Per diventare un buon medico,
occorre essere curiosi
Quale è il
meccanismo
maggiormente
responsabile della
produzione di
mutazioni
spontanee
???
Errori da replicazione del DNA
• il DNA è replicato in 2-3 ore
• ~100,000 base pairs sono
replicate in 1 secondo
• è fatale che accadano errori
• se non fosse per l'esistenza di
un meccanismo biologico di
correzione degli errori, le
mutazioni prodotte sarebbero
assai più numerose,
probabilmente di un livello
insopportabile (!)
IL DNA E’ UNA MOLECOLA
DINAMICA
STABILITA' vs INSTABILITA'
GENOMA
ERRORI SPONTANEI CHE AVVENGONO
DURANTE LA REPLICAZIONE DEL DNA
MUTAZIONI ENDOGENE
• 10(17) divisioni cellulari per generare e mantenere una
popolazione di 10(14) cellule
• per ciascuna divisione cellulare devono essere
incorporati 6x10(9) nuovi nucleotidi
• una replicazione del DNA priva di errori richiede una
accuratezza maggiore di 6x10(26)
Il tasso di mutazione è equivalente alla probabilità che un gene subisca una mutazione nel corso di una generazione
o della produzione di un gamete
Geni batterici e virali subiscono mutazioni in media una volta ogni 100 milioni di replicazioni o divisioni cellulari
Mais, Drosophila, e uomo dimostrano tassi molto più elevati. Per ogni gamete prodotto si hanno 1 in 1,000,000 (106) e 1 in 100,000 (10-5) mutazioni/gene (almeno per i geni studiati).
Nel topo alcuni geni presentano un tasso di mutazione spontanea ancora più elevato, da 1 in 100,000 a 1 in 10,000
(10-5 to 10-4).
Non è chiaro perchè i tassi variano così tanto
Un esempio di come si misura il tasso delle
mutazioni spontanee
11 x 10-6 mutations per gene
(per generation)
Può variare tra 10-8 and 10-4
in base al gene.
Mutation rate
In humans, a mutation rate of about 10-8 mutations/bp/generation
(BNID 105813) was inferred from projects where both parents and their
children were sequenced at high coverage. Note that the value of the
mutation rate is on a per generation basis and is thus the accumulation in
the gametes of mutations occurring over several tens of genome
replications between fertilization of the egg all the way until the
formation of the next generation of gametes. The characteristic number
of such replications is discussed in the vignette on “How many
chromosome replications occur per generation?”. In humans it is
estimated that there are about 20-30 genome replications between the
fertilized egg and the female gametes (BNID 105585) and about ten
times that for males, with large variation depending on age (BNID
105574). With ≈3×109 bp in the human genome the mutation rate leads
to about 10-8 mutations/bp/generation x 3×109 bp/genome ≈ 10-100
mutations per genome per generation (BNID 110293). Using an order of
magnitude of 100 replications per generation, we arrive at 0.1-1
mutations per genome per replication.
ETEROZIGOSI
DA 1:250 A 1:1000 BASI SONO
DIVERSE TRA DUE
INDIVIDUI QUALSIASI
I genomi di due individui
differiscono per almeno 6 milioni
di basi
POLIMORFISMO
SEQUENZA POLIMORFICA
FREQUENZA > 1%
ALLELE
5%
95%
Le mutazioni si generano a caso e quindi colpiscono il
genoma a caso ?
5%
95%
Le mutazioni che si generano a caso colpiscono il genoma a
caso ?
LA FREQUENZA E LA VARIETA’ DI MUTAZIONI NEL
DNA CODIFICANTE SONO DIVERSE DAL DNA NON
CODIFICANTE
IL TASSO DI TRANSIZIONE NEI
GENOMI DI MAMMIFERO E'
INASPETTATAMENTE SUPERIORE
AL TASSO DI TRANSVERSIONE
C---->T FREQUENZA ELEVATA DERIVANTE
DALLA INSTABILITA' PER DEAMINAZIONE
SPONTANEA DI C NEL DINUCLEOTIDE CpG
(TASSO DI MUTAZIONE 8,5 VOLTE DI ALTRI
DINUCLEOTIDI)
Deaminazione da acido nitroso
Differente grado di conservazione nel tempo di sequenze
di tipo diverso
LE SEQUENZE CODIFICANTI HANNO IL GRADO
PIU ELEVATO DI CONSERVAZIONE
Le mutazioni nella regione codificante
Non-conservative VS Conservative mutations
DIFFERENTI GRADI DI
DEGENERAZIONE
CARATTERIZZANO LE
DIFFERENTI POSIZIONI
NELL'AMBITO DEL CODONE
Differente grado di conservazione nel tempo di sequenze
di tipo diverso
IL TASSO DI SOSTITUZIONE DI UNA
BASE IN SITI NON DEGENERATI E'
MOLTO BASSO COERENTEMENTE
CON UNA FORTE PRESSIONE
SELETTIVA
TASSO DI SOSTITUZIONE DI UNA
BASE IN SITI DEGENERATI QUATTRO
VOLTE E’ MOLTO SIMILE A QUELLO
DENTRO INTRONI E PSEUDOGENI
PERCHE’ SELETTIVAMENTE NEUTRE
TASSO DI SOSTITUZIONE DI UNA BASE IN SITI
DEGENERATI DUE VOLTE E’ INTERMEDIO
PERCHÉ ALCUNE SOSTITUZIONI SONO
CONSERVATIVE
Mutazioni puntiformi nel codone di Tyr
Thr Tyr Ala
protein
5’-ACG UAU GCG -3’
1st nucleotide changes
3rd nucleotide changes
GAU = Asp UGU = Cys
AAU = Asn UCU = Ser
CAU = His UUU = Phe
Missense
mRNA
UAG = stop
UAA = stop
UAC = Tyr
Missense
Non-conservative VS Conservative mutations
nonsense
silent
SITI NON
DEGENERATI=TUTTE E 3 LE
POSSIBILI SOSTITUZIONI
SONO NON SINONIME
• PRIMA BASE
53/61
• SECONDA BASE 61/61
• TERZA BASE
2/61
• TOTALE
65%
SITI DEGENERATI DUE
VOLTE = UNA DELLE TRE
POSSIBILI SOSTITUZIONI E’
UN SINONIMO
PRIMA BASE 8/61
TERZA BASE 27/61
TOTALE
19%
SITI DEGENERATI QUATTRO
VOLTE = TUTTE E 3 LE
POSSIBILI SOSTITUZIONI
SONO SINONIME
• TERZA BASE
32/61
• TOTALE
16%
SOSTITUZIONI
CONSERVATIVE E
NON-CONSERVATIVE
SOSTITUZIONI CONSERVATIVE E NONCONSERVATIVE
LA STRUTTURA DEL CODICE
GENETICO E IL GRADO CON CUI UN
AMINOACIDO E’ FUNZIONALMENTE
SIMILE AD UN ALTRO INFLUISCONO
SULLA RELATIVA MUTABILITÀ DEI
SINGOLI AMINOACIDI (CERTI
AMINOACIDI NON SONO FACILMENTE
SOSTITUIBILI AD ES. CISTEINA
AL CONTRARIO SERINA E TREONINA
SONO TRA I PIU' MUTABILI)
Il tasso e il tipo di sostituzioni variano tra
geni differenti
I geni che codificano proteine
mostrano enormi variazioni nel tasso
di sostituzioni non sinonime
FATTORI CHE DETERMINANO DIFFERENZE
•
Funzione biologica delle proteine (sequenze estremamente
conservate)
•
Specie animale (roditore ----> scimmia -----> uomo)
•
Sesso
I tassi di mutazione sono più elevati nei maschi
per il maggior numero di divisioni delle cellule
germinali
Femmina: durante il V mese di sviluppo la popolazione totale di
cellule germinali raggiunge la quota massima di 6,8x106 cellule.
Sono necessari 22 cicli replicativi. Per diventare cellula uovo
aggiungi altre due divisioni (meiotiche). Totale 24 cicli.
Maschio: fino alla pubertà di anni 13 si producono 1,2x109 cellule
germinali (spermatogoni) mediante 30 cicli replicativi. Dopo la
pubertà gli spermatogoni affrontano ogni anno un totale di 23 cicli.
Lo spermatogonio matura a spermatozoo mediante 5 cicli. Totale 30
+ 23n + 5 (n=età in anni dopo la pubertà).
5%
95%
IL TASSO COMPLESSIVO DI MUTAZIONE NEL DNA
CODIFICANTE E' MOLTO INFERIORE RISPETTO AL DNA
NON CODIFICANTE
LA PRESSIONE SELETTIVA RIDUCE NON SOLO LA
FREQUENZA COMPLESSIVA MA ANCHE LO SPETTRO
DELLE POSSIBILI MUTAZIONI NEL DNA CODIFICANTE
MUTAZIONI SILENTI, SENSE, E NON-SENSE HANNO
DIVERSO EFFETTO E SI DISTRIBUISCONO CON
DIFFERENTI FREQUENZE
LE MUTAZIONI CHE
INTERESSANO LO SPLICING
alterano una sequenza
conservata necessaria per lo
splicing normale, ma alcune si
verificano in sequenze
normalmente non richieste per
lo splicing
Il Gene
• Spinal-Muscolar-Atrophy-determining gene
Survival of Motor Neurons (SMN, 3.5 KB)
• Part of 500 Kb inverted duplication 5q13
• SMA patients homozygous deletion SMN1 gene
• Deletion of SMN2 is not associated with SMA
(Melki et al., 1994; Lefebvre et al., 1995; Burglen et al., 1996)
Genetics of the disease
The SMA disease causing SMN1 gene maps to a complex genomic region of
chromosome 5q13.1. This region is characterized by an inverted duplication of the
element with 4 genes (SMN, neuronal apoptosis inhibitor protein {NAIP}, SERF and
GTFH2) present in telomeric and centromeric copies. In 1995, it was reported that
homozygous deletions of the SMN1 gene were likely the cause of 95% of SMA
patients. All SMA patients have one or more copies of a nearly identical gene, SMN2.
These two genes are distinguished by five nucleotide changes in exon 7 and 8. The
critical nucleotide difference which makes SMN2 only partially functional is a C to T
transition at position 6 of exon 7. This change leads to the exclusion of exon 7 in the
majority of transcripts. This mRNA is subsequently translated to form an unstable
truncated non-oligomerizing isoform of SMN protein. However, SMN2 gene still
produces 5-10% functional full length SMN transcripts. The SMN2 gene is present in
variable copy numbers in the population; all SMA patients have one or more copy of
the SMN2 gene which, due to its partial functionality, acts as a positive disease
modifier. There is thus an inverse correlation between the number of SMN2 gene
(which can produce between 10-50% of SMN protein depending on copy number)
and the severity of the disease. Low levels of SMN protein allows embryonic
development but is not enough, in the long term, to allow motor neurons to survive in
the spinal cord. Type I patients usually have 2 copies whereas Type II have 3 copies
of SMN2. Type III and IV have 3-4 copies of the SMN2 gene. Individuals with 5 or
more copies of the SMN2 gene, despite having no functional SMN1 gene are
completely asymptomatic and are protected against the disease manifestation.
Normal Individual
SMN2
SMN1
SMA Patients
SMN2
SMN1
Quando una mutazione
silente non è silente
Distrofia muscolare del cingolo (gene calpaina 3)
Mutazioni che introducono
un codone di terminazione
prematura
• Mutazioni non sense
• Inserimenti e delezioni (un codone di
STOP entro circa 100 nt)
• Omissione di esoni
• ----> mRNA instabile (++ frequente)
• ----> Polipeptide tronco (instabile)
Mutazioni che coinvolgono
sequenze ripetute
Sequenze ripetute di nucleotidi
sono presenti in elevato numero di
copie nel DNA, hanno strutture
diverse (minisatelliti,
microsatelliti, VNTR, etc.), e sono
la causa più frequente di
inserzioni, delezioni e fusioni
Duplicazione genica
Sindrome di Kearns-Sayre (miopatia mitocondriale)
Background
•
Rare neuromuscular disorder
•
•
Effects mitochondria
•
•
•
Large duplications or deletions in mitochondrial DNA
(>1000bp) results in under or over production of
mitochondrial gene products
1/3 cases 4977bp deletion
Randomly effects people
•
•
Only 226 cases reported in literature
only isolated reports of any kind of inheritance pattern
Prognosis
•
•
Depends on severity
Severe cases 85% muscle mitochondrial genome
affected
Symptoms
•
Onset before 20 and includes
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Immobile or limited eye movement
Abnormal pigment in eyes
Cardiac problems or congestive heart failure
Muscle and skeletal weakness
Short stature
Hearing
Ataxia (coordination problems)
Diabetes
Dementia and other mental illnesses
Affects systems with higher energy requirements
most
Fibre rosse sfilacciate (Ragged red fibers) in Kearns-Sayre
Conversione genica
Trasferimento non reciproco di
sequenze informative tra una coppia di
sequenze non alleliche (conversione
genica interlocus) o alleliche (c.g.
interallelica)
Relativamente frequenti a livello di
DNA ripetuto in tandem
Steroido-21-idrossilasi
Scambi gene-pseudogene
Congenital adrenal hyperplasia autosomal recessive
prima
dopo
Inversioni prodotte dalla
ricombinazione
intracromatidica tra
ripetizioni invertite
Emofilia A: un problema di inversione
•
Il gene del fattore VIII della coagulazione
si trova sul cromosoma X ed è la causa
più importante di emofilia
•
F8 è un gene molto lungo: all'interno
dell'introne 22 sono presenti un gene più
piccolo, F8A insieme a una seconda
copia collocata alcune centinaia di
migliaia di cb, sulla catena opposta
•
Quindi i due geni che sono assai simili
tra loro hanno orientamento opposto.
•
Accade con una certa frequenza che nel
corso della meiosi i due geni vanno
incontro a ricombinazione intra-allelica
per appaiamento errato
•
Questa mutazione da ragione del 45% dei
casi di emofilia A
•
Quasi tutti i nuovi casi insorgono durante
la meiosi nel maschio: infatti nella
femmina i due cromosomi omologhi sono
appaiati durante la meiosi e questo fatto
pare inibire la inversione
Emofilia A
Sequenze molto brevi di
DNA ripetuto sono spesso
coinvolte nella produzione
di mutazioni importanti
fibrosi cistica
fibrosi cistica
poliposi adenomatosa del colon
xeroderma pigmentoso
beta-talassemia
