Ciclo dell’acido citrico
1
Il metabolismo ossidativo dei
carburanti metabolici
I gruppi acetili derivati da carboidrati,
amminoacidi e acidi grassi entrano nel
ciclo dell’acido citrico dove vengono
ossidati a CO2
2
3
Il piruvato, derivato dal glucosio ad opera della
glicolisi, viene ossidato formando acetil CoA e CO2
per azione di 3 enzimi organizzati nel
complesso della piruvato deidrogenasi, localizzato
nei mitocondri delle cellule eucariotiche.
4
Reazione complessiva catalizzata dal
complesso della piruvato deidrogenasi.
In questa reazione sono coinvolti
cinque coenzimi e tre enzimi.
5
Reazione complessiva catalizzata dal complesso della
piruvato deidrogenasi:
La decarbossilazione ossidativa
processo di ossidazione irreversibile: il gruppo carbossilico viene
rimosso dal piruvato sotto forma di una molecola di CO2,
e i 2 atomi di carbonio che restano diventano il gruppo acetilico
legato al CoA.
6
La deidrogenazione e la decarbossilazione del piruvato ad Acetil CoA
coinvolgono l’azione sequenziale di
3 enzimi diversi:
piruvato deidrogenasi (E1),
diidrolipoil transacetilasi (E2)
diidrolipoil deidrogenasi (E3).
e di 5 gruppi prostetici o coenzimi: tiamina pirofosfato (TPP)
FAD
CoA
NAD
lipoato.
Ben 4 vitamine sono elementi essenziali di questo sistema:
la tiamina per la TPP,
la riboflavina per il FAD,
la niacina per il NAD
il pantotenato per il CoA
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8
E2= diidrolipoil
transacetilasi
(24)
E1= piruvato
deidrogenasi
(24)
Intero complesso
(60 subunità)
E3= diidrolipoil
Deidrogenasi
(12)
Organizzazione strutturale del complesso multienzimatico della
piruvato deidrogenasi
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11
Regolazione del complesso multienzimatico
• l’attivazione avviene ad opera di una
fosfoproteina fosfatasi che defosforila il
cmplesso attraverso una reazione Mg2+
e Ca 2+ dipendente
•L’inattivazione del complesso si realizza
per azione di una proteina chinasi Mg 2+ATP-dipendente strettamente legata al
complesso multienzimatico
• l’acetil CoA e il NADH prodotti nella
reazione inibiscono la forma defosforilata
(attiva) dell’enzima, ma stimolano la
proteina chinasi, promuovendo
l’interconversione del complesso nella sua
forma inattiva
12
• il CoA libero inibisce la proteina chinasi e il NAD
• quando aumenta il rapporto NADH/NAD+mitocondriale o il
rapporto acetil-CoA/CoA come avviene durante la ossidazione degli acidi grassi, il complesso della piruvato
deidrogenasi è inattivato per azione della chinasi
• il piruvato è un potente inibitore della proteina
chinasi, quindi alti livelli di piruvato inibiscono la chinasi
e attivano il complesso
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Modificazione covalente della piruvato deidrogenasi
negli eucarioti.
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Funzione principale del Ciclo è quella
di generare equivalenti riducenti che
sono utilizzati per produrre energia,
cioè ATP, nel processo di trasporto
degli elettroni-fosforilazione
ossidativa
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CICLO DELL’ACIDO CITRICO
Il ciclo dell’acido citirco ossida l’acetil CoA, il prodotto
comune della degradazione di:
• glucosio
• acidi grassi
• amminoacidi chetogenici
a CO2 e H2O con produzione di NADH e FADH2
• molti amminoacidi glucogenici possono essere ossidati attraverso
il ciclo dell’acido citrico grazie alla loro demolizione in uno dei suoi
intermedi
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L’attività degli enzimi dell’acido citrico:
• citrato sintasi
• isocitrato deidrogenasi
• -chetoglutarato
• è controllata dalla disponibilità di substrato e dall’inibizione a
feedback da parte degli intermedi del ciclo
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1a reazione: formazione di citrato
• l’enzima citrato sintasi è inibito da elevate concentrazioni di NADH(H),
ATP di succinil CoA e di acil-CoA che agiscono come effettori negativi
• il citrato a sua volta agisce come effettore negativo della
fosfofruttochinasi-1
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L’intermedio citril-CoA non viene rilasciato dall’enzima durante la
reazionee si ritiene che rimanga legato al sito catalitico della citrato
sintasi
• la citrato sintasi è presente nella matrice mitocondriale ed ha un
peso molecolare di 100.000
22
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2a reazione: formazione di isocitrato
• la reazione aconitasica è fortemente inibita da fluoroacetato ( CH2-FCOO- ) un composto presente in certe piante del Sud Africa
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Centro ferro-zolfo dell’aconotasi
La reazione dell’aconitasi
non richiede cofattori ,
essa richiede la
partecipazione di ioni
ferroso che gli vengono
forniti dal centro ferrozolfo che è un componente
essenziale dell ’attività
idratasica dell’enzima
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3a reazione:
decarbossilazione ssidativa dell’isocitrato per formare achetoglutarato.
Isocitrato deidrogenasi: NAD+ dip. (matrice mitocondriale, ciclo di Krebs)
NADP+ dip.(citosol, reazioni anaboliche)
• peso molecolare di 380.000
• è costituita da 8 sub unità identiche
• è stimolata da ADP e in alcuni casi da AMP
• è inibita da ATPe NADH+
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4a reazione:
decarbossilazione ossidativa dell’ a-chetoglutarato in
succinil-CoA e CO2
• questo complesso è identico a quello della piruvato deidrogenasi ma non
è regolato da reazioni di fosforilazione e defosforilazione
• il complesso è inibito da ATP, GTP da NADH e succinil CoA
• sembra attivato da ioni calcio
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La formazione di ATP o GTP a spese dell’energia
rilasciata dalla decarbossilazione ossidativa dell’ achetoglutarato è un esempio di fosforilazione a
livello del substrato
Il GTP formato dalla succinil-CoA sintetasi può
donare il suo gruppo fosforico terminale all’ADP per
formare ATP, mediante l’azione reversibile della
nucleoside difosfato chinasi.
28
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5a reazione: Conversione del succinil-CoA a succinato
• fase intermedia in cui la molecola dell’enzima diventa fosforilata a livello di
un suo residuo di His presente nel sito attivo
• Il gruppo fosforico viene quindi trasferito all’ADP o al GTP per formare
ATP e GTP
E ‘ questa l’unica reazione metabolica in cui il GTP è preferito all’ ATP
• le cellule animali hanno 2 isozimi, uno per l’ADP e un altro per il GDP.
30
Reazione della succinil CoA sintetasi
Un gruppo fosforico sostituisce il CoA legato
all’enzima
formando un fosfato ad alta energia
Il succinil fosfato dona il gruppo fosforico a un
residuodi His dell’enzima formando un fosfoenzima
ad alta energia
Il gruppo fosforico viene trasferito dal residuo di His
al gruppo fosforico terminale del GDP
31
6a reazione: sintesi di fumarato
• la succinato deidrogenasi è fortementa
inibita da malonato e ossalacetato
• è attivata da ATP, fosfato inorganico e
succinato
• il malonato inibisce l’enzima in modo
competitivo, dovuto alla notevole somiglianza
strutturale col succinato
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La succinato deidrogenasi
• è una flavoproteina che è inserita a differenza degli altri
enzimi, nelle membrana mitocondriale interna favorendo il
trasferimento diretto degli elettroni alla catena respiratoria
• è’ costituito da due subunità di 70.000 e 30.000 m.w.
rispettivamente
• la prima contiene il sito di legame per il substrato, il FAD
legato alla lisina e 4 atomi di ferro + 4 atomi di zolfo
• la seconda contiene solo ferro e zolfo
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7a reazione: idratazione del fumarato per produrre
malato
• la fumarasi è un tetramero con M.W. Di 200.000
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Ultima reazione: ossidazione del malato a ossalacetato
• in questa reazione con l’ossidazione del malato ad ossalacetato si
rigenera il prodotto di partenza che così può riprendere il ciclo
• l’ossalacetato può essere convertito anche in fosfoenol-piruvato
o transaminato ad aspartato
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Le reazioni anaplerotiche riforniscono il ciclo di Krebs di intermedi.
In condizioni normali, esiste un bilanciamento quasi perfetto tra le reazioni che
rimuovono intermedi dal ciclo e quelle che invece lo riforniscono, e quindi la
concentrazione di questi composti resta costante.
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CARENZA DI PIRUVATO DEIDROGENASI
• Deficienze dei differenti componenti catalitici o subunità
regolatrici
• I bambini con questo deficit presentano alti livelli di
lattato, piruvato e alanina che causano acidosi lattica
cronica .
.
Presentano inoltre gravi danni neurologici. In molti casi
questa carenza comporta la morte dell’individuo
• La diagnosi viene fatta saggiando il complesso enzimatico e/o
le sue subunità enzimatiche in colture di fibroblasti di pelle
prelevata dal paziente
•In alcuni casi i pazienti rispondono a un regime dietetico di
tipo chetogenico con bassi livelli di carboidrati
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DEFICIT DI FUMARASI
• Il deficit di enzimi del ciclo degli acidi ticarbossilici è raro,
tuttavia sono stati riportati alcuni casi in cui è presente un
grave deficit di fumarasi sia a livello mitocondriale che
citosolico
• È presente un grave danno neurologico con encefalopatia e
distonia che si manifestano precocementa dopo la nascita
• Le urine contengono quantità anomale di fumarato e di una
o più delle seguenti sostanze : succinato, -chetoglutarato,
citrato e malato
• Entrambi i genitori presentano livelli di attività enzimatica
dimezzati rispetto al normale come si verifica nei disordini su
base autosomica recessiva
41
Una molecola di glucosio
può potenzialmente
promuovere la sintesi di
circa 38 ATP in condizioni
di aerobiosi, cioè quando
funziona il ciclo dell' acido
citrico.
42
L’energia liberata dalle ossidazioni viene
efficacemente conservata nel ciclo
L’energia liberata dalle reazioni dell’intero processo
viene conservata sotto forma di energia chimica
mediante la formazione di un ATP o di un GTP e per
riduzione di 3 NAD+ e di un FAD+.
43
Il ciclo dell’acido citrico produce di per sé una sola
molecola di ATP per giro (nella conversione del
succinil-CoA a succinato).
Nelle 4 reazioni di ossidazione presenti nel ciclo
viene prodotto un grande flusso di elettroni che
entrano nella catena respiratoria, portando alla
formazione di un gran numero di molecole di ATP
nella fosforilazione ossidativa
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45
Nella fosforilazione ossidativa il passaggio di 2
elettroni dal NADH all’ossigeno porta alla
formazione di circa 2.5 molecole di ATP
Il passaggio di 2 elettroni dal FADH2 all’ossigeno
ne forma circa 1.5.
Questa stechiometria ci permette di calcolare il
numero totale di ATP dalla ossidazione completa
del glucosio.
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Quando le 2 molecole di piruvato sono ossidate
completamente a 6 molecole di CO2 dalle reazioni
del complesso della piruvato deidrogenasi e del
ciclo dell’acido citrico e gli elettroni vengono
trasferiti all’O2 dalla catena respiratoria,
si ottengono tramite la fosforilazione ossidativa
ben 32 molecole di ATP per molecola di glucosio
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Questo processo ciclico a 8 tappe necessario per
ossidare a CO2 il semplice gruppo acetilico a 2 atomi
di carbonio può sembrare una complicazione inutile e
soprattutto non in linea con il principio della
massima economia della logica molecolare delle
cellule.
La funzione del ciclo di Krebs non è però
esclusivamente quella di ossidare l’acetato; questa via
infatti è il cuore del metabolismo intermedio.
49
I prodotti finali a 4 o 5 atomi di carbonio di molti
processi catabolici entrano nel ciclo e possono servire
come sostanze nutrienti.
Per esempio, l’ossalacetato e l’a-chetoglutarato si
formano
rispettivamente
dall’aspartato e dal
glutammato quando vengono degradate le proteine
introdotte nell’organismo con la dieta.
In alcune situazioni, dal ciclo possono essere
prelevati intermedi per usarli come precursori in una
varietà di vie biosintetiche.
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Negli organismi aerobici, il ciclo dell’acido citrico è una via
anfibolica (serve sia ai processi anabolici sia a quelli
catabolici). Non soltanto agisce nel catabolismo dei
carboidrati, degli acidi grassi e degli aminoacidi, ma
produce anche precursori per molte vie biosintetiche
a-chetoglutarato = aspartato (prodotto
per transamminazione)
ossalacetato = glutammato
per transamminazione).
(prodotto
52
Attraverso l’aspartato e il glutammato, gli atomi di
carbonio dell’ossalacetato e dell’a-chetoglutarato vengono
usati per costruire altri aminoacidi, come pure i nucleotidi
purinici e pirimidinici.
L’ossalacetato viene convertito in glucosio nel processo della
gluconeogenesi.
Il succinil-CoA è
biosintesi dell’eme.
un
intermedio
fondamentale
nella
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Le reazioni anaplerotiche riforniscono il ciclo di Krebs di
intermedi.
In condizioni normali, esiste un bilanciamento quasi
perfetto tra le reazioni che rimuovono intermedi dal ciclo
e quelle che invece lo riforniscono, e quindi la
concentrazione di questi composti resta costante.
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La più importante reazione anaplerotica che avviene
nel rene e nel fegato è la carbossilazione reversibile del
piruvato per formare ossalacetato, catalizzata dalla
piruvato carbossilasi.
Quando
il
ciclo dell’acido citrico è povero
ossalacetato o di qualsiasi altro intermedio,
di
il piruvato viene carbossilato a
ossalacetato.
L’aggiunta enzimatica di un gruppo carbossilico alla
molecola del piruvato richiede energia, che viene
fornita dall’ATP; l’energia libera necessaria a legare
un gruppo carbossilico è quasi uguale a quella
ricavabile da una molecola di ATP.
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La piruvato carbossilasi
è un enzima regolatorio
ed è praticamente inattivo in assenza di Ac-CoA
(modulatore positivo).
Ogni qualvolta l’Ac-CoA è presente in eccesso stimola
la reazione della piruvato carbossilasi a produrre
più ossalacetato, consentendo quindi al ciclo di
utilizzare più Ac-CoA nella reazione della citrato
sintasi.
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La reazione della
piruvato carbossilasi
richiede
la biotina; questa vitamina è un trasportatore
specializzato di gruppi a un atomo di carbonio nella
loro forma più ossidata: la CO2
I gruppi carbossilici sono attivati in una reazione che
idrolizza ATP e lega CO2 all’enzima a cui è
legata la biotina. Questa CO2 “attivata” viene
quindi donata a un accettore in una reazione di
carbossilazione
58
La piruvato carbossilasi è composta da 4
subunità identiche, contenenti ognuna una
molecola di biotina legata covalentemente
mediante un legame amidico con il gruppo
aminico e di uno specifico residuo di
lisina.
La reazione procede in 2 fasi;
• prima il gruppo carbossilico derivato dall’HCO3- viene
legato alla biotina,
•poi il gruppo è trasferito al piruvato per formare
ossalacetato
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60
REGOLAZIONE DEL
CICLO DELL’ACIDO
CITRICO
61
Il ciclo dell’acido citrico è regolato a livello delle sue tre tappe
esoergoniche
Il flusso dei metaboliti attraverso il ciclo dell’acido citrico è sotto
stretto controllo.
Tre fattori governano la velocità del flusso attraverso il ciclo:
1.la disponibilità di substrato,
2.l’inibizione da accumulo di prodotti
3.l’inibizione allosterica retroattiva (a feedback) dei primi enzimi del
ciclo da parte degli ultimi intermedi.
Vi sono 3 tappe fortemente esoergoniche nel ciclo:
1. reaz. catalizzata dalla citrato sintasi
2. reaz. catalizzata dalla isocitrato deidrogenasi
3. reaz. catalizzata dalla a-chetoglutarato deidrogenasi
62
In condizioni normali la velocità della
citrico
glicolisi e del acido
sono coordinate in modo che la quantità di glucosio
metabolizzato a piruvato sia soltanto quella che poi entra nel ciclo
dell’acido citrico sotto forma di Acetil-CoA.
Piruvato, lattato e Acetil-CoA sono mantenuti a concentrazioni
stazionarie.
La velocità della glicolisi viene quindi adeguata a quella del ciclo
dell’acido citrico non soltanto dai livelli di ATP e di NADH, che sono
fase sia glicolitica sia respiratoria
dell’ossidazione del glucosio, ma anche dal citrato.
componenti della
Quest’ultimo, cioè il prodotto della prima tappa del ciclo, è anche un
inibitore allosterico della fosforilazione del fruttosio 6-fosfato da
parte della fosfofrutto chinasi-1 della via glicolitica.
63
Il ciclo del citrato come piattaforma girevole del metabolismo.
64
L‘ aconitasi funziona in condizioni vicine all' equilibrio, per cui la
velocità di consumo del citrato dipende dall'attività:
1.dell'isocitrato deidrogenasi NAD+-dipendente, che in vitro
viene fortemente inibita dal suo prodotto NADH.
2. La citrato sintasi viene anche inibita dal NADH, ma è meno
sensibile dell'isocitrato deidrogenasi alle variazioni della [NADH].
La citrato sintasi è anche inibita e dal citrato che compete con
l'ossalacetato)
3. l'inibizione dell‘a-chetoglurarato deidrogenasi da parte del
NADH e del succinil-CoA. Il succinil-CoA compete anche con
l'acetil-CoA nella reazione della citrato sintasi (inibizione
retroattiva competitiva).
Questo sistema di inibizioni combinate aiuta a mantenere
regolato il ciclo dell' acido citrico in modo coordinato.
65
Altri meccanismi regolatori
Studi in vitro riguardanti gli enzimi del ciclo dell'acido citrico
hanno permesso di identificare alcuni inibitori e attivatori
allosterici.
L’ADP è un attivatore allosterico dell'isocitrato deidrogenasi,
mentre l'ATP inibisce questo enzima.
Il Ca2+ oltre alle sue altre numerose funzioni cellulari, regola il
ciclo dell' acido citrico in diversi punti:
attiva la piruvato deidrogenasi fosfatasi, che a sua volta attiva il
complesso della piruvato deidrogenasi per la produzione di acetilCoA.
Il Ca2+, attiva anche l'isocitrato deidrogenasi e l‘a chetoglutarato
deidrogenasi
66
Regolazione
dell’acido
del ciclo
citrico.
Questo schema del ciclo
dell’acido
citrico,
che
comprende
anche
la
reazione
della
piruvato
deidrogenasi, indica i punti
di inibizione (ottagoni
rossi) e gli intermedi della
via
che
agiscono
da
inibitori
(frecce rosse
tratteggiate).
ADP e Ca++ (sfere verdi)
sono invece attivatori.
67
Così il Ca2+, il segnale che stimola la contrazione muscolare,
stimola anche la produzione dell'ATP che andrà a supportarla
Nel muscolo cardiaco, dove il ciclo dell' acido citrico è
attivo, il flusso dei metaboliti lungo il ciclo è proporzionale alla
velocità del consumo cellulare di ossigeno
Poiché il consumo di ossigeno, la riossidazione del NADH e la
produzione di ATP sono saldamente accoppiati, il ciclo dell'acido
citrico deve essere regolato da meccanismi retroattivi che
coordinino la produzione di NADH con il consumo di energia.
68
I più importanti regolatori del ciclo
dell'acido citrico sono i suoi substrati,
l'acetil-CoA e l'ossalacetato, e il suo
prodotto, NADH.
69
Sia l'acetil-CoA sia l'ossalacetato sono
presenti nei mitocondri a una concentrazione
che non è in grado di saturare la citrato
sintasi.
l flusso metabolico lungo questo enzima varia quindi
in funzione della concentrazione di substrato e viene
controllato dalla disponibilità di quest'ultimo.
Si è già visto che la produzione di acetil-CoA a
partire da piruvato viene regolata dall' attività della
piruvato deidrogenasi.
70
. La concentrazione di ossalacetato, che è in
equilibrio con il malato, fluttua a seconda del
rapporto [NADH]/[NAD+] seguendo l'espressione
all'equilibrio
K = [ossalacetato][NADH]
[malato] [NAD+]
Se, per esempio, aumenta il carico di lavoro del
muscolo e la respirazione, nei mitocondri la [NADH]
diminuisce.
Il conseguente aumento della [ossalacetato] stimola
l'attività della citrato sintasi, che controlla la
velocità di formazione del citrato.
71
Diversamente da quanto accade agli enzimi
che limitano la velocità della glicolisi e del
metabolismo del glicogeno, i quali regolano il
flusso mediante
• elaborati sistemi di controllo allosterico
• cicli del substrato
• modificazioni covalenti
gli enzimi regolatori del ciclo dell' acido
citrico sembrano controllare il flusso
principalmente
mediante
tre
semplici
meccanismi:
72
(1) disponibilità di substrato
(2) inibizione da prodotto
(3) inibizione retroattiva competitiva da parte di
intermedi prodotti più avanti lungo il ciclo
73
74
fine
75
