CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI
Sara Caldarola
Lab 4306 (studio 4317 Prof Loreni)
[email protected]
ORARIO di RICEVIMENTO:
Mercoledi 11:00-12:00
ANIMALI TRANSGENICI :
definizione
Animali transgenici: animali ottenuti
attraverso una manipolazione del genoma,
inserendo uno o più geni, appartenenti alla
stessa specie, o più spesso di specie diverse.
ANIMALI TRANSGENICI :
come si producono???
GFP
Vettori retrovirali
Microiniezione del DNA
Cellule staminali embrionali
Gene targeting/ gene trap
KO condizionali
Trasferimento del nucleo
1) VETTORI RETROVIRALI
Permettono il trasferimento e l’integrazione
di materiale genetico nella cellula ospite
Vantaggi dei vettori non virali
•
•
•
•
Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni
Riduzione del rischio di reazione immunitaria
Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di
trasdurre molecole di DNA anche molto grandi
Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo
•
•
Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione
Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale
Svantaggi dei vettori non virali
Vantaggi dei vettori virali
•
Alta efficienza di trasduzione
•
Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con
eventuali virus presenti nell’ospite
Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale
nel genoma)
Molecole di DNA di dimensioni limitate
Reazioni immunitarie
Costi elevati
•
•
•
•
Svantaggi dei vettori virali
VETTORI VIRALI
Vettore virale
Vantaggi
Svantaggi
Retrovirus
Capacità d'inserimento del gene,
integrazione stabile nel DNA dell'ospite,
elevati titoli di virus ricombinante, ampio
tropismo d'infettività, relativa facilità di
manipolazione del genoma virale
Difficoltà nel controllare l'infezione
virale, mancata infezione delle cellule
non in divisione, integrazione a caso nel
genoma dell'ospite
Lentivirus
Infezione delle cellule in divisione o meno,
espressione stabile del gene, elevata capacità
d'inserimento
Mutagenesi potenziale presenza di
sequenze proteiche regolatrici e
accessorie
Adenovirus
Elevati titoli di virus, alta espressione genica,
Risposte immuni alle proteine virali,
grande capacità d'inserimento, infezione di
nessuna integrazione nel genoma
cellule in divisione e non in divisione
dell'ospite, espressione genica transitoria
Virus adeno-associati Infettano le cellule in divisione o meno, ampio Limitate capacità per i transgeni, difficile
tropismo cellulare, potenziale d'integrazione, generazione di alti titoli virali, presenza di
bassa immunogenicità e non patogenicità
adenoviruds o herpevirus per la
moltiplicazione dei virus adeno-associati
Herpesvirus
Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari, alta
capacità d'inserzione, tropismo naturale per
le cellule neuronali, seguita dalla produzione
di alti titoli virali
Poxvirus
Alta capacità d'inserzione, possibile inserzione
Possibile effetto citopatico
di grandi framenti di DNA, alti livelli di di
espressione transgenica,, seguita da virus vivo
ricombinante
Infetta cellule in divisione o meno con
Difficoltà di controllare le linee cellulari
prevalenza per i linfociti B, alta capacità
d'inserimento
Virus di Epstein-Barr
Possibile tossicità, rischio di
ricombinazione, nessuna integrazione
virale nel DNA dell'ospite
Ciclo vitale di un retrovirus
• genoma a RNA, 2 copie
• L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNA in DNA a doppio filamento nel
citoplasma della cellula infetta.
• Il DNA lineare migra nel nucleo e viene integrato nel DNA della cellula ospite. Il
DNA integrato è chiamato provirus.
• L’apparato della cellula ospite trascrive il provirus producendo RNA virali che
fungono sia da mRNA che da genomi che saranno impaccati nei nuovi virioni.
• 2 copie di RNA genomico vengono incapsidate in ogni virione
Genoma retrovirale
Trascrittasi inversa e integrasi
Proteina strutturale capside
Proteina per involucro
Psi + non codificante. Per confezionamento nel capside
Lunga sequenza terminale ripetuta
Vettore retrovirale
Lunghezza massima: 8Kb
Inserito nelle
cellule eucariotiche
con bassissima efficienza
tramite
trasfezione/elettroporazione
Con alta efficienza
Mediante
INFEZIONE
•Le particelle virali prodotte sono difettive per la replicazione
•Possiedono un gene marcatore selezionabile (NeoR)
•Infettano facilmente cellule in attiva replicazione
•Si integrano stabilmente nel genoma ospite e producono il geneX
INFEZIONE DI CELLULE IN COLTURA
E PRODUZIONE GENE X
Packaging cell lines
Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali
codificanti per proteine strutturali del capside (late
genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni.
La loro transfezione transiente con il DNA-vettore
determina l’impacchettamento del costrutto nel
virione.
Si ottiene in questo modo un vettore virale di
transfezione completo.
Utilizzo vettori retrovirali:
TERAPIA GENICA
Tecnica terapeutica in cui un gene funzionale viene inserito nelle cellule
somatiche di un paziente
Scopo:
• Correggere un difetto genetico
• Fornire una nuova funzione alla cellula
Applicabilità:
1. Malattie genetiche classiche
(un solo gene coinvolto, ereditarietà mendeliana)
2. Malattie multigeniche (cancro)
3. Malattie genetiche acquisite (AIDS)
4. Malattie non genetiche
80% dei protocolli coinvolge malattie delle categorie 2-4
Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA
• Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato).
• Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteina
terapeutica (a livelli adeguati).
• Capace di incorporare DNA di varie dimensioni.
• Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o
post-traduzionale) dell’espressione del gene terapeutico
• Non dovrebbe essere patogeno.
• Amministrabile direttamente nel paziente.
• In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio.
• Ben tollerato.
• Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune.
• Facile da produrre in maniera riproducibile.
IL VETTORE IDEALE NON ESISTE. IL VETTORE PIU’
UTILIZZATO OGGI E’ IL VETTORE RETROVIRALE
ANIMALI TRANSGENICI :
come si producono???
GFP
Vettori retrovirali
Microiniezione del DNA
Cellule staminali embrionali
Gene targeting/ gene trap
KO condizionali
Trasferimento del nucleo
YAC
2) MICROINIEZIONE del DNA
Gli organismi transgenici possono essere
ottenuti modificando cellule embrionali
totipotenti mediante iniziezione di materiale
genetico
Stimolazione della ovulazione delle femmine donatrici (da 5 a 35)
Dopo accoppiamento gli ovuli fertilizzati sono
microiniettati con DNA lineare contenente
il transgene (circa 200 copie)
all’interno del pronucleo maschile
Gli ovuli microiniettati (25-40) vengono impiantati
in una madre adotttiva resa pseudogravida da maschio
vasectomizzato. Dopo 3 settimane progenie e analisi.
Accoppiamento e analisi progenie per
capire se integrazione
è nella linea somatica o germinale
Il gene inserito viene integrato nel genoma
della cellula uovo che viene trapiantata in una
madre adottiva , che darà origine alla nascita
di un topino “chimera” (mosaico di cellule con
patrimoni genetici diversi). Nella fase
successiva si effettua un incrocio riproduttivo
tra il topino chimera e un topo normale con la
nascita di topini con i nuovi geni ma
eterozigotici; solo nell’incrocio successivo tra i
precedenti avremo la nascita di topini
omozigotici per il gene introdotto
EFFICIENZA DELLA MICROINIEZIONE DEL DNA
Al max 5% degli ovuli inoculati
genera prole transgenica!!!
ANIMALI TRANSGENICI :
come si producono???
GFP
Vettori retrovirali
Microiniezione del DNA
Cellule staminali embrionali
Gene targeting/ gene trap
KO condizionali
Trasferimento del nucleo
2) Cellule staminali embrionali (ES cells)
Le cellule ES sono cellule embrionali totipotenti,
infatti possono dare origine a cellule di tessuti
differenti. Le cellule ES vengono prelevate dalla
massa cellulare interna della blastocisti(cellula
embrionale indifferenziata) e mantenute in coltura
in presenza di cellule o fattori che ne impediscono
il differenziamento. In queste condizioni le cellule
ES mantengono intatta la loro capacità di
differenziarsi in modo appropriato in qualunque
tessuto, una volta reintrodotte in un embrione
• CALCIO FOSFATO
Il DNA a contatto con una soluzione di fosfato di calcio forma dei
precipitati i quali, con un meccanismo poco noto (probabilmente per
endocitosi) entrano nelle cellule
•
•LIPOSOMI
Lipidi che permettono la formazione di vescicole liposomiali
Il DNA all’interno entra nella cellula mediante fusione vesciola-membrana
•
Integrazione
Sito specifica
RICOMBINAZIONE
OMOLOGA
•ELETTROPORAZIONE
•
Scarica elettrica che altera la permeabilità della membrana generando
“buchi” e permettendo l’entrata di DNA esogeno
IDENTIFICAZIONE di ES CELLS con TRANSGENE
integrato nel sito corretto
SELEZIONE
POSITIVA/NEGATIVA
PCR
SELEZIONE POSITIVA-NEGATIVA cellule ES
Seq di DNA per RICOMBINAZIONE OMOLOGA nel genoma bersaglio
TRANSGENE di interesse
Gene che conferisce resistenza alla G418
Geni della Timidina Kinasi (virus herpes simplex). In presenza di GANCICLOVIR: MORTE
SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA
ASPECIFICA
SPECIFICA
1) Aggiunta di G418: SELEZIONE POSITIVA di cellule che hanno INTEGRATO il DNA
2) Aggiunta di GANCICLOVIR: SELEZIONE NEGATIVA di cellule con INTEGRAZIONE ASPECIFICA
METODO della SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA
non è infallibile ma ARRICCHISCE la popolazione delle ES cells
in elementi con TRANSGENE integrato nel sito CORRETTO
PCR
SPECIFICA
ASPECIFICA
Il GENE TRAPPING
1) Consente l’isolamento di nuovi geni
2) Consente la determinazione del profilo di espressione del gene
intrappolato
X-gal staining of E9.5d embryo
showing reporter gene expression
associated with a secretory trap
insertion in a novel gene.
Courtesy K. Pinson
3) È mutagenico: produce knockout
STRATEGIA DEL
GENE TRAP
Scelta opportuna del vettore e del sistema di trasferimento
Selezione dei cloni tramite “marker”
Localizzazione dell’inserto nel clone selezionato
ANALISI DEL FENOTIPO
ELEMENTI necessari per
gene trap:
• Cellule staminali embrionali di Topo o Uomo
• “Entrapment vector” contenente :
- gene reporter
- marker di selezione
• Cellule staminali embrionali di Topo
Integrazione
Sito specifica
SELEZIONE di ES CELLS con TRANSGENE
integrato nel sito corretto
• Geni reporter
• The E.coli lacZ gene (produzione di beta-Gal)
“Lac Z staining”: colorazione istochimica che rivela la presenza della beta-galattosidasi. Questo enzima, in presenza del
substrato X-Gal, produce un prodotto insolubile di colore BLU. Questo metodo visualizza la presenza della beta-galattosidasi
sia nell’organo “in toto” sia in specifici tessuti/cellule.
• The firefly luciferase gene
• The jelly fish green flourescence protein (GFP)
gene
Elementi importanti
per espressione di un gene e
utilizzati per il
GENE TRAPPING
Enhancer corte sequenze che stimolano l’attività trascrizionale
di un promotore
Promotore combinazione di elementi ai quali si lega l’RNA polimerasi
per iniziare la trascrizione di un gene
Vettori utilizzati per il GENE TRAPPING
• Enhancer trap Vector
• Promoter trap V.
• Gene trap V.
Enhancer Trap
Vector
Endogenous gene X
Promotore e pA
INDIPENDENTI
P'
Promotore
MINIMO
Enhancer
Exon 1
Exon 2
DNA
RNA
protein
PROTEIN X
lac Z
neo
pA
Exon 3
Vector Integration
Promotore
MINIMO
lac Z
neo
lac Z
neo
β-gal
NeoR
pA
Promoter Trap
PROMOTORE
Endogenous gene X
Vector
Promotore
ASSENTE
P'
lac Z
neo
pA
Vector Integration
DNA
lac Z
RNA
protein
lac Z
PROTEIN X
β-gal
neo
neo
NeoR
Promotore e pA
INDIPENDENTI
pA
Gene Trap
Vector
Endogenous gene X
Promotore
ASSENTE
P'
neo
lac Z
SA
Introne gene X
Vector Integration
SA
DNA
lac Z
neo
lac Z
neo
Spliced transcript
SA
RNA
protein
PROTEIN X
β-gal
Promotore e pA
INDIPENDENTI
NeoR
Distruzione GENE X e ANALISI ESPRESSIONE
pA
pA
RICAPITOLANDO…………..
Il GENE TRAPPPING consente
1) Identificazione NUOVI GENI
2) Produzione di TOPI TRANSGENICI (KO)
3) ANALISI dell’ESPRESSIONE di GENI
