Spettrometria di massa nello studio di strutture di ordine superiore File

Studi di strutture di ordine superiore di
proteine mediante spettrometria di
massa
da un lavoro di R. Kriwacki, N. Reisdorph e G. Siuzdak
Spectroscopy 18 (2004) p.37-47
Res Hospital (Tennessee) e Scripps Res Institute (California) - USA)
Nel campo delle proteine, oltre che per la definizione della struttura
primaria, la spettrometria di massa può essere utilizzata per studiare
ordini superiori di struttura attraverso frammentazione “blanda” con
enzimi proteolitici che riconoscono sequenze specifiche.
Esempi di specificità di sequenza per alcune proteasi
Tripsina: E' molto specifica, scinde i legami peptidici dopo residui di
Arginina o di Lisina; non è in grado di svolgere la propria attività
catalitica nel caso in cui l'amminoacido che segue tali residui sia una
Prolina.
Chimotripsina: non è estremamente specifica, scinde i legami peptidici
dopo residui idrofobici, soprattutto: Phe, Trp, Tyr e Leu.
Proteasi Arg-specifica: scinde i legami peptidici dopo residui di
Arginina.
Proteasi Lys-specifica: scinde i legami peptidici dopo residui di
Lisina.
Proteasi da Staphylococcus aureus (V8 proteasi): in tampone
ammonio carbonato, pH 8 , questo enzima scinde solo i legami Glu-X.
Proteasi meno specifiche. Un esempio è la pepsina. La sensibilità
dei legami peptidici all'azione di questo enzima varia da proteina a
proteina.
Presenta una maggiore specificità per i legami peptidici in cui
intervengono dei residui di Phe e Leu, sebbene sia capace di
idrolizzare anche molti altri legami. Agisce a pH acido.
La specificità per la sequenza dell’enzima proteolitico gioca un
ruolo importante nell’applicazione della spettrometria di massa
alla definizione della struttura di proteine.
Tuttavia altri fattori sono anche importanti: l’accessibilità e la
flessibilità dei siti per le proteasi. Infatti, idealmente, solo
pochi siti potrebbero essere attaccati dagli enzimi in seguito
all’inaccessibilità di altri siti o alla particolare (non)flessibilità
(dinamica) di specifiche porzioni della proteina ed a seguito della
formazione di più alti ordini strutturali.
Esempio di degradazione selettiva di una proteina attraverso una
idrolisi enzimatica “blanda”.
Le frecce indicano siti potenziali di attacco da parte della proteasi
su una ipotetica proteina.
Questi sono esposti sulla superficie
della proteina. Se è stata utilizzata una proteasi specifica, i siti
indicati devono anche contenere la sequenza riconosciuta dalla
proteasi.
Lo spettro di massa della miscela dei frammenti
proteolitici consente di ottenere una “mappa” della degradazione
che contiene informazioni sulla struttura.
La Tripsina e la proteasiV8, che tagliano, rispettivamente, siti
basici (K, R) e siti acidi (D, E) sono buone scelte (sono siti che
generalmente occupano la superficie esterna della proteina in
studio).
Le condizioni di reazione devono essere controllate per
produrre solo una proteolisi limitata in modo che il pattern di
idrolisi sia affidabile per quel che riguarda la struttura nativa
terziaria.
Inoltre, anche la scissione di un singolo specifico legame
peptidico potrebbe destabilizzare la struttura della proteina,
causando cambiamenti strutturali locali o addirittura la
denaturazione di tutta la struttura favorendo reazioni di
scissione successive non avrebbero informato sulla struttura
originaria.
La mappatura della massa di frammenti proteici può anche essere
usata
per
studiare
la
struttura
quaternaria
di
complessi
multicomponenti come i complessi proteina-proteina o proteina-
DNA e perfino virus intatti .
La prima applicazione di proteolisi limitata e spettrometria di massa
MALDI allo studio di un sistema multicomponente è stato eseguito
da Chait e collaboratori nel 1995. Nei loro studi, questo approccio
combinato è stato utilizzato per analizzare la struttura della
proteina di un fattore di trascrizione, sia libero in soluzione, che
legato ad un oligonucleotide contenente il sito specifico di legame
del DNA.
La caratteristica comune nell'analisi sia di complessi proteina-proteina
che di complessi proteina-DNA è che la proteasi fornisce una sorta di
contrasto tra gli stati associati e non associati del sistema. La formazione
di un'interfaccia tra una proteina e un'altra macromolecola proteggerà
siti altrimenti raggiungibili per le proteasi e quindi fornisce informazioni
sui residui che formano l'interfaccia.
Riconoscere i cambiamenti conformazionali
La mappatura della massa proteica può essere usata per
riconoscere semplici variazioni conformazionali di proteine.
Ad esempio, dati di cristallografia a raggi X hanno mostrato
che la calmodulina subisce variazioni conformazionali in
presenza di ioni calcio (indicati in verde nella figura).
La struttura terziaria della calmodulina consiste in una
forma a manubrio (pesi) con due domini globulari separati da
un segmento in alfa-elica. È stato proposto che il calcio
attivi la calmodulina esponendo residui idrofobici vicino alle
due estremità dell'elica centrale. Le mappe di massa
risultanti dall’azione della tripsina, chimotripsina e pepsina
hanno dimostrato che la proteina ha subito un cambiamento
strutturale in presenza di calcio.
La figura mostra gli spettri di massa dei digeriti tripsici della
calmodulina in presenza e assenza di calcio. Il confronto rivela
differenze corrispondenti alle linee di frattura nella regione centrale
elicoidale della proteina.
Sulla base dei risultati di questo esperimento relativamente semplice,
si possono apprezzare i cambiamenti strutturali causati da Ca2+, che
provocano una reattività alterata della proteasi.
La spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray è stata
utilizzata anche per monitorare il ripiegamento delle proteine
perché alcune proteine mostrano una netta differenza nel
loro stato di carica in funzione della loro conformazione
soluzione.
Nell’esempio, relativo alla fibronectina, sono mostrate due
distribuzioni di carica: una meno carica (in media +6) relativa
alla forma nativa ed una con carica più alta relativa al
conformero denaturato (fino a +12).
La differenza tra gli spettri è dovuto ai siti di protonazione
aggiuntivi disponibili in forma denaturata.
L'impiego dello scambio idrogeno/deuterio (H/D) per studiare le
variazioni
conformazionali
in
proteine
o
interazioni
proteina/proteina è stato effettuato utilizzando ESI-MS, anche a
volte MALDI-MS.
Il concetto di questo approccio è relativamente semplice: i protoni
all'interno della porzione delle proteine in stretto contatto intero intra-molecolare possono formare legami idrogeno e avranno
differenti velocità di scambio rispetto ad altri in regioni del
sistema più accessibili al solvente. Monitorando questo scambio di
idrogeno, possono essere acquisite informazioni sulla struttura
covalente di una proteina da sola o in un complesso.
Altri metodi per sondare strutture di ordine superiore
includono studi di reattività chimica dei singoli aminoacidi
in una proteina e studi di topologia mediante reazioni di
cross-linking. Entrambi gli approcci derivano dal fatto che
la tecnica MALDI ha dimostrato di essere un metodo
efficace per la
caratterizzazione di modifiche post-
traduzionali.
Es.: con l'uso di acilazione o succinilazione, Glocker et al.
hanno dimostrato che vi è una chiara correlazione tra la
reattività relativa degli amminoacidi specifici e la loro
accessibilità al solvente sulla superficie della proteina.
Un semplice esempio di tale reattività viene mostrato per una
proteina virale che, dopo essere stata esposta ad acetilazione,
ha mostrato una reattività chimica limitata.
I risultati indicano anche la potenzialità di analisi del metodo
per la caratterizzare della superficie esposta del sistema
determinando i siti di modificazione.
Studi chimici di trattamento delle proteine, o subunità
proteiche, con reticolanti, prima di digerire con enzimi, hanno
messo in evidenza le regioni proteiche adiacenti che vengono
legate covalentemente.
I frammenti proteolitici risultanti sono buone indicazioni della
struttura complessiva terziaria e/o quaternaria della proteina.
Tuttavia, l’interpretazione dei risultati di proteolisi può essere
difficile. In questo caso può essere utilizzata la marcatura
isotopica selettiva delle singole unità per semplificare
l'interpretazione dei dati di massa (marcare specifiche subunità
prima della complessazione e proteolisi).
La reticolazione chimica è stato impiegato per determinare la
stechiometria di oligomeri con analisi MALDI-MS. L’analisi
MALDI di un complesso prima della reticolazione consente la
determinazione della massa molecolare delle singole unità. Un
agente di reticolazione, come la glutaraldeide, che reagisce
principalmente con il gruppo -amminico della lisina per dare
reticolazione (la reazione può essere fermata con l'aggiunta della
matrice MALDI).