CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL
FARMACO
Adriana Maggi
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
LEZIONE 8
BIOFARMACI E PROTEINE TERAPEUTICHE: PROBLEMATICHE
LEGATE ALLA LORO FARMACOCINETICA/DINAMICA
PROTEINE TERAPEUTICHE DI PRIMA GENERAZIONE
• INSULINA
• FATTORI DI CRESCITA DELL’EMATOPOIESI
• INTERLEUCHINE ED INTERFERONI
• ORMONE DELLA CRESCITA
• ENZIMI
• (ANTICORPI MONOCLONALI)
• (VACCINI)
• FATTORI DELLA COAGULAZIONE
PROTEINE TERAPEUTICHE DI PRIMA GENERAZIONE
NOME
COMMERCIALE
PROTEINA
TERAPEUTICA
AZIENDA
FARMACEUTICA
PRINCIPALE
INDICAZIONE
TERAPEUTICA IN USA
ANNO
HUMULIN
INSULINA UMANA
ELI LILLY
DIABETE
1982
PROTROPIN
ORMONE SOMATOTROPO
GENENTECH
DEFICIENZA GH
1985
INTRON A
INTERFERONE
ALFA 2b
SHERING-PLOUGH
LEUCEMIA A CELLULE
CAPELLUTE
1986
ROFERON A
INTERFERONE
ALFA 2a
HOFFMANNLA ROCHE
LEUCEMIA A CELLULE
CAPELLUTE
1986
HUMATROPE
ORMONE SOMATOTROPO
ELI LILLY
DEFICIENZA GH
1987
ACTIVASE
TPA
GENENTECH
INFARTO CARDIACO
1987
EPOGEN
ERITROPOIETINA
AMGEN
ANEMIA RENALE
1989
ALFERON N
INTERFERONE
ALFA N3
INTERFERON
SCIENCES
PORRI
GENITALI
1989
NEUPOGEN
G-CSF
AMGEN
NEUTROPENIA DA
CHEMIOTERAPIA
1991
PROTEINE TERAPEUTICHE DI PRIMA GENERAZIONE
NOME
COMMERCIALE
PROTEINA
TERAPEUTICA
AZIENDA
FARMACEUTICA
PRINCIPALE
INDICAZIONE
TERAPEUTICA IN USA
ANNO
LEUKINE
GM-CSF
IMMUNEX
TRAPIANTO MIDOLLO
AUTOLOGO
1991
PROLEUKIN
IL-2
CHIRON
CARCINOMA
RENALE
1992
RECOMBINATE
FATTORE
ANTIEMOFILIA
GENETIC
INSTITUTE
EMOFILIA A
1992
KOGENATE
FATTORE VIII
MILES
EMOFILIA A
1993
BETASERON
INTERFERONE
BETA 1-B
CHIRON
SCLEROSI MULTIPLA
1993
PULMOZYME
DNasi
GENENTECH
FIBROSI CISTICA
1993
NUTROPIN
GH
GENENTECH
DEFICIENZA CRESCITA
DA INSUFFICIENZA
RENALE
1994
CEREZYME
GLUCOCEREBROSIDASI
GENZYME
MALATTIA DI GAUCHER
1994
GONAL-F
FSH
SERONO
INFERTILITA’
1996
PROTEINE TERAPEUTICHE DI PRIMA GENERAZIONE
NOME
COMMERCIALE
PROTEINA
TERAPEUTICA
AZIENDA
FARMACEUTICA
PRINCIPALE
INDICAZIONE
TERAPEUTICA IN USA
ANNO
AVONEX
INTERFERONE
BETA 1a
BIOGEN
SCLEROSI
MULTIPLA
1996
BENEFIX
FATTORE IX
GENETICS
INSTITUTE
EMOFILIA B
1997
INFERGEN
INTERFERONE
ALFACON-1
AMGEN
EPATITE C
1997
NOVOSEVEN
FATTORE VIIa
NOVO
NORDISK
EMOFILIA A e B
1999
REFACTO
FATTORE VIII
GENETICS
INSTITUTE
EMOFILIA A
2000
ACTIMMUNE
INTERFERONE
GAMMA 1b
INTERMUNE
OSTEOPETROSI
2000
Le proteine terapeutiche oggi disponibili sono utilizzabili nella terapia di
patologie quali:
Neoplasie (interferoni, anticorpi monoclonali
Patologie cardiovascolari, fibrosi cistica, morbo di Gaucher (Enzimi,
fattori ematici)
Diabete (Insulina)
Anemia (Eritropoietina)
Emofilia (fattori ematici di coagulazione)
Le terapie con proteine terapeutiche di maggiore utilizzo nel 2003 sono
state:
Johnson & Johnson Procrit trattamento per anemie
Amgen Epogen trattamento anemia
Schering-Plough: Intron A and Peg-Intron per il trattamento
dell’epatite
Oggi le classi terapeutiche più utilizzate sono:
Eritropoietina
Anticorpi monoclonali
Interferoni
FARMACOCINETICA E FARMACODINAMICA
DOSE
ASSORBIMENTO
FARMACO LEGATO A PROTEINA
DISTRIBUZIONE
CONCENTRAZIONE PLASMATICA
ELIMINAZIONE
FARMACO LEGATO A TESSUTO
CONCENTRAZIONE TISSUTALE
METABOLISMO
ED ESCREZIONE
FARMACO NEL COMPARTIMENTO
DI EFFETTO
FARMACO LEGATO A
RECETTORE/EFFETTORE
EVENTI POSTRECETTORIALI
RISPOSTA
FARMACOLOGICA
EFFETTO
BIOCHIMICO
ASPETTI FARMACOCINETCI E FARMACODINAMICI
DI FARMACI PROTEICI O PEPTIDICI
LA FARMACOCINETICA STUDIA
LA CINETICA DEI PROCESSI
RESPONSABILI DELLA
VARIAZIONE TEMPORALE DEI
LIVELLI DEI COMPOSTI ESOGENI
NELL’ORGANISMO
I PROCESSI SONO:
•ASSORBIMENTO
•DISTRIBUZIONE
•METABOLISMO
•ESCREZIONE
IMPORTANZA DELLA RELAZIONE
TRA ASPETTI FARMACOCINETICI
E FARMACODINAMICI
NELL’AZIONE DI UN FARMACO
SOMMINISTRAZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE
1) VIA ORALE
2) VIA PARENTERALE
3) VIE ALTERNATIVE
ENDOVENOSA
INTRAMUSCOLARE
SOTTOCUTANEA
INTRAPERITONEALE
TRANSNASALE
BUCCALE
RETTALE
TRANSDERMICA
POLMONARE
SOMMINISTRAZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE
VIA ORALE
controindicata a causa di:
A. ELEVATA DEGRADAZIONE
•Endopeptidasi presenti a livello intestinale
(pepsina, tripsina, chimotripsina, elastasi)
•Esopeptidasi (carbossipeptidasi A e B)
B. SCARSO ASSORBIMENTO
•Molecole di grande dimensioni
•Assenza di meccanismi di trasporto attivo
ECCEZIONE: VACCINI ORALI
le cui cellule bersaglio sono linfociti e antigen presenting
cells (APC) presenti nelle PLACCHE DEL PAYER
lume intestinale
cellule M
centro germinale
(area delle cellule B)
parete intestinale
cellule
epiteliali
FOLLICOLO LINFOIDE:
gruppo di cellule
contenenti
le cellule M disperse
in cellule epiteliali
SOMMINISTRAZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE
VIA PARENTERALE
via d’elezione:
La scelta della via endovenosa,intramuscolare,
sottocutanea e intraperitoneale dipende dall’emivita
della proteina stessa e dalla concentrazione ematica
necessaria per ottenere l’effetto farmacologico
Es: l’emivita del TPA è di pochi minuti, mentre quella di un
anticorpo monoclonale è di alcuni giorni
SOMMINISTRAZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE
PER AUMENTARE
L’EMIVITA
si possono operare
modificazioni nella proteina
(mutagenesi)
si può passare dalla somministrazione per via i.v. a quella i.m.
o s.c. tenendo conto che:
1. La prolungata residenza nel sito d’iniezione
aumenta l’esposizione a reazioni di degradazione
(es.”insulino-resistenza” di diabetici dovuta ad alte
concentrazioni di peptidasi tissutali)
2. Dopo iniezione s.c. il farmaco può entrare nei capillari
linfatici e non utilizzare il torrente circolatorio dando una
differente biodisponibilità
SOMMINISTRAZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE
VIE ALTERNATIVE:
POLMONARE
TRANSDERMICA
TRANSNASALE
Nel caso di una azione sistemica queste vie
hanno limitata rilevanza, mentre possono
essere valide qualora sia richiesta una
azione locale.
IMPORTANZA VIA NASALE
ASSORBIMENTO DI PROTEINE TERAPEUTICHE
Aumento della resistenza
contro la degradazione (attraverso
modificazioni della struttura molecolare)
APPROCCI PER
AUMENTARE
ASSORBIMENTO
Diminuzione attività
peptidasica nel sito di
assorbimento
(attraverso l’uso di inibitori di proteasi)
Aumento tempo d’esposizione
(con PEG-polietilenglicol)
Aumento permeabilità delle barriere d’assorbimento
(attraverso
iontoforesi, uso liposomi, aggiunta di acidi grassi/fosfolipidi,acidi biliari, enamine derivate dalla fenilglicina, detergenti,
derivati salicilici, ciclodestrine)
Approcci per il controllo della velocità di
somministrazione
SISTEMI APERTI:
•POMPE MECCANICHE
•POMPE OSMOTICHE
SISTEMI CHIUSI:
•COMBINAZIONI POMPE BIOSENSORI
•SISTEMI AUTOCALIBRANTI
•CELLULE SECRETORIE MICROINCAPSULATE
POMPE MECCANICHE
• SOMMINISTRAZIONE PULSATILE
•
INFUSIONE CONTINUA
• TEMPI FLESSIBILI
Problemi:
1.
2.
3.
Controllo del flusso (erogazione corrente,flusso nell’ago, perdita liquido dal
catetere…)
Stabilità del farmaco a lungo termine (il farmaco deve essere stabile a
t°ambiente e a 37 C°)
Anche con le pompe più sofisticate è necessario raccogliere dati per
aggiustare il flusso (questo implica la raccolta invasiva di fluidi corporei)
POMPE OSMOTICHE
SOLUZIONE DI FARMACO
USCENTE
ESEMPIO DI MINIPOMPA
OSMOTICA IMPIANTABILE
SOTTOCUTANEA
CAPPUCCIO RIMUOVIBILE
MODERATORE DEL FLUSSO
MEMBRANA SEMIPERMEABILE
(DOVE ENTRA ACQUA)
AGENTE OSMOTICO
MEMBRANA IMPERMEABILE
DEL RESERVOIR
RESERVOIR
Problemi:
1.
2.
Controllo del flusso (la velocità di rilascio
è costante, condizione non sempre
desiderabile)
Stabilità del farmaco (la
dispersione/soluzione di proteina
deve essere stabile alla temperatura
corporea)
SISTEMI AUTOCALIBRANTI
il rilascio della proteina viene controllato da
uno stimolo corporeo attraverso diverse strategie
COMPETITIVE DESORPTION
concavalinaA
beads di sefarosio
concavalinaA
GLUCOSIO
concavalinaA
beads di sefarosio
concavalinaA
INSULINA
REAZIONI ENZIMA
SUBSTRATO
Sono basati sul
cambiamento di pH
quando il glucosio
viene convertito in
ac.gluconico.
Il pH induce cambiamenti
nei polimeri acidosensitivi che iniziano
così a rilasciare
insulina.
CELLULE SECRETORIE MICROINCAPSULATE
CELLULE
PRODOTTI DI SECREZIONE
PORI DELLA
MEMBRANA
NUTRIENTI
E’ preferibile l’uso di una membrana che escluda le componenti umorali
e cellulari del sistema immunitario per permettere alla cellule di vivere
senza l’ausilio di agenti immunosuppressivi
SOMMINISTRAZIONE SITO-SPECIFICA
ANTICORPI MONOCLONALI UMANIZZATI
ANTICORPI BISPECIFICI
ANTICORPI CONIUGATI CON COMPOSTI ATTIVI
LIPOSOMI
BIODISTRIBUZIONE DI FARMACI PROTEICI
A differenza dei farmaci sintetici, per i quali lo studio
della biodistribuzione è necessario per evitare l’accumulo
di metaboliti tossici in particolari tessuti, la
biodistribuzione di proteine terapeutiche indica solo
l’avvenuta distribuzione del farmaco in un particolare
tessuto, dato che gli aminoacidi della proteina possono
essere riutilizzati
La misurazione della biodistribuzione viene effettuata con
farmaci marcati (presenza di tirosine e lisine)
La difficoltà nell’eseguire studi di biodistribuzione impone di
utilizzare l’intensità e la durata dell’effetto farmacologico
come prova e misura dei livelli di un farmaco in un particolare
tessuto
BIODISTRIBUZIONE DI FARMACI PROTEICI
SANGUE
DRUG
La biodistribuzione nei vasi linfatici dopo
iniezione s.c. rappresenta l’unico meccanismo di
trasporto per macromolecole, che raggiungono il
torrente circolatorio indirettamente attraverso
il sistema linfatico: composti con P.M. maggiore
di 16kD vengono assorbiti dai vasi linfatici,
mentre i composti inferiori a 1kD non vi
penetrano quasi per nulla
SITO
D’INIEZIONE
LINFA
ELIMINAZIONE DI FARMACI PROTEICI
1. PROTEOLISI
2. ESCREZIONE E METABOLISMO RENALE
3. METABOLISMO EPATICO
4. ELIMINAZIONE RECETTORE-MEDIATA
AD OPERA DI ALTRE CELLULE
ELIMINAZIONE RENALE DI PROTEINE
• Solo per piccole proteine (P.M.<68kD,raggio>20nm)
• La clearance renale è più alta per molecole caricate positivamente rispetto a quelle caricate
negativamente
• Dopo la filtrazione glomerulare le proteine possono essere riassorbite dal tubulo prossimale tramite
endocitosi e,una volta idrolizzate nelle cellule ad amminoacidi, ritornare nel circolo sistemico.
Tubulo Distale
Tubulo Prossimale
Filtrato Glomerulare
Glomerulo
Proteine
Lume
Angiotensina
Bradichinina
Lisosomi
IL-2
Insulina
Calcitonina
Ormone paratiroideo
vasopressina
Recettore
Non mediato
proteine
aminoacidi
Vaso Peritubulare
proteine
METABOLISMO EPATICO
Endocitosi mediata da
recettore (per insulina ed EGF)
Trasporto energiadipendente (per peptidi di
dimensioni più elevate)
Proteine correlate al
recettore per LDLLRP (per t-PA, u-PA,
trombospondina)
Recettori che legano gli
zuccheri (per glicoproteine)
Diffusione passiva
solo
per piccole proteine molto idrofobiche
quali ciclosporina e peptidi ciclici)
(
METABOLISMO EPATICO
La velocità di eliminazione intra-epatocita
dipende dalla sequenza proteica e dalla presenza
di siti di riconoscimento di endopeptidasi
Proteine a vita media elevata sono degradate in
lisosomi
Gli oligopeptidi risultanti dall’attacco di
endopeptidasi sono ulteriormente degradati da
esopeptidasi e poi rientrano nel pool metabolico
cellulare
ELIMINAZIONE RECETTORE-MEDIATA
AD OPERA DI ALTRE CELLULE
G-CSF
e un suo derivato
(nartograstima) sono
captati dal midollo
osseo attraverso un
processo saturabile
recettore mediato
M-CFS
viene eliminato dai reni
quando è presente in elevate
quantità: a concentrazioni
minori viene captato dai
macrofagi con un
meccanismo recettore
mediato saturabile
PROTEINE DI LEGAME PLASMATICHE
Riportate per IGF-I, IGF-II,
t-PA, GH, Dnase,NGF…
Il legame di proteine terapeutiche a
proteine circolanti nel plasma rende
particolarmente complesse le cinetiche di
distribuzione ed eliminazione
ASPETTI FARMACODINAMICI DI
FARMACI PROTEICI
La costruzione di curve DOSE-RISPOSTA è
particolarmente utile nella sperimentazione di
fase II dato che aiuta a scegliere la dose
ottimale per la fase III
Si ritiene che i farmaci biotecnologici
manifestino talora una curva dose-risposta a
campana
SCALING INTERSPECIE
Le tecniche per la predizione di parametri
farmacocinetici in una specie da dati derivanti da
una specie diversa usando equazioni allometriche
permettono di stimare il range di dosi da
studiare, anche se non possono sostituire gli studi
stessi.
P= a.Wb
P:
W:
a:
b:
parametro farmacocinetico
peso corporeo
coefficiente allometrico
esponente allometrico
IMMUNOGENICITA’
LA FORMAZIONE DI ANTICORPI AVVIENE IN GENERE DOPO
SOMMINISTRAZIONE CRONICA DI PROTEINE TERAPEUTICHE
Gli anticorpi possono neutralizzare
l’attività biologica
della proteina e possono
modificarne la farmacocinetica
e farmacodinamica
La risposta immunitaria viene di solito indotta
quando la proteina è estranea all’ospite:
inoltre le iniezioni extravascolari
stimolano maggiormente
la produzione di anticorpi rispetto
alla somministrazione per endovena
FORMULAZIONE DI PROTEINE/PEPTIDI
TERAPEUTICI
1.STERILITA’: la produzione deve essere fatta in
condizioni di sterilità per l’impossibilità di utilizzare sistemi
di sterilizzazione quali radiazioni ionizzanti, gas e calore
2.DECONTAMINAZIONE VIRALE: analisi dei
m.o. e cellule deputate alla produzione. Rischio nell’utilizzo di
eccipienti derivati ematici (albumina)
3. RIMOZIONE PIROGENI: generalmente derivanti da batteri,
funghi, virus che contaminano la preparazione (endotossine da Gram negativi quali LPS). In
genere sono caratterizzati da carica negativa elevata. Stabili in condizioni standard di
sterilizzazione in autoclave, vengono distrutti in presenza di temperature elevate a secco
(>250° per 30 min.)
STRUTTURA DI UNA ENDOTOSSINA
n
lipideA
core
catena antigenica
lipopolisaccaride
Acido grasso
fosfato
zucchero
ECCIPIENTI USATI NELLA FORMULAZIONE DI
PRODOTTI BIOTECNOLOGICI
1) AGENTI SOLUBILIZZANTI
2) AGENTI ANTIAGGREGANTI
3) AGENTI PER IL MANTENIMENTO DEL pH
4) CONSERVANTI ED ANTIOSSIDANTI
5) AGENTI OSMOTICI
6) TAMPONI
7) CARRIERS
CONSERVANTI ED ANTIOSSIDANTI
Per il blocco dell’ossidazione di metionina, cisteina, triptofano, tirosina e
istidina in genere l’ossigeno viene sostituito con un gas inerte o tramite
l’aggiunta di ascorbato.
AGENTI ANTIAGGREGANTI
Sono necessari per ridurre l’assorbimento della proteina terapeutica alle
superfici della fiala, siringa, ago….
Es.assorbimento insulina su superficie idrofobica
Superficie idrofobica
aggregati insolubili
monomeri
cristalli
AGENTI SOLUBILIZZANTI
SOLUBILITA’
Bloccano l’aggregazione di proteine, soprattutto non glicosilate e ne evitano la
precipitazione limitando interazioni idrofobiche e/o elettrostatiche.
Il pH ha notevole importanza nel mantenimento del prodotto in soluzione: l’aggiunta
di aminoacidi come lisina o arginina o di surfattanti come sodiododecilfosfato
possono aumentare la solubilità.
ARGININA-FOSFATO
Es.Effetto della concentrazione
di arginina
sulla solubilità del TPA
AGENTI OSMOTICI
Si tratta di soluzioni saline e di mono/disaccaridi.
Possono influenzare la termostabilità della proteina.
AGENTI PER IL MANTENIMENTO DEL pH
hGH mg/ml
Tamponi usati per la formulazione di prodotti
biotecnologici sono di solito fosfato, acetato, citrato
4
5
pH
Es. Solubilità del GH in
funzione della variazione
di pH
CONSERVAZIONE DELLE PROTEINE TERAPEUTICHE
SOLUZIONE ACQUOSA
TAVOLETTE
FORME LIOFILIZZATE
BIBLIOGRAFIA
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•Witschi et al.”In vitro evaluation of microparticles and polymer gels for use as
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