SUPERIORE A QUELLO RISCONTRATO NELLA POPOLAZIONE NORMALE (superiore a 1:100) LA REAZIONE DI WIDAL E’ UTILIZZATA PER EVIDENZIARE INFEZIONI SOSTENUTE DA SALMONELLA TYPHI E SALMONELLA PARATYPHI. PREFERIBILMENTE VIENE ESEGUITA UTILIZZANDO SOSPENSIONI SEPARATE DI ANTIGENE O ED H PERCHE’ LA POSITIVITA’ VERSO L’UNO O L’ALTRO DEI DUE ANTIGENI HA UN SIGNIFICATO CLINICO DIFFERENTE AGGLUTINAZIONE FIOCCOSA PER L’ANTIGENE H AGGLUTINAZIONE GRANULARE PER L’ANTIGENE O LA REAZIONE E’ CONSIDERATA POSITIVA SE SUPERIORE AD 1:50 TPHA (reazione di emoagglutinazione indiretta) Agglutinazione indiretta di emazie di pulcino con anticorpi specifici contro le varianti patogene di Treponema pallidum TPHA n° cupule : Notation de l'importan ce de l' Hémagglu tination 1 2 3 4 +++ + - - n° 1 tamp on en µl 2 3 4 5 6 7 8 25 25 25 25 25 25 25 sérum 1/20 en µl 25 25 * * * * * * ** HS en µl 75 75 75 75 75 75 75 75 Diluti on 1 / 80 1 / 160 1 / 320 1 / 640 1 / 1280 1 / 2560 1 / 5120 1 / 1024 0 Lectu re + + + + + - - - Titolo risultante 1 a 1280, diluizione in cui è ancora possibile verificare un’ agglutinazione netta. PRECIPITAZIONE (metodo indiretto) La precipitazione avviene quando l'antigene in soluzione acquosa, viene posto a contatto con l'anticorpo (siero) in presenza di elettroliti (soluzione fisiologica) ad una opportuna temperatura e tempo di incubazione. Il titolo precipitante di un siero è determinato valutando la più piccola quantità di esso che sia in grado di precipitare una quantità standard fissa di antigene. Il grado di attività di un siero è indicato dall'ultima diluizione che consente di evidenziare la reazione. ELISA (metodo indiretto) •E’ una tecnica fra le più usate: Semplice, sensibile, veloce (2 ore alla risposta), economica, reagenti stabili. •Puo’ essere resa quantitativa con una curva di taratura. •CATTURA DI ANTICORPO per diagnosi indiretta A, legato a supporto solido (fondo di piastra o biglia), è antigene virale B è un anticorpo specifico per A (per es: nel siero di un paziente sieropositivo). Antigene virale + siero + Ig-anti human Ig -HPRO + Substrato ELISA indiretto • • Un microrganismo, o antigeni di, è legato al supporto. Si ricerca nel siero l’anticorpo. Nel passaggio successivo si usano Ig anti-Ig umane marcate con perossidasi. Campione: siero Anticorpo marcato con enzima Anticorpo microrganismo ELISA “Elisa indiretto” FASE 1: gli anticorpi specifici presenti nel siero (Ac primario) si legano all’ antigene immobilizzato su fase solida FASE 2: dopo lavaggio viene aggiunto l’ Anticorpo antiimmunoglobulina di specie marcato con perossidasi(Ac secondario). Se sono presenti anticorpi nel siero primario, si forma un complesso antigene- Ac primario- Ac secondario FASE 3: dopo ulteriore lavaggio viene aggiunto il substrato. Si sviluppa una reazione colorimetrica solo in presenza dell’ enzima perossidasi. Se il pozzetto si colora, la reazione è positiva Immunofluorescenza indiretta 1) microrganismo o antigene noto 2) si aggiunge il siero campione contenente eventuali anticorpi diretti contro il microrganismo o antigene noto 3) si lava per allontanare l'eccesso di anticorpo non legato al batterio 4) si aggiunge un anticorpo marcato diretto contro la regione costante della catena pesante degli anticorpi eventualmente presenti nel siero saggiato 5) si lava per allontanare l'eccesso di anticorpo marcato 6) si osserva con il microscopio a fluorescenza *Il metodo indiretto consente di identificare una grande varietà di antigeni utilizzando un sol tipo di anticorpo rivelatore. Infatti quest'ultimo essendo diretto contro la regione costante della catena pesante delle immunoglobuline può essere utilizzato indifferentemente verso qualsiasi anticorpo utilizzato per il riconoscimento dell'antigene. WESTERN BLOT o IMMUNOBLOT Test che misura la PRESENZA di anticorpi nel siero. Non è quantitativo. E’ utilizzato solo come test di conferma a causa del suo costo e/o laboriosità. CONSENTE LA VISUALIZZAZIONE DEI SINGOLI ANTIGENI CONTRO CUI E’ RIVOLTA LA RISPOSTA ANTICORPALE Western blotting Identifica gli antigeni verso cui reagisce un siero L’ identificazione avviene in base al peso molecolare della proteina E’ un test molto sensibile e specifico E’ un test costoso e poco pratico da applicare routinariamente Principio del test L’ antigene (spesso una miscela di antigeni) viene sottoposto ad elettroforesi su gel di poliacrilammide Il gel viene fissato e le diverse frazioni vengono trasferite su matrice solida (membrana di nitrocellulosa) Su tale membrana vengono saggiati i sieri (1 per ogni striscia) Gli anticorpi specifici vengono visualizzati mediante anti-IgG di specie marcate e substrato colorimetrico 1 fase: separazione elettroforetica 1 fase: separazione elettroforetica 1 fase: separazione elettroforetica 1 fase: separazione elettroforetica 2 Fase: trasferimento su membrana 3 fase: preparazione delle strisce di nitrocellulosa 3 Fase: preparazione delle strisce di nitrocellulosa La membrana viene tagliata in strisce verticali Ogni striscia contiene tutto il pool di proteine separate mediante elettroforesi 4 Fase: immunostaining Interpretazione dei risultati Identificazione dei microrganismi 1. esame microscopico diretto del materiale in esame 2. Caratteristiche morfologiche 3. 4. 5. 6. 7. Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen Caratteristiche colturali Caratteristiche biochimiche Tipizzazione fagica Caratteristiche antigeniche (ID sierologica) Antibiogramma VALUTAZIONE IN VITRO DELLE RESISTENZE AGLI ANTIBIOTICI Il test di sensibilità agli antibiotici o agenti antibatterici serve non solo per orientare la terapia antibiotica , ma anche per monitorare l'evoluzione della resistenza batterica e dare quindi le basi del trattamento empirico delle infezioni batteriche. La NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) detta le regole a livello internazionale su come fare i test di sensibilità agli antibiotici (antibiogramma), le classi di antibiotici da testare ecc. In pratica questa analisi viene standardizzata in funzione di fattori quali la purezza del ceppo da testare, la densità dell'inoculo, le condizioni di incubazione, il metodo di lettura del risultato e soprattutto i criteri biologici e clinici per l'interpretazione del risultato. L'importanza dell'antibiogramma si basa sul principio che la sensibilita' in vitro prefigura l'efficacia in vivo della terapia antibiotica . Concentrazione minima inibente (MIC) Quello che andiamo a determinare oggettivamente nel test di sensibilità agli antibiotici è la cosidetta MIC o minima concentrazione inibente (MCI o CIM ). La MIC è definita come la minima concentrazione in un range di diluizione di antibiotico che inibisce la crescita visibile batterica. Purtroppo il clinico non sa interpretare correttamente la MIC e chiede solo se il ceppo è Sensibile o Resistente. Pertanto molti test di laboratorio non misurano la famosa MIC ma una stima della MIC semiquantitativa. Questa stima meno accurata della MIC è data da 2 concentrazioni di antibiotico note come breakpoints che determinano le 3 categorie piu' conosciute dal clinico che sono S,I,R. La scelta di queste 2 concentrazioni è data dal NCCLS che usa criteri batteriologici, farmacocinetici e clinici. Concentrazione minima inibente (MIC) Questi criteri vengono aggiornati di anno in anno. La definizione di queste 3 categorie secondo il NCCLS è la seguente: Sensibile S: la categoria sensibile significa che l'infezione causata dal ceppo presuntivamente responsabile di quella infezione, isolato dal materiale patologico e la cui importanza è valutata sia dal microbiologo che dal clinico, puo' essere trattata con quell'antibiotico al dosaggio usuale raccomandato e che troviamo nei foglietti illustrativi che accompagnano per legge il farmaco. Concentrazione minima inibente (MIC) Intermedio I: La categoria Intermedia significa che la infezione causata dal ceppo presuntivamente responsabile di quella infezione, isolato dal materiale patologico e la cui importanza è valutata sia dal microbiologo che dal clinico,puo' essere trattata con quell'antibiotico a un dosaggio leggermente piu' alto di quello usuale. Resistente,R: I ceppi resistenti sono quelli non inibiti dalle concentrazioni sistemiche dell'antibiotico ai dosaggi normali e anche a quelli piu' alti. I dati dell'antibiogramma dovrebbero essere analizzati in termini di MIC, quindi di differenze fra MIC e di livelli sierici raggiungibili. Infatti 2 antibiotici di uguale efficacia (cioè entrambi Sensibili) possono avere MIC e livelli sierici diversi: va scelto quello con MIC piu' bassa ma anche con livelli sierici migliori perchè cosi' è possibile somministrarlo a dosaggi piu' bassi ossia meno frequentemente migliorando la compliance del paziente, ma anche il rapporto costo-effetto Il Vitek è un apparecchio automatico per l'identificazione e l'antibiogramma. Ha una temperatura nell'incubatore delle cards di 35°C +- 0.4 e non a 37°C perchè solo a 35°C si esprime la meticillino resistenza. L'incubazione deve essere prolungata per almeno 24 ore. Il MicroScan della Dade Behring è un apparecchio per l'identificazione e il test di sensibilità approvato dalla NCCLS in quanto ne segue strettamente le raccomandazioni. Il Vitek è stato approvato dalla NCCLS solo per l'identificazione, mentre è approvato per i test di sensibilità da altri organismi internazionali. Tecnica della diluizione La tecnica della diluizione in brodo determina accuratamente la MIC. Si parte da un inoculo batterico di 100,000 organismi/ml in brodo nutritivo che vengono posti in una serie di provette o pozzetti che contengono diverse concentrazioni di antibiotico. -Dopo incubazione di 18-24 ore otteniamo dei risultati che devono essere interpretati. - minima concentrazione inibente (MIC) è 3.1 ug/ml - minima concentrazione battericida (MBC) è 6.2 ug/ml Ricordiamo che la MIC in quanto indica una inibizione della crescita non indica che il batterio a quella concentrazione venga ucciso (sebbene in pratica una lunga inibizione della crescita conduca alla eliminazione del batterio attraverso le difese immunitarie nell'ospite normale). - MBC è normalmente superiore alla MIC. Dato che comporta la semina del brodo su agar , il test ha delle limitazioni per il tempo che si perde e i costi. E' richiesto per il trattamento di affezioni molto difficili da eradicare quali l'endocardite e l'osteomielite. Tecnica della diffusione (Kirby-Bauer) I test di diffusione sono semplici ed economici. In questi test un inoculo standardizzato del microrganismo da saggiare viene seminato sulla superficie di una piastra di agar su cui successivamente si pongono dei dischetti di carta assorbente contenenti quantità standardizzate dei vari farmaci antimicrobici da saggiare. La zona di inibizione che si ottiene con il test di diffusione è correlata in maniera inversa alla MIC il metodo di Kirby Bauer o della diffusione dai dischetti , parte da una certa densità di inoculo che viene piastrato su agar Mueller-Hinton. La standardizzazione evita gli errori di inaccuratezza: un inoculo ad alta densità di partenza corrisponde ad aloni di inibizione più piccoli e quindi a false resistenze. L'inoculo andrebbe sospeso in brodo Muller-Hinton a una densità di 0,5 MC Farland. La piastra va prima posta a temperatura ambiente e dopo fatto lo spatolamento si lascia asciugare l'inoculo. I dischetti hanno un diametro standard di 6 mm. La distanza dal bordo della piastra deve essere di almeno 15 mm, mentre la distanza tra i dischetti deve essere di 20 mm. Si incuba a 35°C. Le piastre vanno rovesciate a evitare la condensa. Tecnica della diffusione (Kirby-Bauer) L'E test o epsilon test dalla forma dell'alone di inibizione, è un metodo quantitativo che determina la MIC. Una striscia di plastica impregnata da un gradiente calibrato di antibiotico è posto su una piastra dove è stato posto un inoculo standard del batterio isolato. La MIC è facilmente letta lunga la striscia laddove le colonie intersecano la striscia. In questa immagine , le colonie attraversano la striscia a un valore di 0,94 μg/ml.. Spesso si notano colonie isolate all'interno dell'alone di inibizione. Possono essere o mutanti resistenti o colonie estranee dovute a coltura mista. Una piastra incubata in CO2 fa diminuire l'attività dei macrolidi e degli aminoglicosidi, mentre fa aumentare l'attività dei beta lattamici e delle tetracicline. Gli aloni di inibizione correlano approssimativamente con le MIC. Diametri di inibizione superiore a un certo valore indicano sensibilità, diametri inferiori resistenza e fra questi due valori si definisce il ceppo a sensibilità intermedia. Sia nel test di Kirby Bauer che nelle diluizioni in brodo di apparecchi automatici si usano 2 valori limite o di cut off detti break-points che sono stabiliti dalla NCCLS. In genere si saggiano centinaia di ceppi batterici e si calcola la MIC 90 , cioè la MIC che inibisce la crescita del 90% dei ceppi e questo valore è il breakpoint 2. La MIC 60% stabilisce grosso modo il break point piu' basso. Quando il ceppo è inibito al BP piu' basso è Sensibile, se è inibito solo al BP piu' alto è Intermedio, se è inibito alle 2 concentrazioni è Resistente. Anche il siero del paziente che sta assumendo antibiotici può essere saggiato. Il sangue è prelevato al picco dell'antibiotico utilizzato, quindi il siero è diluito in brodo e testato contro l'isolato microbico. Questo test è raramente effettuato e solo per i casi di endocardite , osteomielite o sepsi nel paziente immunocompromesso. Il ceppo isolato viene conservato e si cimenta con il siero diluito. Si registrano le provette limpide che si seminano su piastra. Si vede se c‘è stato killing o solo inibizione
