Identificazione dei microrganismi
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
esame microscopico diretto del materiale in
esame
Caratteristiche morfologiche
Colorazione di Gram
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Caratteristiche colturali
Caratteristiche biochimiche
Tipizzazione fagica
Caratteristiche antigeniche (Diagnosi sierologica)
Antibiogramma
Paziente (sospetta
malattia infettiva)
Via immunologica
Prelievo di sangue
Via microbiologica
Sangue
Feci
Urine
Biopsia
Ricerca di
anticorpi
contro il
sospetto
patogeno
Prove sierologiche
(RIA, ELISA)
Microbiologia tradizionale
Coltura in un
terreno selettivo
Microbiologia innovativa
Immunologia
(ricerca del patogeno:
batteri o virus)
Immunofluorescenza
ELISA
Isolamento
Identificazione
Prove selettive
Identificazione
immunologica
Sensibilità agli antibiotici
(decisione sulla
chemioterapia)
Biologia molecolare
(ricerca del genoma del
patogeno)
DNA-probes
PCR
Diagnosi sierologica di infezione batterica
DIRETTA:
ricerca di proteine o altri componenti (=antigeni) del microrganismo
A tale scopo devono essere disponibili sieri iperimmuni o anticorpi
monoclonali che reagiscono specificamente solo con il patogeno che si ricerca.
La disponibilità di sieri iperimmuni e di anticorpi monoclonali, specifici per i vari
antigeni presenti sul corpo batterico (antigeni dei flagelli H, dei pili F, delle
strutture pilo- simili K/F, della capsula K, della parete cellulare O), permette di
eseguire prove immunologiche specifiche adatte a identificare con precisione
un microrganismo.
INDIRETTA:
ricerca di anticorpi specifici per il batterio d’interesse
Metodi diretti
Identificazione con sieri iperimmuni o anticorpi
Agglutinazione
ELISA
Immunofluorescenza IFA
monoclonali
Metodi indiretti
Fissazione del complemento
Agglutinazione
Precipitazione
ELISA
Immunofluorescenza IFA
Western blot
Scelta del metodo diagnostico
DIAGNOSI DIRETTA: maggiore specificità ma…
DIAGNOSI INDIRETTA: generalmente meno costosa, e più accessibile
La scelta dipende da:
•FASE DELLA MALATTIA
•Il batterio o gli anticorpi devono essere presenti nel campione da analizzare
•CARATTERISTICHE del batterio
•Il batterio, se si sceglie il metodo diretto, deve essere coltivabile (isolam) o in
grande quantità (ELISA)
•VALORE DIAGNOSTICO DI UN EVENTUALE TITOLO ANTICORPALE
•Gli Ac devono, se presenti, voler dire qualcosa…
•TIPO DI TEST
•Screening, test su caso sospetto e conferma?
CAMPIONI CLINICI per la diagnosi diretta
CAMPIONI MONOMICROBICI
DAL SANGUE
Plasma
Frazione liquida del sangue non coagulato.
importante l’anticoagulante
Siero
Frazione liquida del sangue coagulato
LIQUOR CEFALORACHIDIANO
Usare tale e quale
CAMPIONI CLINICI per la diagnosi diretta
CAMPIONI POLIMICROBICI: di solito vanno trattati
TAMPONI immersi in liquido di trasporto
(PBS, 20% FCS o BSA, antibiotici,
antimicotici)
URINA
diluita 1:2 in VIB
Filtrata, centrif a 15000
Semina del pellet
FECI
Diluite 1:5 o 10 in VIB.
Centrif a bassa velocità.
Supernatante centrif a alta velocità.
Semina del pellet (cloroformio)
BRONCOLAVAGGI
GARGARIZZATI
BIOPSIE
diluiti, rimosso muco.
Tenute le cellule
omogenate in VIB, centrif.
Diagnosi diretta
Nella diagnosi diretta, la sierologia è deputata al
riconoscimento del germe.
Si acquistano già pronti anticorpi di origine animale, marcati
diversamente a seconda del loro uso.
Molto usati sono gli
ANTICORPI MONOCLONALI.
AGGLUTINAZIONE
(metodo diretto)
L'agglutinazione permette di individuare anche antigeni
solubili multivalenti (antigeni capsulari) avvalendosi di matrici
inerti al lattice ( di forma generalmente sferica) coniugate
con immunoglobuline specifiche note sensibilizzate (le
immunoglobuline sono legate sulla superficie delle sfere)
dirette contro un certo antigene. L'agglutinazione si
visualizza con formazione di granuli sul fondo della provetta o
su particolari cartoncini a fondo scuro.
Una colonia del batterio in esame viene stemperata in una
goccia di antisiero o di anticorpo monoclonale, specifico per
il batterio sospettato (Salmonella, Brucella) posta su vetrino:
se l'anticorpo riconosce il microrganismo reagisce con i corpi
batterici, causando, entro pochi minuti, la loro agglutinazione
visibile ad occhio nudo.
Le reazioni di agglutinazione su vetrino possono essere rese
più evidenti impiegando anticorpi preventivamente coniugati
con particelle di lattice; in tal modo l'agglutinazione può
essere osservata agevolmente a occhio nudo anche quando gli
anticorpi reagiscono con specifiche strutture antigeniche poco
rappresentate nel corpo batterico.
L'agglutinazione con anticorpi coniugati a particelle di
lattice viene impiegata con successo per la diagnosi rapida di
Staphylococcus aureus, Streptococchi patogeni, Neisseria
gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Cryptococcus
neoformans, Candida albicans.
A
A g
gA
g
A
g A
g
Ab
REAZIONI ANTIGENE-ANTICORPO
ELISA (ENZYME LINKED IMMUNOASSORBENT
(metodo diretto)
ASSAY)
•E’ una tecnica fra le più usate: Semplice, sensibile, veloce (2 ore
alla risposta), economica, reagenti stabili.
•Puo’ essere resa quantitativa con una curva di taratura.
Campione
Es: feci,urina etc
microrganismo
Anticorpo che “cattura”
Perossidasi o Fosfatasi alcalina
Anticorpo
marcato
con enzima
“ELISA diretto” per la ricerca di antigeni nei campioni
biologici
FASE 1: L’ anticorpo di cattura immobilizzato su fase
solida lega l’ antigene se questo è presente nel campione
FASE 2: dopo lavaggio viene aggiunto il secondo anticorpo
che lega l’ antigene solo se questo è stato
precedentemente legato
FASE 3: dopo ulteriore lavaggio viene aggiunto il substrato. Si
sviluppa una reazione colorimetrica solo in presenza dell’ enzima
perossidasi. Se il pozzetto si colora, la reazione è positiva
FASE 4: Si blocca la reazione e si effettua la lettura fotometrica
IMMUNOFLUORESCENZA (metodo diretto)
E’ una delle tecniche più sensibili (fino a 1000 molecole antigeniche se localizzate).
Serve per rilevare antigeni (si adoperano anticorpi noti) anche a localizzazione intracellulare
(Chlamidia, Rickettsiae).
Permette di:
•visualizzare la localizzazione di un antigene (citoplasmatica, di membrana, nucleare).
•determinare più antigeni o marcatori sulla stessa cellula, utilizzando fluorocromi diversi
Immunofluorescenza diretta
Immunofluorescenza diretta
Immunofluorescenza diretta
Immunofluorescenza diretta
Metodi indiretti
Fissazione del complemento
Agglutinazione
Precipitazione
ELISA
Immunofluorescenza IFA
Western blot
SIERODIAGNOSI indiretta
Per la ricerca delle IgG occorrono campioni appaiati:
A 7 gg dalla comparsa dei sintomi IN FASE ACUTA
A 1-2 settimane dal primo
IN CONVALESCENZA
E’ considerato indicativo di infezione un titolo almeno 4 volte maggiore
nel secondo campione
Per la ricerca delle IgM basta un campione solo.
Compaiono nei primi giorni
Il picco è dopo 7-10 gg
Scompaiono nei mesi successivi. SONO QUINDI INDICATORI DI
INFEZIONE ACUTA
Ricompaiono durante le infezioni ricorrenti e riacutizzazioni
Determinate nel sangue cordale, indicano infezione neonatale
SIERODIAGNOSI indiretta
Gli anticorpi possono essere chiamati diversamente a seconda del saggio
usato per determinarli e della loro funzione :
Agglutinanti o opsonizzanti (agglutinine e opsonine)
Fissanti il complemento …compaiono più lentamente e spariscono prima..
I test disponibili danno come risultato il titolo
delle Ig totali.
Poco sensibili.
Ig totali
– …misurate con RIA o ELISA o IFA.
– I test possono determinare anche la classe IgM, IgG,
IgA.
Test di conferma: Western blot o Immunoblot
TEST DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO
Originariamente messo a punto da Wassermann per la diagnosi di sifilide.
Misura IgG e IgM (ossia gli anticorpi in grado di attivare o fissare il complemento
C’) nel siero
Vantaggi: stessi reagenti eccetto
l’antigene, per tutti i test
Svantaggi: componenti labili,
stretto margine di condizioni
ottimali
TEST DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO
C’
Antigeni
virali
batterici
EMAZIE
INTERE
+
Sistema
rivelatore
Ab non
specifici
+
EMAZIE
LISATE
Sistema rivelatore: un altro complesso antigene anticorpo VISIBILE, cioè
globuli rossi con anticorpi anti-globulo rosso (si dicono sensibilizzati)
TEST DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO
+/-
+
Reazione di Wassermann
Diagnosi sierologica della sifilide; utilizza sia l’antigene
lipoideo che l’antigene proteico
AGGLUTINAZIONE e PRECIPITAZIONE (metodo
indiretto)
Reazione
antigene-anticorpo
applicata a
scopo
sierodiagnostico
per individuare la presenza di
agglutinine (anticorpi agglutinanti) nel siero di pazienti.
PRECIPITAZIONE (in cui si utilizzano antigeni solubili non legati a cellule)
AGGLUTINAZIONE ( in cui sono necessarie cellule nella loro interezza per formare
un reticolo dato dall'unione dell'anticorpo a due cellule contigue).
* A differenza dell'agglutinazione, la precipitazione è più rapida (15 min.) anche a
temperatura ambiente (20-25°C) ma risente in maggior misura del rapporto ottimale
antigene-anticorpo, inoltre non si manifesta quando i sieri campione sono diluiti oltre
10-50 volte
AGGLUTINAZIONE (metodo indiretto)
LA SIEROAGGLUTINAZIONE DI WRIGHT E’ LA RICERCA DI AGGLUTININE NEL
SIERO DEL PAZIENTE NEI CONFRONTI DI UNA SOSPENSIONE DI BRUCELLE IN
FASE S. SI PREPARANO DILUIZIONI SCALARI DEL SIERO (1:50 a 1:3200) E SI
AGGIUNGE UNA OPPORTUNA QUANTITA’ DI SOSPENSIONE ANTIGENE. LA LETTURA
SI ESEGUE DOPO 48h A 37°C INDICANDO IL TITOLO SIGNIFICATIVO CIOE’ UN
TITOLO SUPERIORE A QUELLO RISCONTRATO NELLA POPOLAZIONE NORMALE
(superiore a 1:100)
LA REAZIONE DI WIDAL E’ UTILIZZATA PER EVIDENZIARE INFEZIONI
SOSTENUTE DA SALMONELLA TYPHI E SALMONELLA PARATYPHI.
PREFERIBILMENTE VIENE ESEGUITA UTILIZZANDO SOSPENSIONI SEPARATE DI
ANTIGENE O ED H PERCHE’ LA POSITIVITA’ VERSO L’UNO O L’ALTRO DEI DUE
ANTIGENI HA UN SIGNIFICATO CLINICO DIFFERENTE
AGGLUTINAZIONE FIOCCOSA PER L’ANTIGENE H AGGLUTINAZIONE GRANULARE
PER L’ANTIGENE O LA REAZIONE E’ CONSIDERATA POSITIVA SE SUPERIORE AD 1:50
TPHA (reazione di emoagglutinazione indiretta)
Agglutinazione indiretta di emazie
di pulcino con anticorpi specifici
contro le varianti patogene di
Treponema pallidum
TPHA
n° cupule
:
Notation
de
l'importan
ce de l'
Hémagglu
tination
1
2
3
4
+++
+
-
-
n°
1
tamp
on
en µl
2
3
4
5
6
7
8
25
25
25
25
25
25
25
sérum
1/20
en µl
25
25 *
*
*
*
*
*
**
HS
en µl
75
75
75
75
75
75
75
75
Diluti
on
1 /
80
1 /
160
1 /
320
1 /
640
1 /
1280
1 /
2560
1 /
5120
1 /
1024
0
Lectu
re
+
+
+
+
+
-
-
-
Titolo risultante 1 a 1280, diluizione in cui è ancora possibile verificare un’ agglutinazione netta.
PRECIPITAZIONE (metodo indiretto)
La precipitazione avviene quando l'antigene in soluzione
acquosa, viene posto a contatto con l'anticorpo (siero) in
presenza di elettroliti (soluzione fisiologica) ad una
opportuna temperatura e tempo di incubazione.
Il titolo precipitante di un siero è
determinato valutando la più piccola
quantità di esso che sia in grado di
precipitare una quantità standard
fissa di antigene. Il grado di attività
di un siero è indicato dall'ultima
diluizione che consente di evidenziare
la reazione.
ELISA (metodo indiretto)
•E’ una tecnica fra le più usate: Semplice, sensibile, veloce (2 ore
alla risposta), economica, reagenti stabili.
•Puo’ essere resa quantitativa con una curva di taratura.
•CATTURA DI ANTICORPO per diagnosi indiretta
A, legato a supporto solido (fondo di piastra o biglia), è antigene virale
B è un anticorpo specifico per A (per es: nel siero di un paziente
sieropositivo).
Antigene
virale
+ siero
+
Ig-anti human Ig
-HPRO
+ Substrato
ELISA indiretto
•
•
Un microrganismo, o antigeni di, è legato al supporto. Si ricerca nel siero l’anticorpo.
Nel passaggio successivo si usano Ig anti-Ig umane marcate con perossidasi.
Campione: siero
Anticorpo
marcato
con enzima
Anticorpo
microrganismo
ELISA
“Elisa indiretto”
FASE 1: gli anticorpi specifici presenti nel siero (Ac
primario) si legano all’ antigene immobilizzato su fase
solida
FASE 2: dopo lavaggio viene aggiunto l’ Anticorpo antiimmunoglobulina di specie marcato con perossidasi(Ac secondario).
Se sono presenti anticorpi nel siero primario, si forma un complesso
antigene- Ac primario- Ac secondario
FASE 3: dopo ulteriore lavaggio viene aggiunto il substrato. Si
sviluppa una reazione colorimetrica solo in presenza dell’ enzima
perossidasi. Se il pozzetto si colora, la reazione è positiva
Immunofluorescenza indiretta
1) microrganismo o antigene noto
2) si aggiunge il siero campione contenente eventuali anticorpi diretti
contro il microrganismo o antigene noto
3) si lava per allontanare l'eccesso di anticorpo non legato al batterio
4) si aggiunge un anticorpo marcato diretto contro la regione costante
della catena pesante degli anticorpi eventualmente presenti nel siero
saggiato
5) si lava per allontanare l'eccesso di anticorpo marcato
6) si osserva con il microscopio a fluorescenza
*Il metodo indiretto consente di identificare una grande varietà di antigeni
utilizzando un sol tipo di anticorpo rivelatore. Infatti quest'ultimo essendo
diretto contro la regione costante della catena pesante delle immunoglobuline
può essere utilizzato indifferentemente verso qualsiasi anticorpo utilizzato per
il riconoscimento dell'antigene.
WESTERN BLOT o IMMUNOBLOT
Test che misura la PRESENZA di anticorpi nel siero.
Non è quantitativo.
E’ utilizzato solo come test di conferma a causa del
suo costo e/o laboriosità.
CONSENTE LA VISUALIZZAZIONE DEI SINGOLI
ANTIGENI CONTRO CUI E’ RIVOLTA LA
RISPOSTA ANTICORPALE
Western blotting
Identifica gli antigeni verso cui reagisce
un siero
L’ identificazione avviene in base al
peso molecolare della proteina
E’ un test molto sensibile e specifico
E’ un test costoso e poco pratico da
applicare routinariamente
Principio del test
L’ antigene (spesso una miscela di antigeni) viene
sottoposto ad elettroforesi su gel di poliacrilammide
Il gel viene fissato e le diverse frazioni vengono
trasferite su matrice solida (membrana di
nitrocellulosa)
Su tale membrana vengono saggiati i sieri (1 per ogni
striscia)
Gli anticorpi specifici vengono visualizzati mediante
anti-IgG di specie marcate e substrato colorimetrico
1 fase: separazione elettroforetica
1 fase: separazione elettroforetica
1 fase: separazione elettroforetica
1 fase: separazione elettroforetica
2 Fase: trasferimento su membrana
3 fase: preparazione delle strisce di
nitrocellulosa
3 Fase: preparazione delle strisce di
nitrocellulosa
La membrana viene tagliata in strisce verticali
Ogni striscia contiene tutto il pool di proteine
separate mediante elettroforesi
4 Fase: immunostaining
Interpretazione dei risultati
Identificazione dei microrganismi
1.
esame microscopico diretto del materiale in
esame
2. Caratteristiche morfologiche
3.
4.
5.
6.
7.
Colorazione di Gram
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Caratteristiche colturali
Caratteristiche biochimiche
Tipizzazione fagica
Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)
Antibiogramma
VALUTAZIONE IN VITRO DELLE RESISTENZE
AGLI ANTIBIOTICI
Il test di sensibilità agli antibiotici o agenti antibatterici
serve non solo per orientare la terapia antibiotica , ma anche
per monitorare l'evoluzione della resistenza batterica e dare
quindi le basi del trattamento empirico delle infezioni
batteriche. La NCCLS (National Committee for Clinical
Laboratory Standards) detta le regole a livello internazionale
su come fare i test di sensibilità agli antibiotici
(antibiogramma), le classi di antibiotici da testare ecc. In
pratica questa analisi viene standardizzata in funzione di
fattori quali la purezza del ceppo da testare, la densità
dell'inoculo, le condizioni di incubazione, il metodo di lettura
del risultato e soprattutto i criteri biologici e clinici per
l'interpretazione del risultato.
L'importanza dell'antibiogramma si basa sul
principio che la sensibilita' in vitro prefigura
l'efficacia in vivo della terapia antibiotica .
Concentrazione minima inibente (MIC)
Quello che andiamo a determinare oggettivamente nel test di
sensibilità agli antibiotici è la cosidetta MIC o minima
concentrazione inibente (MCI o CIM ). La MIC è definita
come la minima concentrazione in un range di diluizione di
antibiotico che inibisce la crescita visibile batterica.
Purtroppo il clinico non sa interpretare correttamente la
MIC e chiede solo se il ceppo è Sensibile o Resistente.
Pertanto molti test di laboratorio non misurano la famosa
MIC ma una stima della MIC semiquantitativa. Questa stima
meno accurata della MIC è data da 2 concentrazioni di
antibiotico note come breakpoints che determinano le 3
categorie piu' conosciute dal clinico che sono S,I,R. La scelta
di queste 2 concentrazioni è data dal NCCLS che usa criteri
batteriologici, farmacocinetici e clinici.
Concentrazione minima inibente (MIC)
Questi criteri vengono aggiornati di anno in anno. La definizione
di queste 3 categorie secondo il NCCLS è la seguente:
Sensibile S: la categoria sensibile significa che l'infezione
causata dal ceppo presuntivamente responsabile di quella
infezione, isolato dal materiale patologico e la cui importanza è
valutata sia dal microbiologo che dal clinico, puo' essere
trattata con quell'antibiotico al dosaggio usuale raccomandato e
che troviamo nei foglietti illustrativi che accompagnano per
legge il farmaco.
Concentrazione minima inibente (MIC)
Intermedio I: La categoria Intermedia significa che la
infezione causata dal ceppo
presuntivamente responsabile di quella infezione,
isolato dal materiale patologico e la cui importanza è
valutata sia dal microbiologo che dal clinico,puo' essere
trattata con quell'antibiotico a un dosaggio leggermente
piu' alto di quello usuale.
Resistente,R: I ceppi resistenti sono quelli non inibiti
dalle concentrazioni sistemiche dell'antibiotico ai
dosaggi normali e anche a quelli piu' alti.
I dati dell'antibiogramma dovrebbero essere analizzati in
termini di MIC, quindi di differenze fra MIC e di livelli sierici
raggiungibili. Infatti 2 antibiotici di uguale efficacia (cioè
entrambi Sensibili) possono avere MIC e livelli sierici diversi:
va scelto quello con MIC piu' bassa ma anche con livelli sierici
migliori perchè cosi' è possibile somministrarlo a dosaggi piu'
bassi ossia meno frequentemente migliorando la compliance
del paziente, ma anche il rapporto costo-effetto
Il Vitek è un apparecchio automatico per l'identificazione e
l'antibiogramma. Ha una temperatura nell'incubatore delle
cards di 35°C +- 0.4 e non a 37°C perchè solo a 35°C si esprime
la meticillino resistenza. L'incubazione deve essere prolungata
per almeno 24 ore.
Il MicroScan della Dade Behring è un apparecchio per
l'identificazione e il test di sensibilità approvato dalla NCCLS
in quanto ne segue strettamente le raccomandazioni. Il Vitek è
stato approvato dalla NCCLS solo per l'identificazione, mentre
è approvato per i test di sensibilità da altri organismi
internazionali.
Tecnica della diluizione
La tecnica della diluizione in brodo determina accuratamente
la MIC. Si parte da un inoculo batterico di 100,000
organismi/ml in brodo nutritivo che vengono posti in una
serie di provette o pozzetti che contengono diverse
concentrazioni di antibiotico.
-Dopo incubazione di 18-24 ore otteniamo dei risultati che
devono essere interpretati.
- minima concentrazione inibente (MIC) è 3.1 ug/ml
- minima concentrazione battericida (MBC) è 6.2 ug/ml
Ricordiamo che la MIC in quanto indica una inibizione della
crescita non indica che il batterio a quella concentrazione
venga ucciso (sebbene in pratica una lunga inibizione della
crescita conduca alla eliminazione del batterio attraverso le
difese immunitarie nell'ospite normale).
- MBC è normalmente superiore alla MIC. Dato che
comporta la semina del brodo su agar , il test ha delle
limitazioni per il tempo che si perde e i costi. E' richiesto
per il trattamento di affezioni molto difficili da eradicare
quali l'endocardite e l'osteomielite.
Tecnica della diffusione (Kirby-Bauer)
I test di diffusione sono semplici ed economici.
In questi test un inoculo standardizzato del
microrganismo da saggiare viene seminato sulla
superficie di una piastra di agar su cui
successivamente si pongono dei dischetti di
carta assorbente contenenti quantità
standardizzate dei vari farmaci antimicrobici
da saggiare.
La zona di inibizione che si ottiene con il test di
diffusione è correlata in maniera inversa alla
MIC
il metodo di Kirby Bauer o della diffusione dai dischetti , parte
da una certa densità di inoculo che viene piastrato su agar
Mueller-Hinton. La standardizzazione evita gli errori di
inaccuratezza:
un inoculo ad alta densità di partenza corrisponde ad aloni di
inibizione più piccoli e quindi a false resistenze. L'inoculo
andrebbe sospeso in brodo Muller-Hinton a una densità di 0,5
MC Farland.
La piastra va prima posta a temperatura ambiente e dopo fatto
lo spatolamento si lascia asciugare l'inoculo.
I dischetti hanno un diametro standard di 6 mm. La distanza
dal bordo della piastra deve essere di almeno 15 mm, mentre la
distanza tra i dischetti deve essere di 20 mm.
Si incuba a 35°C. Le piastre vanno rovesciate a evitare la
condensa.
Tecnica della diffusione (Kirby-Bauer)
L'E test o epsilon test dalla forma dell'alone di inibizione, è un
metodo quantitativo che determina la MIC. Una striscia di
plastica impregnata da un gradiente calibrato di antibiotico è
posto su una piastra dove è stato posto un inoculo standard del
batterio isolato. La MIC è facilmente letta lunga la striscia
laddove le colonie intersecano la striscia. In questa immagine , le
colonie attraversano la striscia a un valore di 0,94 μg/ml..
Spesso si notano colonie isolate all'interno dell'alone di
inibizione. Possono essere o mutanti resistenti o colonie
estranee dovute a coltura mista.
Una piastra incubata in CO2 fa diminuire l'attività dei
macrolidi e degli aminoglicosidi, mentre fa aumentare
l'attività dei beta lattamici e delle tetracicline.
Gli aloni di inibizione correlano approssimativamente con
le MIC. Diametri di inibizione superiore a un certo valore
indicano sensibilità, diametri inferiori resistenza e fra
questi due valori si definisce il ceppo a sensibilità
intermedia.
Sia nel test di Kirby Bauer che nelle diluizioni in brodo di
apparecchi automatici si usano 2 valori limite o di cut off detti
break-points che sono stabiliti dalla NCCLS. In genere si
saggiano centinaia di ceppi batterici e si calcola la MIC 90 , cioè
la MIC che inibisce la crescita del 90% dei ceppi e questo valore
è il breakpoint 2. La MIC 60% stabilisce grosso modo il break
point piu' basso.
Quando il ceppo è inibito al BP piu' basso è Sensibile, se è inibito
solo al BP piu' alto è Intermedio, se è inibito alle 2
concentrazioni è Resistente.
Anche il siero del paziente che sta assumendo antibiotici può
essere saggiato. Il sangue è prelevato al picco dell'antibiotico
utilizzato, quindi il siero è diluito in brodo e testato contro
l'isolato microbico. Questo test è raramente effettuato e solo
per i casi di endocardite , osteomielite o sepsi nel paziente
immunocompromesso. Il ceppo isolato viene conservato e si
cimenta con il siero diluito. Si registrano le provette limpide
che si seminano su piastra. Si vede se c‘è stato killing o solo
inibizione
