Proteine del sistema immunitario
e del sistema nervoso centrale
Catene leggere (L) e pesanti (H)
CL
VL
hinge
CH1
C H2
La struttura della molecola è
garantita da:
Interazioni non covalenti
tra domini Ig
Ponti disolfuro tra L e H e
tra le regioni C di H (cerniera)
CH3
VH
Struttura generale di un anticorpo
Riconoscimento
dell’antigene e
funzioni effettrici:
funzioni
spazialmente
separate e
indipendenti
Il dominio immunoglobulinico
≈ 110 a.a. che ripiegano in maniera indipendente
2 strati di foglietto β planare (β sandwich)
ciascuno composto da 3-5 β-strands (5-10 a.a.)
antiparalleli motivo a chiave greca
Stabilizzato da:
ponti disolfuro
interazioni idrofobiche tra i due foglietti β
Conservazione di specifici residui (es. Cys e Trp)
La superfamiglia delle immunoglobuline
tutte le molecole che contengono
il dominio Ig; mediano funzioni di
riconoscimento, adesione e legame
omologia di sequenza
tutti i geni che codificano per
domini Ig si sono evoluti da un gene
ancestore comune
Evento precoce: duplicazione
genica, con divergenza esoni V e C.
Evoluzione: 1) Divergenza “V e C” e
TCR (sequenza). 2- Capacità di
riarrangiare il DNA (per
riconoscimento Ag)
La funzione dipende
dall’interazione tra domini Ig
Ab
MHC
TCR
C e V in catene leggere (L) e pesanti (H)
V= N-term
C= C-term
H: V → 1 dominio
C → 3 o 4 domini
L: V → 1 dominio
C → 1 dominio
V: la sequenza a.a.
differenzia gli Ab
prodotti da un clone
di linfociti B
Segmenti ipervariabili o CDR
Complementarity Determining Region: ≈ 10 a.a.
CDR3 il più variabile
N-term
C-term
Regioni ipervariabili o CDR
Le CDR formano delle
anse esposte sulla
superficie, strutture
chimiche uniche →
SPECIFICITA’
Sequenze conservate
adiacenti →
ripiegamenti del
dominio Ig
IgM e IgA formano polimeri
IgM e IgA possono formare
multimeri
Le IgM formano pentameri nel
plasma
Le IgA formano dimeri nelle
secrezioni mucose (necessario
per il trasporto attraverso gli
epiteli)
Contengono una coda C-term di
18 a.a. con un residuo Cys
necessario alla polimerizzazione
Un polipeptide aggiuntivo (J:
joining) di 15 kDa favorisce la
polimerizzazione legando la Cys
Classi o isotipi delle Ig
2 classi (o isotipi), che si differenziano per la regione Cterm della catena leggera:
κ
λ
Ogni molecola anticorpale possiede o 2κ o 2λ
Cκ e Cλ sono omologhe tra loro e omologhe a Vκ e a Vλ
Non sono note differenze funzionali
60% κ e 40% λ nell’uomo
Sito di legame per l’antigene
Ag
VL+ VH
VL
2 per ogni molecola
di anticorpo
VH
Ab
Legame all’antigene
La flessibilità degli anticorpi (grazie alla regione
CERNIERA) permette il legame a porzioni di
antigeni multivalenti distanti
Cerniera: ≈ 10/60+ a.a.
La sequenza assume una
conformazione
casuale;
la
molecola fa una torsione tra CH1
E CH2
La flessibilità è influenzata anche
dalla capacità di VH di ruotare
attorno a CH1
Legame all’antigene
Legame reversibile e
non covalente
Il contributo di ciascuna
forza dipende dalla
struttura del sito di
legame e da quella del
determinante antigenico
AFFINITA’: forza di legame tra un singolo sito combinatorio e un epitopo
antigenico. Si esprime come costante di dissociazione (Kd). Tra 107 e 10-11 M.
AVIDITA’: forza di legame complessiva tra Ag e Ab (aumento geometrico)
(rilevante per IgM)
L’Ab come Ag
isotipi: Riconosciute da Ab anti-isotipo le
immunoglobuline dello stesso isotipo di una
specie
allotipi: L’Ab riconosce in modo specifico solo
alcune Ig dello stesso isotipo della stessa specie.
Le differenze sono dovuti a diversi alleli per la
regione C (polimorfismi)
idiotipi: L’Ab riconosce in modo specifico la
regione V dell’Ig
Introduzione: l’MHC
MHC I e II sono strutturalmente
differenti ma omologhe
Sono i geni più polimorfi
Sono espressi in modo codominante
Tessuto
MHC
classe I
MHC
classe II
Tessuto linfoide
Linfociti T
+++
+ (uomo,
T attivate)
Linfociti B
+++
+++
Macrofagi
+++
++
Langherans
+++
+++
Epiteliali timo
+
+++
Altre cellule nucleate
-Espresso su tutte le
cellule nucleate
(costitutivamente)
-Riconosciuto da CD8+
-Espresso sulle APC
(potenziato da
citochine)
-Riconosciuto da CD4+
Neutrofili
+++
-
Epatociti
+
-
Reni
+
-
Cervello
+
- (ecc.
microglia)
Eritrociti
-
-
MHC di classe I
Eterotrimero; 2 catene polipeptidiche associate non covalentemente: una catena α,
codificata nell’MHC e la catena β2-microglobulina non codificata nell’MHC + peptide
N-term: α1 e α2 90 a.a., tasca di
legame per il peptide
¾ extracellulare
β2
Il segmento α3 si ripiega a
formare
un
dominio
Ig
(sequenza conservata): sito di
legame per il CD8
25 a.a. idrofobici: attraversamento
del bilayer lipidico
30 a.a. basici, interazione con i
gruppi fosfolipidici: ancoraggio
alla membrana
L’espressione in membrana
richiede i 3 componenti→i
legami si rafforzano
β2-microglobulina: interagisce con α3,
strutturalmente omologa ad un dominio
Ig, non varia tra le molecole MHC I
MHC I: tasca di legame per il peptide
α1 e α2 interagiscono tra loro e formano una
piattaforma di 8 nastri antiparalleli di foglietto
β che sostengono 2 α-eliche
I residui polimorfi di MHC I sono confinati
in α1 e α2
La tasca ospita un peptide (anche le
terminazioni) di 8-11 aminoacidi in
conformazione flessibile estesa. Le
estremità del cleft sono chiuse e peptidi
più grandi non riescono ad entrarvi
C-term del peptide: residui idrofobici
o acidi
Le interazioni non covalenti avvengono tra residui del peptide e dell’MHC
(foglietto β e α-eliche), spesso sono interazioni idrofobiche nelle “nicchie” del
foglietto β e i residui àncora (1 o 2 per peptide)
MHC di classe II
Eterotrimero: 2 catene polipeptidiche associate non covalentemente: una catena α (3234 kDa) e una catena β (29-32 kDa), entrambe codificate nell’MHC (polimorfi) + peptide
N-term: α1 e β1 contengono i
residui polimorfi, tasca di
legame per il peptide
α2 e β2 formano domini Ig
e non variano tra i vari
alleli di classe II
25 a.a. idrofobici, regione
transmembrana
a.a. basici, e coda
idrofilica
β2: sito di legame per CD4
Le catene α di un locus (es. DR) si appaiano con catene β dello
stesso locus (DR)
MHC II: tasca di legame per il peptide
4 nastri di foglietto β +1 α-elica: α 1
4 nastri di foglietto β +1 α-elica: β 1
I residui polimorfi di MHC II sono confinati
in β 1
Le estremità della tasca sono aperte:
vengono ospitati peptidi di lunghezza
anche > 30 a.a. (lungh. ideale 12-16 a.a.)
Diversi ponti ionici e ponti H con le αeliche
Le interazioni non covalenti avvengono tra residui del peptide e dell’MHC II; non
tutti i peptidi hanno residui àncora
MHC di classe I e II: struttura
Ogni individuo
eterozigote esprime
su tutte le cellule
mononucleate 6
MHCI diversi: catene
α codificate dai 2
alleli dei geni HLA-A,
HLA-B e HLA-C
Il numero totale di
molecole MHCII
espresse è 10-20,
per gli appaiamenti
eterologhi (es. DRα
di un cromosoma
con DRβ dell’altro)
MHC di classe I e II: CDR
MHC di classe I e II: legame al peptide
MHC classe I
MHC classe II
Potenziale elettrostatico: positivo, negativo
I peptidi e le
molecole d’acqua
associate riempiono
interamente la tasca
Differenti alleli
favoriscono il legame
di peptidi diversi (e
quindi la possibilità di
presentarli ai linfociti
T)
Al riconoscimento
antigenico (TCR)
contribuiscono:
residui esposti del
peptide → specificità
residui dell’MHC →
restrizione MHC
Interazione peptide-MHC
Una proteina per evocare una risposta immunitaria deve contenere peptidi che possano
legarsi alle molecole MHC
Le
molecole
MHC
mostrano promiscuità; la
specificità viene garantita
dal TCR
Le molecole MHC non
distinguono tra self e nonself; la sorveglianza è data
dai linfociti T
I peptidi hanno in comune caratteristiche strutturali (es. lunghezza)
l’interazione è saturabile a bassa affinità (Kd= koff /kon ≈10-6 M con kon e koff basse, per
avere un’interazione che permette l’interazione con il TCR)
Introduzione: TCR
Recettore per l’antigene dei linfociti T
helper (CD4+) e citotossici (CD8+)
Eterodimero costituito da due catene
transmembrana, α e β, legate
covalentemente (S-S)
La parte esterna è simile al Fab: TCR e
Ab sono strutturalmente simili MA:
Il TCR non viene prodotto in forma
solubile
Il TCR è monovalente
Non svolge autonomamente
funzioni effettrici
Non esiste lo scambio isotipico (C
non cambia)
Non esiste la maturazione
dell’affinità (non ci sono mutazioni
somatiche nelle regioni V)
Organizzazione dei geni del TCR
1) Ricombinazione
somatica
2) Diversità giunzionale
3) Inserzione della
regione N
Introduzione: TCR
Dominio Ig variabile (V)
Dominio Ig costante (C)
Regione cerniera con Cys
Regione idrofobica
transmembrana con presenza di
Lys (α) e Lys e Arg (β) per
interazione con CD3 e ζ
Breve regione citoplasmatica
(5-12 a.a.) troppo breve per
trasdurre il segnale (CD3, ζ,
CD28...)
Differenze rispetto alle Ig
Forma simile a una Ig
ma più corta e larga
Maggiore flessibilità tra
C e V perché porzione più
estesa
Cα non è un vero dominio Ig:
la metà che si rivolge al Cβ
forma un foglietto β (simile a
Ig), l’altra metà contiene β
strands non impaccati e un
segmento di α elica
Il legame tra Cα e Cβ è
dovuto anche ai carboidrati su
Cα (legami H con foglietto β di
Cβ)
Vα→VL e Vβ→VH
Alcune differenze di
orientamento nei CDR
Riconoscimento dell’MHC-peptide
Riconoscimento dell’MHC-peptide
CDR3
CDR4
CDR1 e 2
Il riconoscimento è mediato dalle CDR della catena α e β, in
cui si concentra la variabilità
3 CDR della catena α si giustappongono a 3 CDR della catena
β (β : una quarta CDR per il riconoscimento dei superantigeni),
superficie planare
CDR3 la più variabile è posizionata in corrispondenza del
centro del peptide legato all’MHC
CDR1 e CDR2 contatto con l’MHC
CDR1 e 2
L’affinità del TCR per
MHC/peptide è bassa (Kd
10-5-10-7; Ag/Ab Kd fino a
10-11 M); l’emivita 1-10s.
Per questo sono necessarie
le molecole accessorie per
avere una risposta
biologica
MHC
Riconoscimento del superAg
I superAg stimolano tutti i linfociti T che
esprimono una determinata regione Vβ nel loro TCR
(non sono mitogeni ma nemmeno Ag comuni)
Si legano a MHC di classe II (codificati da diversi
alleli), NON nella tasca di presentazione dell’Ag
Ogni enterotossina aggrega 2 MHC → 2 TCR
Vβ contiene CDR4
I corecettori: CD4 e CD8
Glicoproteine transmembrana della superfamiglia delle Ig
Funzione simile ma struttura diversa
Motivo per cui i T CD4+ riconoscono MHCII e CD8+ MHCI
D1
→Ig
D2
CD4: 4 domini Ig
extracellulari, una regione
transmembrana idrofobica,
e 38 a.a. (molti basici)
citoplasmatici
Mediante D1 e D2 (Nterm) si lega al dominio
non polimorfo β2 dell’MHC
II,
D1-D2
fortemente
impaccati e separati da D3D4 da una regione cerniera
La regione intracellulare interagisce fortemente con una tirosina chinasi Lck, per la
trasduzione del segnale
I corecettori: CD4 e CD8
Glicoproteine transmembrana della superfamiglia delle Ig
Funzione simile ma struttura diversa
CD8: eterodimero, 2 catene omologhe CD8α e CD8β
legate da S-S
Un dominio Ig extracellulare, polipeptide esteso, una
regione transmembrana idrofobica, e 25 a.a. (molti
basici) citoplasmatici
La regione extracellulare è altamente glicosilata per
proteggere il CD8 dall’attacco delle proteasi e per
mantenerlo esteso
Il dominio Ig interagisce con il dominio non
polimorfo α3 di MHC I
La
regione
intracellulare
interagisce
fortemente con una tirosina chinasi Lck, per la
trasduzione del segnale
I corecettori: CD4 e CD8
Citochine: Caratteristiche generali
Piccole proteine (15-30 kDa)
non anticorpali, mediatori
della risposta immune e
dell’infiammazione
Riconosciute da recettori (Kd
10-10-10-12 M)
Secrete da diversi tipi di
cellule dell’immunità innata
e acquisita
Citochine: Caratteristiche generali
Pleiotropismo:
prodotte da diverse
cellule e attive su
diversi tipi cellulari
Ridondanza: azioni
simili
- possono condividere R o
parti di R
- difetti in un componente
unico: piccolo effetto
- difetto in componenti
condivisi: grande effetto
(es. IL-2Rγ SCID severe
combined
immunodeficiency)
Influenzano sintesi e azione di
altre citochine - antagonismo/sinergia/effetti additivi
Citochine: Caratteristiche generali
La loro secrezione è un evento
di breve durata e auto-limitato
- non immagazzinate
- espressione in seguito a stimolazione
(mRNA con breve emivita)
La loro azione può essere locale
(autocrina o paracrina) o
sistemica
L’espressione dei recettori per citochine è regolata
- risposta solo dei linfociti Ag-specifici
- la citochina stessa può aumentare o diminuire l’espressione del suo R
Agiscono modificando l’espressione genica nelle
cellule bersaglio
- eccezioni: chemochine e TNF
Classificazione funzionale
Citochine dell’immunità innata
Prodotte soprattutto dai fagociti mononucleati
Possono essere prodotte anche nell’ambito della risposta immune specifica
Alimentano reazioni infiammatorie precoci
Citochine dell’immunità specifica
Prodotte soprattutto dai linfociti T
Funzione regolatrice sulla crescita/differenziamento delle popolazioni linfocitarie
o
Reclutamento di cellule effettrici specializzate (es. neutrofili)
Citochine ad attività emopoietica
Prodotte da cellule stromali del midollo osseo, leucociti ed altri tipi cellulari
Funzione regolatrice sulla crescita/differenziamento dei leucociti immaturi
Recettori per le citochine
5 diverse famiglie (struttura comune):
Recettori di tipo 1 (dell’IL-2 o dell’emopoietina)
-1 o + domini con coppia di Cys conservate e
sequenza prossimale alla membrana WSXWS
-lega molecole con ripiegamento 4-helix
bundle
- struttura multimerica , indotta dal legame del
L (1 catena per interazione con L e 1o+ per
trasduzione del segnale→spesso condivise tra
+ recettori)
-mancano di attività Tyr chinasica intrinseca
- 3 subset in base alla loro capacità di legare
uno dei 3 elementi comuni: gp130, common
beta, and common gamma
Recettori per le citochine
Recettori di tipo 2 (degli interferoni)
- residui di Cys conservati
- struttura multimerica (1 catena per interazione con L e 1o+ per
trasduzione del segnale)
- R per IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma, IL10, IL22
- hanno attività protein-chinasica intrinseca
Recettori per le citochine
Recettori per TNF
Superfamiglia delle Ig
Recettori a 7 α-elica transmembrana (recettori per
le chemochine) e accoppiati a proteine G
Mediatori della immunità innata
TNFα
IL-1
IL-10
IL-12
INTERFERONI
di tipo 1 (IFNα, IFNβ)
IFNγ
CHEMOCHINE
TNF-α
Prodotto
da macrofagi attivati
Mediatore dell’infiammazione acuta in risposta a microrganismi (gram-)
Media il reclutamento di neutrofili e macrofagi nel sito dell’infiammazione
(↑ICAM endotelio)
Agisce sull’ipotalamo (febbre)
Promuove la produzione delle proteine della fase acuta (fegato)
β-jellyroll
TNF omotrimero
R per TNF
TNF / TNFR (monomero)
TNF-α
Death domain
IL-1
Effetti simili a TNF α
Prodotta da macrofagi attivati
Agisce soprattutto su linfociti T (al confine tra immunità innata e acquisita)
Beta-trifoglio: struttura 12 beta-strands
R: superfamiglia delle Ig
IL-1
IL-10
Citochina inibitoria:
Inibisce la produzione di IFNγ dalle Th1 e produce lo shift verso Th2
Inibisce la produzione di altre citochine dai macrofagi attivati
Inibisce la produzione di MHCII e altre molecole co-stimolatorie sui macrofagi
Prodotta da macrofagi attivati e Th2
Agisce nell’immunità innata e acquisita
IL-10 (Inter-subunit
dimeric 4-helix
bundles)
IL-10Rα
R di tipo
II
IL-10
La trasduzione avviene solo in
presenza di entrambe le catene del R
IL-12
Prodotta da macrofagi attivati e cellule dendritiche
Stimola la produzione di IFNγ
Induce il differenziamento dei Th verso Th1
Aumenta le capacità citotossiche dei CTL e NK
IL-12 è un eterodimero (p40 e
p35 legate covalentemente)
Il recettore è formato da due
catene (R di tipo I)
La trasduzione del segnale usa
la via JAK/STAT
IFN-α e β
IFN-α prodotta da fagociti mononucleati IFN-β da diversi tipi di cellule (fibroblasti)
Inibisce la replicazione virale nelle cellule
Aumenta l’espressione di MHCI
Attiva le cellule NK
Inter-subunit dimeric 4-helix bundles
R di tipo II
IFN-α e β
chemochine
Struttura β a catena corta
Piccole citochine (8-12 kDa). 2 ponti disolfuro nella
molecola
Prodotto da diversi leucociti e altri tipi cellulari
(endotelio, fibroblasti...)
Grande famiglia di molecole (più di 50)
Funzione: permettere la migrazione leucocitaria dal
circolo ai tessuti e la loro locomozione
- migrazione
- attivazione: doppio sito di legame delle
chemochine
- chemotassi
2 sottofamiglie distinte in base alla posizione delle
Cys all’N-terminale:
-α chemochine: struttura CXC (neutrofili)
-β chemochine: struttura CC (monociti,
eosinofili, linfociti)
Ogni singola chemochina lega più recettori e
viceversa
7 eliche
transmembrana
Mediatori della immunità acquisita
IL-2
IL-4
IL-5
TGF-β
IL-10
IFN-γ
IL-2
Prodotta da T (soprattutto Th)
Principale fattore di crescita per le cellule T che
hanno incontrato l’antigene. Azione autocrina
Attiva NK e monociti
R di tipo I: 3 catene e catena alfa espressa solo
da linfociti T attivati (> affinità)
Induce apoptosi nei linfociti T (risposta che si
prolunga e [IL-2 ] crescenti)
4-helix bundle
Fattore gamma comune
4-helix bundle
Prodotta da Th2 e macrofagi
Stimola la produzione di Th2 da cellule Th vergini
(fattore di crescita autocrino)
Determina lo switch isotipico verso IgE
R di tipo I: 2 catene. Fattore gamma comune con IL-2
Attiva la via di JAK/STAT (STAT6)
E la via IRS-2
IL-4
TGF-β
Prodotta da linfociti T, macrofagi e molti altri tipi cellulari
Inibisce la proliferazione dei T
Inibisce l’attivazione dei macrofagi
Agisce sui leucociti polimorfonucleati e le cellule endoteliali, antagonizzando
l’effetto delle citochine pro-infiammatorie
Recettori di tipo I e II: trasducono il segnale tramite un dominio Ser/Thr chinasico
Anello formato da 2 ponti disolfuro in cui si
infila un terzo: nodo
IFN-γ
Principale citochina attivatoria dei macrofagi
Importante sia per immunità innata sia specifica
Citochina prototipica di Th1
Prodotto da NK, Th1 e CTL
Attraverso la via di STAT1 stimola la produzione di MHCI enzimi che sintetizzano
NO, IL-12 (sinergia)
Importante per uccidere i microbi fagocitati
Shift verso IgG
Omodimero: intersubunit 4 helix bundle
R di tipo II
Mediatori dell’emopoiesi
GM-CSF
(granulociti-macrofagi)
M-CSF (monociti e macrofagi)
G-CSF (granulociti)
CSF= colony-Stimulating Factor
Differenziazione e espansione delle cellule progenitrici midollari
4-helix bundle a catena
breve o lunga
R famiglia delle Ig (M-CSF) o
di tipo I (GM-CSF e G-CSF)
Regolatori della risposta immune
Le
citochine sono regolatori positivi e negativi
La loro azione dipende dall’ambiente (altre citochine,
recettori espressi e loro subunità)
Agiscono in diversi momenti della risposta immune
Regolano il tipo e l’ ampiezza della risposta immune
Patologie da aggregazione proteica
•
Ab
Malattia di Alzheimer
•
a-Sinucleina
Malattia di Parkinson
•
Huntingtina
Corea di Huntington
•
Proteina Prionica
Malattia di Creutzfeld-Jacob
Fibrille di a-sinucleina
(M. di Parkinson)
Conway et al., Science 2001
Proteina Prionica
Designed protein tetramer zipped together with a hydrophobic
Alzheimer homology: A structural clue to amyloid assembly
