bs9

Proteine del sistema immunitario
e del sistema nervoso centrale
Catene leggere (L) e pesanti (H)
CL
VL
hinge
CH1
C H2
La struttura della molecola è
garantita da:
Interazioni non covalenti
tra domini Ig
Ponti disolfuro tra L e H e
tra le regioni C di H (cerniera)
CH3
VH
Struttura generale di un anticorpo
Riconoscimento
dell’antigene e
funzioni effettrici:
funzioni
spazialmente
separate e
indipendenti
Il dominio immunoglobulinico
≈ 110 a.a. che ripiegano in maniera indipendente
 2 strati di foglietto β planare (β sandwich)
 ciascuno composto da 3-5 β-strands (5-10 a.a.)
antiparalleli motivo a chiave greca
Stabilizzato da:
 ponti disolfuro
 interazioni idrofobiche tra i due foglietti β
Conservazione di specifici residui (es. Cys e Trp)
La superfamiglia delle immunoglobuline
 tutte le molecole che contengono
il dominio Ig; mediano funzioni di
riconoscimento, adesione e legame
omologia di sequenza
 tutti i geni che codificano per
domini Ig si sono evoluti da un gene
ancestore comune
Evento precoce: duplicazione
genica, con divergenza esoni V e C.
Evoluzione: 1) Divergenza “V e C” e
TCR (sequenza). 2- Capacità di
riarrangiare il DNA (per
riconoscimento Ag)
La funzione dipende
dall’interazione tra domini Ig
Ab
MHC
TCR
C e V in catene leggere (L) e pesanti (H)
V= N-term
C= C-term
H: V → 1 dominio
C → 3 o 4 domini
L: V → 1 dominio
C → 1 dominio
V: la sequenza a.a.
differenzia gli Ab
prodotti da un clone
di linfociti B
Segmenti ipervariabili o CDR
Complementarity Determining Region: ≈ 10 a.a.
CDR3 il più variabile
N-term
C-term
Regioni ipervariabili o CDR
Le CDR formano delle
anse esposte sulla
superficie, strutture
chimiche uniche →
SPECIFICITA’
Sequenze conservate
adiacenti →
ripiegamenti del
dominio Ig
IgM e IgA formano polimeri
IgM e IgA possono formare
multimeri
 Le IgM formano pentameri nel
plasma
 Le IgA formano dimeri nelle
secrezioni mucose (necessario
per il trasporto attraverso gli
epiteli)
Contengono una coda C-term di
18 a.a. con un residuo Cys
necessario alla polimerizzazione
Un polipeptide aggiuntivo (J:
joining) di 15 kDa favorisce la
polimerizzazione legando la Cys
Classi o isotipi delle Ig
2 classi (o isotipi), che si differenziano per la regione Cterm della catena leggera:
κ
 λ
Ogni molecola anticorpale possiede o 2κ o 2λ
Cκ e Cλ sono omologhe tra loro e omologhe a Vκ e a Vλ
Non sono note differenze funzionali
60% κ e 40% λ nell’uomo
Sito di legame per l’antigene
Ag
VL+ VH
VL
2 per ogni molecola
di anticorpo
VH
Ab
Legame all’antigene
La flessibilità degli anticorpi (grazie alla regione
CERNIERA) permette il legame a porzioni di
antigeni multivalenti distanti
Cerniera: ≈ 10/60+ a.a.
La sequenza assume una
conformazione
casuale;
la
molecola fa una torsione tra CH1
E CH2
La flessibilità è influenzata anche
dalla capacità di VH di ruotare
attorno a CH1
Legame all’antigene
Legame reversibile e
non covalente
Il contributo di ciascuna
forza dipende dalla
struttura del sito di
legame e da quella del
determinante antigenico
AFFINITA’: forza di legame tra un singolo sito combinatorio e un epitopo
antigenico. Si esprime come costante di dissociazione (Kd). Tra 107 e 10-11 M.
AVIDITA’: forza di legame complessiva tra Ag e Ab (aumento geometrico)
(rilevante per IgM)
L’Ab come Ag
isotipi: Riconosciute da Ab anti-isotipo le
immunoglobuline dello stesso isotipo di una
specie
allotipi: L’Ab riconosce in modo specifico solo
alcune Ig dello stesso isotipo della stessa specie.
Le differenze sono dovuti a diversi alleli per la
regione C (polimorfismi)
idiotipi: L’Ab riconosce in modo specifico la
regione V dell’Ig
Introduzione: l’MHC
MHC I e II sono strutturalmente
differenti ma omologhe
Sono i geni più polimorfi
Sono espressi in modo codominante
Tessuto
MHC
classe I
MHC
classe II
Tessuto linfoide
Linfociti T
+++
+ (uomo,
T attivate)
Linfociti B
+++
+++
Macrofagi
+++
++
Langherans
+++
+++
Epiteliali timo
+
+++
Altre cellule nucleate
-Espresso su tutte le
cellule nucleate
(costitutivamente)
-Riconosciuto da CD8+
-Espresso sulle APC
(potenziato da
citochine)
-Riconosciuto da CD4+
Neutrofili
+++
-
Epatociti
+
-
Reni
+
-
Cervello
+
- (ecc.
microglia)
Eritrociti
-
-
MHC di classe I
Eterotrimero; 2 catene polipeptidiche associate non covalentemente: una catena α,
codificata nell’MHC e la catena β2-microglobulina non codificata nell’MHC + peptide
N-term: α1 e α2 90 a.a., tasca di
legame per il peptide
¾ extracellulare
β2
Il segmento α3 si ripiega a
formare
un
dominio
Ig
(sequenza conservata): sito di
legame per il CD8
25 a.a. idrofobici: attraversamento
del bilayer lipidico
30 a.a. basici, interazione con i
gruppi fosfolipidici: ancoraggio
alla membrana
L’espressione in membrana
richiede i 3 componenti→i
legami si rafforzano
β2-microglobulina: interagisce con α3,
strutturalmente omologa ad un dominio
Ig, non varia tra le molecole MHC I
MHC I: tasca di legame per il peptide
α1 e α2 interagiscono tra loro e formano una
piattaforma di 8 nastri antiparalleli di foglietto
β che sostengono 2 α-eliche
I residui polimorfi di MHC I sono confinati
in α1 e α2
La tasca ospita un peptide (anche le
terminazioni) di 8-11 aminoacidi in
conformazione flessibile estesa. Le
estremità del cleft sono chiuse e peptidi
più grandi non riescono ad entrarvi
C-term del peptide: residui idrofobici
o acidi
Le interazioni non covalenti avvengono tra residui del peptide e dell’MHC
(foglietto β e α-eliche), spesso sono interazioni idrofobiche nelle “nicchie” del
foglietto β e i residui àncora (1 o 2 per peptide)
MHC di classe II
Eterotrimero: 2 catene polipeptidiche associate non covalentemente: una catena α (3234 kDa) e una catena β (29-32 kDa), entrambe codificate nell’MHC (polimorfi) + peptide
N-term: α1 e β1 contengono i
residui polimorfi, tasca di
legame per il peptide
α2 e β2 formano domini Ig
e non variano tra i vari
alleli di classe II
25 a.a. idrofobici, regione
transmembrana
a.a. basici, e coda
idrofilica
 β2: sito di legame per CD4
Le catene α di un locus (es. DR) si appaiano con catene β dello
stesso locus (DR)
MHC II: tasca di legame per il peptide
4 nastri di foglietto β +1 α-elica: α 1
4 nastri di foglietto β +1 α-elica: β 1
I residui polimorfi di MHC II sono confinati
in β 1
Le estremità della tasca sono aperte:
vengono ospitati peptidi di lunghezza
anche > 30 a.a. (lungh. ideale 12-16 a.a.)
Diversi ponti ionici e ponti H con le αeliche
Le interazioni non covalenti avvengono tra residui del peptide e dell’MHC II; non
tutti i peptidi hanno residui àncora
MHC di classe I e II: struttura
Ogni individuo
eterozigote esprime
su tutte le cellule
mononucleate 6
MHCI diversi: catene
α codificate dai 2
alleli dei geni HLA-A,
HLA-B e HLA-C
Il numero totale di
molecole MHCII
espresse è 10-20,
per gli appaiamenti
eterologhi (es. DRα
di un cromosoma
con DRβ dell’altro)
MHC di classe I e II: CDR
MHC di classe I e II: legame al peptide
MHC classe I
MHC classe II
Potenziale elettrostatico: positivo, negativo
I peptidi e le
molecole d’acqua
associate riempiono
interamente la tasca
Differenti alleli
favoriscono il legame
di peptidi diversi (e
quindi la possibilità di
presentarli ai linfociti
T)
Al riconoscimento
antigenico (TCR)
contribuiscono:
residui esposti del
peptide → specificità
residui dell’MHC →
restrizione MHC
Interazione peptide-MHC
Una proteina per evocare una risposta immunitaria deve contenere peptidi che possano
legarsi alle molecole MHC
 Le
molecole
MHC
mostrano promiscuità; la
specificità viene garantita
dal TCR
 Le molecole MHC non
distinguono tra self e nonself; la sorveglianza è data
dai linfociti T
 I peptidi hanno in comune caratteristiche strutturali (es. lunghezza)
 l’interazione è saturabile a bassa affinità (Kd= koff /kon ≈10-6 M con kon e koff basse, per
avere un’interazione che permette l’interazione con il TCR)
Introduzione: TCR
Recettore per l’antigene dei linfociti T
helper (CD4+) e citotossici (CD8+)
Eterodimero costituito da due catene
transmembrana, α e β, legate
covalentemente (S-S)
La parte esterna è simile al Fab: TCR e
Ab sono strutturalmente simili MA:
Il TCR non viene prodotto in forma
solubile
Il TCR è monovalente
Non svolge autonomamente
funzioni effettrici
Non esiste lo scambio isotipico (C
non cambia)
Non esiste la maturazione
dell’affinità (non ci sono mutazioni
somatiche nelle regioni V)
Organizzazione dei geni del TCR
1) Ricombinazione
somatica
2) Diversità giunzionale
3) Inserzione della
regione N
Introduzione: TCR
Dominio Ig variabile (V)
Dominio Ig costante (C)
Regione cerniera con Cys
Regione idrofobica
transmembrana con presenza di
Lys (α) e Lys e Arg (β) per
interazione con CD3 e ζ
Breve regione citoplasmatica
(5-12 a.a.) troppo breve per
trasdurre il segnale (CD3, ζ,
CD28...)
Differenze rispetto alle Ig
Forma simile a una Ig
ma più corta e larga
Maggiore flessibilità tra
C e V perché porzione più
estesa
Cα non è un vero dominio Ig:
la metà che si rivolge al Cβ
forma un foglietto β (simile a
Ig), l’altra metà contiene β
strands non impaccati e un
segmento di α elica
Il legame tra Cα e Cβ è
dovuto anche ai carboidrati su
Cα (legami H con foglietto β di
Cβ)
Vα→VL e Vβ→VH
Alcune differenze di
orientamento nei CDR
Riconoscimento dell’MHC-peptide
Riconoscimento dell’MHC-peptide
CDR3
CDR4
CDR1 e 2
Il riconoscimento è mediato dalle CDR della catena α e β, in
cui si concentra la variabilità
3 CDR della catena α si giustappongono a 3 CDR della catena
β (β : una quarta CDR per il riconoscimento dei superantigeni),
superficie planare
CDR3 la più variabile è posizionata in corrispondenza del
centro del peptide legato all’MHC
CDR1 e CDR2 contatto con l’MHC
CDR1 e 2
L’affinità del TCR per
MHC/peptide è bassa (Kd
10-5-10-7; Ag/Ab Kd fino a
10-11 M); l’emivita 1-10s.
Per questo sono necessarie
le molecole accessorie per
avere una risposta
biologica
MHC
Riconoscimento del superAg
I superAg stimolano tutti i linfociti T che
esprimono una determinata regione Vβ nel loro TCR
(non sono mitogeni ma nemmeno Ag comuni)
Si legano a MHC di classe II (codificati da diversi
alleli), NON nella tasca di presentazione dell’Ag
Ogni enterotossina aggrega 2 MHC → 2 TCR
Vβ contiene CDR4
I corecettori: CD4 e CD8
Glicoproteine transmembrana della superfamiglia delle Ig
Funzione simile ma struttura diversa
Motivo per cui i T CD4+ riconoscono MHCII e CD8+ MHCI
D1
→Ig
D2
CD4: 4 domini Ig
extracellulari, una regione
transmembrana idrofobica,
e 38 a.a. (molti basici)
citoplasmatici
Mediante D1 e D2 (Nterm) si lega al dominio
non polimorfo β2 dell’MHC
II,
D1-D2
fortemente
impaccati e separati da D3D4 da una regione cerniera
La regione intracellulare interagisce fortemente con una tirosina chinasi Lck, per la
trasduzione del segnale
I corecettori: CD4 e CD8
Glicoproteine transmembrana della superfamiglia delle Ig
Funzione simile ma struttura diversa
CD8: eterodimero, 2 catene omologhe CD8α e CD8β
legate da S-S
Un dominio Ig extracellulare, polipeptide esteso, una
regione transmembrana idrofobica, e 25 a.a. (molti
basici) citoplasmatici
La regione extracellulare è altamente glicosilata per
proteggere il CD8 dall’attacco delle proteasi e per
mantenerlo esteso
Il dominio Ig interagisce con il dominio non
polimorfo α3 di MHC I
La
regione
intracellulare
interagisce
fortemente con una tirosina chinasi Lck, per la
trasduzione del segnale
I corecettori: CD4 e CD8
Citochine: Caratteristiche generali
Piccole proteine (15-30 kDa)
non anticorpali, mediatori
della risposta immune e
dell’infiammazione
Riconosciute da recettori (Kd
10-10-10-12 M)
Secrete da diversi tipi di
cellule dell’immunità innata
e acquisita
Citochine: Caratteristiche generali
 Pleiotropismo:
prodotte da diverse
cellule e attive su
diversi tipi cellulari
 Ridondanza: azioni
simili
- possono condividere R o
parti di R
- difetti in un componente
unico: piccolo effetto
- difetto in componenti
condivisi: grande effetto
(es. IL-2Rγ SCID severe
combined
immunodeficiency)
 Influenzano sintesi e azione di
altre citochine - antagonismo/sinergia/effetti additivi
Citochine: Caratteristiche generali
La loro secrezione è un evento
di breve durata e auto-limitato
- non immagazzinate
- espressione in seguito a stimolazione
(mRNA con breve emivita)
La loro azione può essere locale
(autocrina o paracrina) o
sistemica
L’espressione dei recettori per citochine è regolata
- risposta solo dei linfociti Ag-specifici
- la citochina stessa può aumentare o diminuire l’espressione del suo R
Agiscono modificando l’espressione genica nelle
cellule bersaglio
- eccezioni: chemochine e TNF
Classificazione funzionale
Citochine dell’immunità innata
Prodotte soprattutto dai fagociti mononucleati
Possono essere prodotte anche nell’ambito della risposta immune specifica
Alimentano reazioni infiammatorie precoci
Citochine dell’immunità specifica
Prodotte soprattutto dai linfociti T
Funzione regolatrice sulla crescita/differenziamento delle popolazioni linfocitarie
o
Reclutamento di cellule effettrici specializzate (es. neutrofili)
Citochine ad attività emopoietica
Prodotte da cellule stromali del midollo osseo, leucociti ed altri tipi cellulari
Funzione regolatrice sulla crescita/differenziamento dei leucociti immaturi
Recettori per le citochine
5 diverse famiglie (struttura comune):
Recettori di tipo 1 (dell’IL-2 o dell’emopoietina)
-1 o + domini con coppia di Cys conservate e
sequenza prossimale alla membrana WSXWS
-lega molecole con ripiegamento 4-helix
bundle
- struttura multimerica , indotta dal legame del
L (1 catena per interazione con L e 1o+ per
trasduzione del segnale→spesso condivise tra
+ recettori)
-mancano di attività Tyr chinasica intrinseca
- 3 subset in base alla loro capacità di legare
uno dei 3 elementi comuni: gp130, common
beta, and common gamma
Recettori per le citochine
Recettori di tipo 2 (degli interferoni)
- residui di Cys conservati
- struttura multimerica (1 catena per interazione con L e 1o+ per
trasduzione del segnale)
- R per IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma, IL10, IL22
- hanno attività protein-chinasica intrinseca
Recettori per le citochine
Recettori per TNF
Superfamiglia delle Ig
Recettori a 7 α-elica transmembrana (recettori per
le chemochine) e accoppiati a proteine G
Mediatori della immunità innata
TNFα
IL-1
IL-10
IL-12
INTERFERONI
di tipo 1 (IFNα, IFNβ)
IFNγ
CHEMOCHINE
TNF-α
Prodotto
da macrofagi attivati
Mediatore dell’infiammazione acuta in risposta a microrganismi (gram-)
Media il reclutamento di neutrofili e macrofagi nel sito dell’infiammazione
(↑ICAM endotelio)
Agisce sull’ipotalamo (febbre)
Promuove la produzione delle proteine della fase acuta (fegato)
β-jellyroll
TNF omotrimero
R per TNF
TNF / TNFR (monomero)
TNF-α
Death domain
IL-1
Effetti simili a TNF α
Prodotta da macrofagi attivati
Agisce soprattutto su linfociti T (al confine tra immunità innata e acquisita)
Beta-trifoglio: struttura 12 beta-strands
R: superfamiglia delle Ig
IL-1
IL-10
Citochina inibitoria:
Inibisce la produzione di IFNγ dalle Th1 e produce lo shift verso Th2
Inibisce la produzione di altre citochine dai macrofagi attivati
Inibisce la produzione di MHCII e altre molecole co-stimolatorie sui macrofagi
Prodotta da macrofagi attivati e Th2
Agisce nell’immunità innata e acquisita
IL-10 (Inter-subunit
dimeric 4-helix
bundles)
IL-10Rα
R di tipo
II
IL-10
La trasduzione avviene solo in
presenza di entrambe le catene del R
IL-12
Prodotta da macrofagi attivati e cellule dendritiche
Stimola la produzione di IFNγ
Induce il differenziamento dei Th verso Th1
Aumenta le capacità citotossiche dei CTL e NK
IL-12 è un eterodimero (p40 e
p35 legate covalentemente)
Il recettore è formato da due
catene (R di tipo I)
La trasduzione del segnale usa
la via JAK/STAT
IFN-α e β
IFN-α prodotta da fagociti mononucleati IFN-β da diversi tipi di cellule (fibroblasti)
Inibisce la replicazione virale nelle cellule
Aumenta l’espressione di MHCI
Attiva le cellule NK
Inter-subunit dimeric 4-helix bundles
R di tipo II
IFN-α e β
chemochine
Struttura β a catena corta
Piccole citochine (8-12 kDa). 2 ponti disolfuro nella
molecola
Prodotto da diversi leucociti e altri tipi cellulari
(endotelio, fibroblasti...)
Grande famiglia di molecole (più di 50)
Funzione: permettere la migrazione leucocitaria dal
circolo ai tessuti e la loro locomozione
- migrazione
- attivazione: doppio sito di legame delle
chemochine
- chemotassi
2 sottofamiglie distinte in base alla posizione delle
Cys all’N-terminale:
-α chemochine: struttura CXC (neutrofili)
-β chemochine: struttura CC (monociti,
eosinofili, linfociti)
Ogni singola chemochina lega più recettori e
viceversa
7 eliche
transmembrana
Mediatori della immunità acquisita
IL-2
IL-4
IL-5
TGF-β
IL-10
IFN-γ
IL-2
 Prodotta da T (soprattutto Th)
 Principale fattore di crescita per le cellule T che
hanno incontrato l’antigene. Azione autocrina
 Attiva NK e monociti
 R di tipo I: 3 catene e catena alfa espressa solo
da linfociti T attivati (> affinità)
 Induce apoptosi nei linfociti T (risposta che si
prolunga e [IL-2 ] crescenti)
4-helix bundle
Fattore gamma comune
4-helix bundle
 Prodotta da Th2 e macrofagi
 Stimola la produzione di Th2 da cellule Th vergini
(fattore di crescita autocrino)
 Determina lo switch isotipico verso IgE
 R di tipo I: 2 catene. Fattore gamma comune con IL-2
 Attiva la via di JAK/STAT (STAT6)
 E la via IRS-2
IL-4
TGF-β




Prodotta da linfociti T, macrofagi e molti altri tipi cellulari
Inibisce la proliferazione dei T
Inibisce l’attivazione dei macrofagi
Agisce sui leucociti polimorfonucleati e le cellule endoteliali, antagonizzando
l’effetto delle citochine pro-infiammatorie
 Recettori di tipo I e II: trasducono il segnale tramite un dominio Ser/Thr chinasico
Anello formato da 2 ponti disolfuro in cui si
infila un terzo: nodo
IFN-γ





Principale citochina attivatoria dei macrofagi
Importante sia per immunità innata sia specifica
Citochina prototipica di Th1
Prodotto da NK, Th1 e CTL
Attraverso la via di STAT1 stimola la produzione di MHCI enzimi che sintetizzano
NO, IL-12 (sinergia)
 Importante per uccidere i microbi fagocitati
 Shift verso IgG
Omodimero: intersubunit 4 helix bundle
R di tipo II
Mediatori dell’emopoiesi
GM-CSF
(granulociti-macrofagi)
M-CSF (monociti e macrofagi)
G-CSF (granulociti)
CSF= colony-Stimulating Factor
Differenziazione e espansione delle cellule progenitrici midollari
4-helix bundle a catena
breve o lunga
R famiglia delle Ig (M-CSF) o
di tipo I (GM-CSF e G-CSF)
Regolatori della risposta immune
Le
citochine sono regolatori positivi e negativi
La loro azione dipende dall’ambiente (altre citochine,
recettori espressi e loro subunità)
Agiscono in diversi momenti della risposta immune
Regolano il tipo e l’ ampiezza della risposta immune
Patologie da aggregazione proteica
•
Ab
 Malattia di Alzheimer
•
a-Sinucleina
 Malattia di Parkinson
•
Huntingtina
 Corea di Huntington
•
Proteina Prionica
 Malattia di Creutzfeld-Jacob
Fibrille di a-sinucleina
(M. di Parkinson)
Conway et al., Science 2001
Proteina Prionica
Designed protein tetramer zipped together with a hydrophobic
Alzheimer homology: A structural clue to amyloid assembly