OLIGOSACCARIDI IN GLICOPROTEINE
Una delle più importanti modificazioni post-traslazionali è la
glicosilazione che consiste nella formazione del legame di
monosaccaridi o oligosaccaridi ad una proteina attraverso un
legame glicosidico.
Ad esempio l’80% delle proteine del plasma sono glicosilate.
La complessità della glicosilazione proviene anche dal fatto che
non è sotto diretto controllo genetico, ma è controllata dalla
presenza di numerosi enzimi «glicosiltrasferasi», monosaccaridi
e loro precursori.
Mono ed oligosaccaridi possono essere collocati diverse posizioni
nella struttura primaria delle proteine, ma solo su specifici
amminoacidi. I più comuni sono asparagina, treonina e serina.
I legami degli oligosaccaridi con la catena peptidica sono definiti:
N-glicosidici quando si tratta di asparagina
O-glicosidici quando si tratta di treonina e serina
Legame N-glicosidico
Legame O-glicosidico
Solo alcuni monosaccaridi sono coinvolti nei legami N- ed Oglicosidici:
N-glicosidici: N-acetilglucosammina
O-glicosidici: N-acetilgalattosammina, galattosio, mannosio, xilosio, e
L-arabinosio
N-linked oligosaccaridi.
Negli oligosaccaridi legati ad Asn, la catena laterale ammidica
dell’asparagina è legata ad un residuo di N-acetil glucosammina,
ma è necessaria una particolare sequenza amminoacidica dopo il
residuo Asn: -Asn-X-Ser/Thr-,
La presenza del residuo di Ser/Thr nella terza posizione è
essenziale per il legame dello zucchero: la formazione di un
legame idrogeno tra il gruppo carbonilico della catena laterale di
Asn ed il gruppo ossidrile di Ser/Thr diminuisce la costante di
dissociazione del gruppo ammidico e quindi facilita il legame con il
residuo saccaridico.
In funzione della composizione delle ramificazioni 1→3 ed
1→6, gli oligosaccaridi legati ad un residuo di Asn sono
classificati in tre gruppi: a) complesso, b) ibrido e c) ricco
in mannosio.
O-linked oligosaccaridi
Oligosaccaridi legati ad una proteina attraverso un legame Oglicosidico sono chiamati O-glicani.
Non è richiesta una specifica sequenza di amminoacidi, sebbene
residui di serina o treonina che formano cluster o sono vicini ad una
prolina hanno tendenza più alta a dare legami O-glicosidici.
O-glicani sono presenti nei gruppi sanguigni.
Dal 1901 sono stati scoperti più di 200 gruppi sanguigni (antigeni).
Alcuni di questi antigeni sono proteina-dipendenti (MNSs., RH,
Duffy, Kell, ecc.) altri sono carboidrati-dipendenti. (ABO, Lewis, Ii,
P, T, Th, Tn, ecc.). Questi antigeni sono portati sia da glicoproteine
che da glicolipidi e sono anche presenti in tessuti e superfici
cellulari diverse dai globuli rossi.
Struttura
di
una
proteina
modificata con glicosilazione.
Le catene oligosaccaridiche sono
rappresentate con atomi a “spazio
pieno” e la catena polipeptidica con
un nastro arancione.
Il residuo Asn è in azzurro.
Le due sequenze oligosaccaridiche
iniziano con due residui di Nacetilglucosammina ciascuna (in
giallo) ed hanno altri tipi di residui
saccaridici (in violetto).
gC è una glicoproteina virale espressa sulla superficie. Può
legare proteine del sistema immunitario per proteggere il
virus dalla loro azione.
Lysophospholipid Binding Protein:
Gioca un ruolo complementare con l’Albumina per
eliminare la lisofosfaditilcolina
Capacità informazionale di un codice a base di carboidrati
Tenendo presente il codice proteico ed il codice genetico,
consideriamo un codice basato sui carboidrati per vedere che tipo
e quantità di informazione può contenere.
I carboidrati contengono un potenziale di informazione, anche in
sequenze corte, molti ordini di grandezza superiore a quello di
altri biopolimeri.
Ragioni:
-
composizione
possibilità di più di una posizione di legame
anomeria
ramificazioni
Questa capacità è sfruttata nei processi di riconoscimento
cellulare o riconoscimento molecolare (recettori, lectine,
anticorpi, apteni)
Elementi che definiscono la struttura di un polisaccaride
1) Composizione
2) Sequenza
3) Tipo di concatenamento
4) Anomeria ( o )
Caratteristiche di una sequenza saccaridica riconosciuta da una proteina:
- lunghezza fino a 6 unità saccaridiche (spesso 1-4)
- identità dei monosaccaridi: epimeri
- configurazione anomerica ( o )
- sequenza lineare (struttura primaria)
- dimensioni dell’anello (furanosidico o piranosidico)
- posizione del legame sull’anello
- schema di ramificazione
- gruppi sostituenti non-saccaridici
- fosfato, fosfonato
- solfato, solfonato
- alchile, acile, acetale, altri
Versante delle proteine
proprietà rilevanti del sito di legame:
- numero di unità monosaccaridiche che entrano nel
sito
- struttura tridimensionale dell’oligosaccaride
- dettagli di ogni unità saccaridica (legame, anomeria,
dimesioni d’anello)
- possibilità di accettare strutture diverse
(specificità)
Quanti tipi di composti saccaridici a basso peso possono
incontrare le proteine con attività di legame verso i
saccaridi?
Proviamo ad effettuare un calcolo semplice
Consideriamo un trisaccaride composto da uno dei più comuni 20 monomeri
(es. glucosio, mannosio, galattosio, fruttosio, N-acetilglucosammina, Nacetilgalattosammina, fucosio, arabinosio, xilosio, ribosio, acido
glucuronico, acido galatturonico, acido mannuronico, acido iduronico, acido
sialico, KDO, KDN).
Il numero di possibili trisaccaridi non sostituiti sarà:
[(permutazioni della sequenza) x anomeria x dimensioni d’anello x legami]
203 x 23 x 23 x 12
(la media dei possibili isomeri di legame è 12 per 3 saccaridi)
ovvero >6,000,000 strutture lineari (e 3,000,000 ramificate)
Il totale porta a 9 x 106 potenziali trisaccaridi in paragone con i soli 8000
tripeptidi composti da monomeri presi da una libreria ancora una volta di
20 elementi.
La differenza è 3 ordini di grandezza.
Per generalizzare si deve tener conto anche delle ramificazioni e delle
sostituzioni con gruppi non saccaridici.
(per semplificare, facendo un esempio di una libreria di 3 monosaccaridi):
Strutture = En x 2nr x 2na x 4n-1
En rappresenta le permutazioni di sequenza che includono la ripetizione dello
stesso monomero (per 3 monosaccaridi 33 = 27), dove E è la libreria di
zuccheri (3 nell’esempio), e n è la lunghezza dell’oligomero (3).
Il secondo termine, 2nr, tiene conto delle dimensioni d’anello (forma
piranosio o furanosio) (23 = 8).
Il terzo termine, 2na, tiene conto dell’anomeria ( o ) (23 = 8).
Il quarto termine, 4n-1, tiene conto del legame glicosidico: dove 4 sono i gruppi
ossidrile potenziali disponibili al legame con il monosaccaride precedente: 42
= 16 (per pentosi sarebbe 32 = 9, per questo è stata assunta la media di 12).
In definitiva il numero corretto di permutazioni in un trisaccaride lineare
con una libreria di 3 monosaccaridi esosi è:
27 x 8 x 8 x 16 = 27648.
Effetto delle ramificazioni
In trisaccaridi ramificati gli zuccheri A e B sono entrambi
glicosidi del residuo C:
Dove l’asterisco indica l’estremità riducente di continuazione di
catena (aglicone)
La formula che tiene conto del numero di strutture ramificate
possibili è simile a quella delle strutture lineari:
Strutture = En x 2nr x 2na x 6n-2
ma l’ultimo termine tiene conto delle possibilità delle combinazioni della
ramificazione sul residuo C che sono 6 (2-3, 2-4, 2-6, 3-4, 3-6, 4-6).
Eseguendo il calcolo: 27 x 8 x 8 x 6 = 10368
Fino ad ora quindi abbiamo: 27648 strutture lineari + 10368 strutture ramificate
→ totale 38016 possibile strutture.
Non abbiamo tenuto conto della possibilità di oligomeri non riducenti (tipo
trealosio)
Gli oligosaccaridi parlano con le proteine che li riconoscono attraverso un
linguaggio strutturale sofisticato ed il DNA potrebbe essere visto come una
“macchina del linguaggio” che codifica da una parte per lectine ed anticorpi e
dall’altra per gli enzimi (glicosil trasferasi) che costruiscono gli oligosaccaridi.
Effetto delle sostituzioni con gruppi non saccaridici
Avendo a disposizione circa 38000 strutture trisaccaridiche, se
uno dei 10 ossidrili liberi
è sostituito con un gruppo solfato si ottengono 380000 diversi
trimeri, ma la sostituzione potrebbe essere con un gruppo fosfato,
acetile, metossile, ecc., che aumento di un ordine di grandezza le
possibilità per ciascuno dei diversi sostituenti.
Ci sono 45 possibilità di sostituzioni doppie:
(dove n=10 e i=2)
Quindi con 38000 possibili trimeri si ottengono circa 1,7 milioni di
possibili trimeri di-sostituiti
Se invece i 2 sostituenti sono diversi:
Abbiamo 90 possibili sostituzioni con un potenziale di circa 3,5
milioni di strutture.
Se usassimo un codice di 20 lettere per i trisaccaridi si
otterrebbero 90 x 106 strutture mono-sostituite e circa 109
strutture di-sostituite.
Esempi di attività biologica di sistemi proteina-carboidrato:
- selectine: mediatori della risposta infiammatoria
- fattori NOD: sistemi di riconoscimento tra legumi e batteri
fissatori di azoto
- gradienti di glicosilazione sono recepiti da lectine durante i
processi di impollinazione nelle piante
- frammenti oligosaccaridici della parete cellulare delle piante
stimolano i loro meccanismi di difesa
- saccaridi N-legati contenenti un glucosio terminale sono
importanti in sistemi capaci di riconoscere se una proteina
è ripiegata correttamente
- l’eparina (un glicosoamminoglicano solfato) è coinvolta
nell’interazione con l’antitrombina III della cascata di
coagulazione del sangue
- l’eparina è pure coinvolta in interazioni con fattori di crescita
Tutti questi esempi sono anche campi molto attivi di ricerca anche a livello
industriale (→ €).
