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Analisi elettroforetica delle proteine
CAPITOLO 10 nuovo testo
Capitolo 12 vecchio testo.
Tramite ELETTROFORESI
le proteine si possono separare in base a una o piu’
delle seguenti caratteristiche :
dimensione , carica o idrofobicita’ relativa.
Perché si usa una matrice solida per
alcuni tipi di elettroforesi?
La separazione elettroforetica si effettua su una matrice solida
poiché durante la migrazione in un campo elettrico si generano
forze convettive e di diffusione
Da cosa sono generate queste forze?
Le proteine sono cariche ad un pH differente dal loro punto
isoelettrico
Punto isoelettrico (pI)
e’ il valore di pH al quale il numero delle
cariche negative sulla molecola prodotta dalla ionizzazione del gruppo
carbossilico risulta uguale al numero delle cariche positive acquisite dal
gruppo amminico
Le molecole cariche migrano in un campo elettrico in
maniera dipendente dalla loro densita’ di carica.
Al punto isoelettrico la molecola e’
elettroforeticamente immobile .
Una proteina carica che è posta in un campo
elettrico ha una distanza di migrazione
proporzionale sia alla intensità di corrente (I)
che al tempo (t ).
La corrente nella soluzione tra gli elettrodi
e’ condotta principalmente dagli ioni del tampone di corsa
e solo in piccola parte dagli ioni del campione.
La legge di Ohm esprime la relazione tra
corrente (I), voltaggio (V), e resistenza (R):
R=V/I
SI può quindi accellerare una separazione
elettroforetica aumentando il voltaggio applicato,
MA…….
Aumentando il voltaggio necessariamente si
genera CALORE
Durante l’elettroforesi
la potenza (W= watts) generata nel mezzo di
supporto e’ data da :
W = I2 R
R= resistenza
I= intensità della corrente
La maggior parte della potenza sviluppata durante
elettroforesi
viene dissipata in calore
Problemi derivanti dallo sviluppo di calore durante
elettroforesi.
1.Maggiore tasso di diffusione del campione e
degli ioni del buffer =allargamento delle bande da
separare
2. Formazione di correnti convettive =possono
causare un miscelamento del campione
3. Instabilita’ termica dei campioni=denaturazione
delle proteine sensibili al calore conseguente perdita di
attivita/folding
4.Diminuita viscosita’ del buffer = riduzione
della resistenza del mezzo
Gel di agarosio
i pori sono formati da molecole di polisaccaridi
che partecipano alla formazione di strutture a doppia elica
Questi pori non hanno una struttura regolare
la dimensione
dei pori si controlla variando la
concentrazione di agarosio:
piu’ grande e’ il numero delle eliche formate per unita’ di spazio
e piu’ piccola sara’ la dimensione media dei pori
,
Gel di poliacrilammide: miscela di bis e monoacrilammide
Una singola molecola di bis acrilammide e’
essenzialmente formata da due molecole di
acrilammide unite da un gruppo metilico.
La poliacrilammide polimerizzata ha matrice molto
regolare con pori di dimensioni uniformi
I monomeri di acrilammide formano catene e le
molecole di bis-acrilammide danno i metili che formano
i ponti cross-lincanti
La polimerizzazione della acrilammide avviene in presenza di
TEMED e AMMONIO PERSOLFATO
TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la
S2O82+
produzione di un radicale libero SO4- .
+ eSO42- + SO4- .
=R*
Il radicale libero (R*= SO4- . )
è una molecola con un elettrone spaiato
R* sono specie molto reattive.
Occasionalmente si procede alla degassazione della acrilammide mix
poiche’ l’ ossigeno rimuove i radicali
Durante le polimerizzazione Il radicale libero
(R*= SO4- . ), che è una molecola con un elettrone spaiato,
reagisce con M (monomero di acrilammide)
R*+M
RM*+M
RMM*
e forma un legame singolo condividendo il suo
elettrone spaiato con uno proveniente dal
guscio esterno della molecola del monomero
…e così via
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)
Separazione dellle proteine tra 5 to 2,000 kDal
e’ stata introdotta da by Raymond and Weintraub (1959). .
La dimensione dei pori si puo’ controllare variando la
percentuale di acrilammide e/o Bis-acrilammide (da
3% a 30%),
SDS –PAGE
(gel denaturante)
Il detergente anionico SDS =
CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+
Il detergente anionico SDS
distrugge i legami idrogeno,
blocca le interazioni idrofobiche
e sostanzialmente denatura le
molecole proteiche
minimizzando così le differenze
dovute alla forma molecolare
eliminando le strutture secondarie
e terziarie.
http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/SDSPAGE/SDSPAGE.html#SDS
Le proteine possono essere
completamente denaturate quando
sostanze riducenti quali DTT e’
utilizzato insieme al SDS.
La maggioranza delle proteine lega
1.4g SDS per grammo di proteina
Il legame del SDS alle proteine causa
un’ efficace mascheramento delle cariche
intrinseche della catena polipeptidica
e
apporta una carica netta negativa
proporzionale alla lunghezza del polipeptide
SDS-PAGE
il miscuglio proteico si separa secondo l’effettivo raggio molecolare
(Mr) di ciascuna proteina,
che e’ approssimativamente uguale alla dimensione molecolare di
ciascun polipeptide.
risultato sarà la separazione delle proteine per setacciamento
attraverso i pori del gel di poliacrilammide
http://www5.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/Elpho_1D_SDS+PAGE
TAMPONI usati per SDS-PAGE
Esistono due tipi di sistemi
di buffers:
continui e discontinui
Buffer discontinuo di Ornstein and Davis (1964) modificato da
Laemnli
Laemmli buffer
E’ il piu’ comune buffer utilizzato per SDS-PAGE gels
run
Caricamento
Stacking
Separating
Laemmli buffer e’ costituito da
a) Stacking (o gel di impaccamento) con
grandi pori
b)Separating gel (12%, 10%, 6% etc.).
Stacking gel
ha pori di grandi dimensioni
(4% acrilammide)
che permettono alle proteine di muoversi liberamente e di
concentrarsi sotto l’ effetto del campo elettrico.
Loading
RUN
Lo scopo del gel di impaccamento è di
concentrare le proteine in un banda
sottile prima che ilcampione entri nel
gel separatore
NELLO STACKING GEL
Una volta applicata la corrente..
le bande di proteine si assottigliano a causa del fatto
che gli ioni di glicinato (carichi -) presenti nel tampone
elettroforetico hanno mobilità elettroforetica più bassa
dei complessi proteina-SDS
ioni di glicinato<complessi proteina-SDS< ioni cloruro (Cl-)
I complessi proteina-SDS a loro volta hanno una
mobilità elettroforetica, inferiore a quella degli ioni
cloruro (Cl-) presenti nel tampone di caricamento
(sample buffer)
Il gel di separazione
(separating gel)
Separazione
ha pH 8.8 mentre quello di
impaccamento (stacking gel) ha pH 6.8.
Separating gel
Raggiunto il gel di separazione, il glicinato a causa
dell’
ambiente
a
pH
maggiore
diventa
completamente
ionizzato e cresce la sua
mobilita’elettroforetica
Il risultato e’ che nel gel separante i complessi
proteins_SDS (carichi negativamente)
si muovono verso il polo positivo in funzione del
setaccio molecolare operato dal gel di
poliacrilammide quindi in funzione del loro
peso molecolare (MW=kDal)
-180
-65
-20
Cioè : le proteine piu’ piccole migreranno piu’
velocemente di quelle piu’ grandi a che saranno
rallentate da resistenze frizionali
ALTRI TIPI DI GEL DI POLIACRILAMMIDE
a) GEL NATIVO
SDS è assente e le proteine non vengono
denaturate prima del caricamento
Le proteine migrano in dipendenza della loro carica
b) GEL a GRADIENTE (tipicamente 5% a 25% )
Permette una maggiore separazione delle proteine
con massa simile
Rilevazione delle proteine su gel
con Comassie Blue
Il colorante Comassie brilliant blue-G250 (CBB)
si lega alle proteine tramite
interazioni elettrostatiche dei gruppi sulfonici
del colorante.
La colorazione CBB visualizza bande con una concentrazione
di circa 0.1µg di proteina.
Silver staining
Western blotting
trasferimento su membrana
di nitrocellulosa (NC) o polyvinylidene fluoride (PVDF)
delle proteine
separate tramite elettroforesi
APPARATI di traferimento
Liquido e SEMI-DRY
APPARATO DI TRASFERIMENTO
Semi-dry
Direzione di migrazione
3MM
Corrente applicata
Nel semi-dry si suggerisce di applicare 1mA/cm2 di
membrana
in ogni caso mai piu’ di 5mA/cm2 senza
refrigerazione!
Attenti alle bolle d’aria e
all’essicamento della membrana
BUFFER di TRASFERIMENTO :
Ruolo del metanolo e del SDS.
Il metanolo presente nel buffer fa :
1.
decrescere la
elettroforesi.
mobilita’
delle
proteine
durante
l’
2. dissociare l’ SDS dalle proteine
3. aumentare le interazioni idrofobiche tra proteine e
membrana.
4. Denaturare le proteine ad alto peso molecolare e quindi
rende il loro passaggio dal gel alla membrana piu’
difficile. Le proteine piccole non sono invece influenzate
dalla presenza di metanolo.
L’SDS da una carica negativa alla
proteina
aiuta il traferimento delle proteine
dal gel alla membrana
NOTA CHE:
L’ SDS agisce in maniera opposta al
metanolo per quel che rigurda il suo
effetto sulla quantità di proteina che
viene
traferita
dal
gel
alla
membrana
Per migliorare il legame delle proteine con la
membrana
si puo’ aumentare la concentrazione di metanolo
(normalmente tra 10%-20%)
oppure
ridurre la sua concentrazione se le proteine
rimangono nel gel.
Un’alta concentrazione di SDS, sebbene faciliti il
trasferimento, può interferire con il legame delle
proteine alla membrana
APPARATI di traferimento
Liquido
Piu’ tempo le proteine sono a contatto con la membrana
e piu’ facilmente vi si legheranno
Apparato liquido
+buffer +tempo di corsa rispetto ad un semi-dry
Quando si usa?
A) Si devono trasferire proteine ad alto peso molecolare
poichè necessitano di piu’ tempo per essere trasferite e di
maggiori quantita’ di buffer
B) Le proteine sono corse su gel ad alta concentrazione di
acrilammide o molto spessi.
Tempi di trasferimento
I tempi di trasferimento variano in dipendenza
dalla dimensione delle proteine da trasferire, tipo
di membrana e tipo di apparato per blotting
utilizzato
semi-dry : max 2h
o liquido : fino a 28h
TIPI di MEMBRANE per il trasferimento di proteine:
Le membrane di PVDF
lega le proteine principalmente attraverso interazioni
idrofobiche.
sono comunemente usate per la loro i resistenza
chimica e per la stabilita’ fisiologica.
La nitrocellulosa (NC)
lega le proteine primariamente tramite
interazioni elettrostatiche o idrofiliche
Membrane PVDF :
legano le proteine principalmente attraverso interazioni
idrofobiche.
Esistono diversi tipi di membrane PVDF
Diversa porosità e resistenza
Membrane derivate con procedure che aggiungono cariche alla
membrana PVDF in modo da permettere oltre che interazioni
idrofobiche anche interazioni elettrostatiche.
Membrane PVDF derivate sono per esempio usate per legare
DNA o RNA
o
per procedure di purificazione a scambio ionico delle proteine .
MEMBRANE DI NITROCELLULOSA (NC)
Sono meno sensibili della PVDF alle concentrazioni di
SDS (eg. danno meno “background signal” ) perchè
legano le proteine primariamente tramite interazioni
elettrostatiche o idrofiliche.
L’ SDS, coprendo le cariche delle proteine, puo’ impedire la
formazioni di legami idrofobici con la PVDF ma non interferisce con
la formazione deli legami elettrostatici con la NC.
Proteine che sono scarsamente trasferibili possono essere meglio
trasferite poiche’ si puo’ utilizzare SDS nel buffer di traferimento
(normalmente questo non e’ presente o e’ controproducente) .
SVANTAGGI
La maggiore limitazione della nitrocellulasa e’ la sua scarsa
capacita’ di legare proteine con basso peso molecolare e la fragilità
PRO e contro la PVDF rispetto alla NC.
La PVDF e’ meglio per:
a) il trasferimento di proteine a basso peso
molecolare perchè lega piu’ fortemente le
proteine
ma
1) e’ piu’ sensibile alla presenza di impurita’ presenti
nel buffer (compreso SDS, glicina e Tris)
la presenza di queste sostanze sulla membrana puo’ dare origine ad
un alto “background”.
2) e’ piu’ difficile eluire le proteine da PVDF
quindi meglio NON usare PVDF in procedure che implicano la
eluizione della banda proteica dalla membrana