FORMAZIONE DEL PATTERN ASSIALE
GENERAZIONE DI MUTANTI
MUTAGENESI CHIMICA
MUTAGENESI PER INSERZIONE
MUTAGENESI CHIMICA può essere condotta direttamente sui semi.
chimici
MUTAGENI
esteri dell’acido
etilmetansulfonico (EMS)
caffeina, nicotina
radiazioni
EMS alchila le G
Agenti
alchilanti
UV, raggi X
radiazioni a, b, g
la G alchilata si appaia con T invece che con C
MUTAGENESI PER INSERZIONE: TRASPOSONI , T-DNA
MUTAGENESI CHIMICA DEI SEMI
Vengono utilizzati semi maturi, con gli
embrioni completamente sviluppati.
Si trattano i semi con il mutageno
Mutazioni a carico di una cellula
producono una linea clonale di cellule
mutate, durante il successivo sviluppo
post-embrionale con il conseguente
sviluppo di piante eterozigoti con settori
mutanti. (M1)
Solo se i settori mutati includono lo strato
L2 del meristema apicale, da cui sarà
generata la linea germinale della pianta
matura, la mutazione passerà alla
successiva progenie. I fiori mutanti
produrranno (autofecondazione) il 25% di
semi omozigoti riconoscibili per il loro
fenotipo aberrante.
confronto tra mutagenesi chimica e
mutagenesi per inserzione
MEDIANTE LA MUTAGENESI PER INSERZIONE
IL GENE VIENE “ETICHETTATO”
(GENE TAGGING), PERMETTEDONE
UNA IDENTIFICAZIONE PIU AGEVOLE
Strategia di isolamento di mutanti
Trasformazione con
T-DNA
Raccolta semi T1
T0
Selezione in serra
dei trasformanti T1
Autoimpollinazione
T2
Ks
Kr
Analisi in vitro
delle plantule
Kan resistenti
Raccolta semi T2
• Analisi dei mutanti Kan resistenti
• Propagazione delle piante
Identificazione delle sequenze fiancheggianti il DNA inserito
gene x
T-DNA
gene x
PCR inversa
T-DNA o DS
primers
RB
Recupero del
plasmide
T-DNA
Ori
KanR
LB
GENE
EcoRI
EcoRI
T-DNA
RB
pBR322
KanR
LB
EcoRI
EcoRI
Digestione con EcoRI
T-DNA
RB
EcoRI
pBR322
KanR
LB
EcoRI
Recupero del
plasmide
Ligazione
Trasformazione E. coli
Su terreno selettivo contenente Kanamicina
cresceranno solo le colonie che hanno
acquisito il plasmide
Da queste sarà possibile recuperare il
plasmide e sequenziarlo
Mutanti MONOPTEROS (MP)
•La mutazione produce piantine che mancano di ipocotile e radice ma che hanno la
regione apicale
•Tuttavia la struttura delle regioni apicali non è normale e i tessuti dei cotiledoni
sono disorganizzati
•Embrioni dI mutanti mp non formano il procambio nella parte basale dell’embrione
globulare, la regione che dà luogo all’ipocotile e alla radice
I DIFETTI COMPAIONO NELLO STADIO DI OTTANTE
STADI DI SVILUPPO DI MONOPTEROS
I mutanti bodenlos e AXR6 hanno un fenotipo simile a monopteros
Funzione del gene MONOPTEROS
(formazione della radice embrionale)
il meristema radicale (cq, columella)
in Arabidopsis origina da una singola cellula: l’ipofisi
L’ipofisi si differenzia a partire da una cellula extraembrionale e ciò richiede
l’espressione di due geni: MONOPTEROS (MP) e BODENLOS (BD)
I trascritti di MP e BD si accumulano in cellule del proembrione adiacenti alla cellula
extraembrionale che si differenzierà in ipofisi
MP e BD sono dei fattori di trascrizione coinvolti nella risposta all’auxina
MP appartiene alla classe dei fattori di trascrizione ARF (ARF5) regolatori positivi
della risposta a IAA
BD appartiene alla classe delle proteine IAA (IAA12) regolatori negativi della
risposta all’auxina
Destino differenziativo
delle due cellule del’embrione
bicellulare
cellula basale
cellula apicale
Il meristema apicale della radice ha un’origine mista
Regolazione dell’espressione genica da parte dell’auxina
Geni di risposta primaria (geni precoci):
l’espressione è indotta dalla attivazione di fattori di trascrizione già presenti
(non è necessaria sintesi proteica)
(oppure dalla inattivazione di inibitori della trascrizione preesistenti)
Tali geni codificano per FATTORI DI TRASCRIZIONE i quali determinano
l’espressione dei
Geni di risposta secondaria (geni tardivi)
(Per l’espressione di tali geni e quindi per la risposta è
necessaria nuova sintesi proteica)
5 classi principali di geni precoci la cui
trascrizione è indotta da IAA
1. Proteine AUX/IAA
2. Proteine SAUR
3. Proteine GH3
4. Glutatione S-trasferasi
5. ACC sintasi
Le proteine AUX/IAA
auxin response factors: ARF
auxin responsive elements: TGTCTC
Regolazione dell’ espressione genica da parte dell’auxina
IAA signaling: regolato dalla via del
proteosoma /ubiquitina
Via del proteosoma/
ubiquitina
E1 enzima attivante l’ubiquitina
E2 enzima coniugante l’ubiquitina
E3 enzima legante l’ubiquitina
IAA: induce la trascrizione dei geni precoci
promuovendo la degradazione di repressori
AUX/IAA mediata dal PROTEOSOMA
consentendo la formazione di dimeri ARF attivi
Feedback negativo: tra i geni precoci indotti
da IAA ci sono le proteine AUX/IAA
Mutante TIR-1
TIR1: proteina F-box (F-box N-terminale/LRR C terminale)
E3: 4 subunità = Cullin1/Cdc53
Skp/ASK1
Rbx1/ROC1/Hrt1
F-box
In Arabidopsis:
23 ARF
28 AUX IAA
La maggior parte delle AUX IAA funzionano come repressori della trascrizione
di geni indotti da IAA
Identificate 8 mutazioni in AUX IAA che influenzano lo sviluppo embrionale
Sono tutte relative a mutazioni di singoli aacidi nel dominio II di degradazione
delle proteine AUX IAA (proteosoma)
Acquisizione di resistenza alla degradazione tramite la via del Proteosoma
BODENLOS (IAA12): il fenotipo dei mutanti assomiglia ai mutanti mp
Codifica per una forma mutata di proteina AUX/IAA (IAA12)
(repressore della risposta all’auxina)
La forma mutata è resistente alla degradazione mediata dal proteosoma e
indotta dall’auxina che è necessaria per la risposta differenziativa
I mutanti mp e bdl hanno difetti nel piano di divisione dell’ipofisi sebbene le proteine
vengano espresse nelle cellule superiori adiacenti
Meccanismo non-cell autonomous
Cell to cell signaling
Modello per la formazione della radice embrionale:
L’auxina si accumula nella ipofisi prima del suo differenziamento
Questo accumulo richiede la localizzazione polare del carrier di efflusso PIN1 nelle
cellule adiacenti del proembrione
L’auxina è il segnale generato dall’interazione MP/BD
PIN1 è espresso nelle stesse cellule in cui vengono espressi MP e BD
Gene reporter
GUS (or GFP)
TGTCTC
AuxRE
The DR5 reporter construct is
widely used to monitor auxin
response-level.
Hours of
staining
DR5 consists of seven repeats of
an auxin-response element
(AuxRE) which is a binding site
for auxin-responsive transcription
factors (ARFs).
Auxin-response level increases
with exogenous auxin (NAA)
Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., and Guilfoyle, T.J. (1997). Aux/1AA proteins repress expression of reporter genes
containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell 9: 1963-1971.
AUXINA
(segnale primario nelle cellule adiacenti l’ipofisi)
MP e BDL agiscono in maniera non-cell autonomous
Rilascio di un segnale secondario nell’ipofisi
AUXINA? (trattamenti con 2,4 D di bdl inefficaci)
fattori di trascrizione TOM (targets of monopteros)
espressi nellle stesse cellule di MP e BDL:
TOM3 migra nell’ipofisi
MUTANTI AXR6
mostrano lo stesso fenotipo di mp e bdl
AXR6 codifica per CULLIN 1 del complesso E3
Mutanti GNOM
• Piantine omozigoti gnom mancano di radici e cotiledoni
• I difetti nell’embrione appaiono alla prima divisione dello zigote e rimangono
per tutta l’embriogenesi
• I mutanti più estremi sono sferici
• abolita completamente la polarità assiale
GNOM necessario per la determinazione
della polarità assiale
SVILUPPO DEL MUTANTE gnom
WT
gnom
Il fenotipo dei mutanti gnom è simile
a quello dei doppi mutanti mpbdl
Ridotta capacità di risposta all’auxina?
In embrioni di Brassica juncea il fenotipo gnom può essere
fenocopiato con inibitori del trasporto di auxina
Funzione del gene GNOM
GNOM codifica per un fattore di scambio GTP/GDP che si associa a piccole
proteine G della classe ARF (ARF-GEF)
Le proteine ARF (ADP ribosylation factor) sono coinvolte nella regolazione
del trafficking intracellulare delle vescicole
In Arabidopsis GNOM (EMB30) controlla la localizzazione del carrier per l’auxina PIN1
durante l’embriogenesi
Mutazioni gnom aboliscono il trasporto polare dell’auxina nell’embrione
ADP ribosilazione
Complessi
GEF-ARF
Formazione di vescicole nel TGN
ARF serve a reclutare proteine di rivestimento sulle vescicole
Modello per il trafficking di proteine
In Arabidospis
I geni GNOM determinano la distribuzione dei carrier di efflusso di IAA
(proteine PIN)
PIN1
TIBA e NPA (inibitori del trasporto di IAA) possono interferire con il riciclo di PIN
The PIN proteins are named for the pin-formed
mutant
pin-formed, which has a
mutation in the PIN1 gene,
makes some abnormal leaves
and then a bare inflorescence.
Galweiler, L., Guan, C., Muller, A., Wisman, E., Mendgen, K., Yephremov, A., and Palme, K. (1998). Regulation of polar auxin transport by AtPIN1 in Arabidopsis
vascular tissue. Science 282: 2226 – 2230, reprinted with permission from AAAS.
PIN auxin efflux carriers are encoded by a large
gene family with cell-specific expression patterns
PIN
Křeček , P., Skůpa , P., Libus, J., Naramoto, S., Tejos, R., Friml J., and Zažímalová, E. (2009) The PINFORMED (PIN) protein family of auxin transporters. Genome Biology 10: 249.
PIN proteins orient asymmetrically in plant cells
PIN1 localizes to
the lower
surface of root
cortex cells
Root
Base
PIN1 is
responsible for
auxin flow from
shoot apex to
root apex.
Root
Apex
Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Dhonukshe, P., et al. (2008). Generation of cell polarity in plants links endocytosis, auxin distribution and cell fate
decisions. Nature 456: 962-966. Reproduced with permssion from Dolan, L., et al. (1993). Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development 119: 71-84.
PIN proteins orient differently
PIN2 localizes to the lower
surface of root cortex cells
and the upper surface of
epidermal cells.
PIN2 is functions
primarily in the
redistribution of
auxin during root
gravitropism
Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Dhonukshe, P., et al. (2008). Generation of cell polarity in plants links endocytosis, auxin distribution and cell fate
decisions. Nature 456: 962-966. Reproduced with permssion from Dolan, L., et al. (1993). Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development 119: 71-84.
The distribution of PIN proteins contributes to the
auxin gradients
Křeček , P., Skůpa , P., Libus, J., Naramoto, S., Tejos, R., Friml J., and Zažímalová, E. (2009) The PINFORMED (PIN) protein family of auxin transporters. Genome Biology 10: 249.
PIN protein distributions contribute to auxinmediated patterns
Amongst other things,
they specify the
location of auxin
maxima necessary for
embryonic patterning.
Reproduced with permission from Petrášek, J., and Friml, J. (2009) Auxin transport routes in plant development. Development 136: 2675-2688.
PIN proteins can move very dynamically within
cells and tissues
Unlike the more stablyoriented ABCB proteins, PIN
proteins can rapidly change
their positions within cells.
Reprinted from Heisler, M.G., et al. (2005). Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the
Arabidopsis inflorescence meristem. Curr. Biol. 15: 1899–1911, with permission from Elsevier.
PIN proteins cycle between plasma membrane
and endosome
PIN proteins continually cycle
between the plasma membrane
and endosomal compartments.
endosome
Plasma
membrane
Redrawn from Kleine-Vehn, J., et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by PINOID kinase-mediated
recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21: 3839-3849.
Brefeldin A blocks endocytosis and traps PIN
proteins
Brefeldin A (BFA) prevents endosomes from
fusing with the plasma membrane, trapping
PIN in the endosomal compartments.
Control
BFA treatment
Redrawn and reprinted from Kleine-Vehn, J., et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by PINOID kinasemediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21: 3839-3849.
The phosphorylation state of PINs affects their
distribution
P
P
P P
PIN proteins are phosphorylated
by the protein kinase PINOID
(PID) and dephosphorylated by the
protein phosphatase PP2A.
P
P
PP2A
PID
Control
Staurosporine
treated
Staurosporine
inhibits protein
kinases
Sukumar, P., Edwards, K.S., Rahman, A., DeLong, A., and Muday, G.K. (2009). PINOID kinase regulates root gravitropism through modulation of PIN2-dependent
basipetal auxin transport in Arabidopsis. Plant Physiol. 150: 722-735. Redrawn from Kleine-Vehn, J., et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by
PINOID kinase-mediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21: 3839-3849.
ABCB proteins may stabilize PIN proteins within
membrane domains
ABCB19
Plasma
Membrane
protein
Orange =
overlap
The ABCB proteins seem to stay in the plasma membrane, unlike the
PIN proteins. An interaction between the two transporters may
contribute to stabilizing PINs.
Titapiwatanakun, B., and Murphy, A.S. (2009) Post-transcriptional regulation of auxin transport proteins: cellular trafficking, protein phosphorylation, protein maturation,
ubiquitination, and membrane composition. J. Exp. Bot. 2009 60: 1093-1107, by permission of the Society for Expiremental Biology.
LOCALIZZAZIONE DI PIN1 e PIN7
Stadio precoce
IAA
IAA
Stadio globulare
Localizzazione di PIN1 e PIN7
nello stadio precoce globulare
e correlazione con la concentrazione
di auxina
Localizzazione dell’auxina nel mutante gnom
Mutanti GURKE
(pasticcino3)
Plantule omozigoti gurke sono prive dei cotiledoni mentre
rimangono l’ipocotile e la radice
Le plantule assomigliano a dei piccoli cetrioli (gurke)
Funzione del gene GURKE
Il gene GURKE codifica per la acetil-CoA carbossilasi 1 (citosolica)
I mutanti gurke possono essere complementati dall’aggiunta di malonato
Complementazione della mutazione acc1 (gurke like) con malonato
embrioni immaturi di arabidopsis espiantati dalla siliqua e coltivati in vitro
3 mM malonato
Sviluppo di embrioni del mutante pasticcino3 (gurke like) durante la germinazione
complementazione da malonato
1mM malonato
Biosintesi degli acidi grassi
malonato + CoA
malonilCoA sintetasi
malonilCoA
ACCasi: catalizza la formazione di malonil-Coa da Acetil-Coa e CO2
2 forme: citosolica (omodimerica): allungamento acidi grassi >20C
plastidiale (eteromerica): sintesi acidi grassi
La ACC1 (citosol) serve alla biosintesi degli acidi grassi a lunghissima catena
(VLCFA =>20)
I VLCFA vengono incorporati negli sfingolipidi
Contenuto di acidi grassi di semi
di arabidopsis WT e mutanti
Le mutazioni acc1-1; acc1-2; gurke; pas3 sono alleliche
I mutanti hanno un accumulo ridotto di VLCFA nei semi
Nei mammiferi è stato visto che gli sfingolipidi
interagiscono col colesterolo per formare domini raftlike ed hanno un ruolo nella regolazione della
divisione cellulare
LIPID RAFTS:
microdomini di membrana ricchi di colesterolo
Dal 1972 (modello del mosaico fluido) si riteneva che fosfolipidi e proteine
fossero simmetricamente distribuiti nelle membrane cellulari
Nel 1988 K Simons (EMBL) e G van Meer (Utrecth) ipotizzarono l’esistenza
di microdomini arricchiti in colesterolo, glicolipidi e sfingolipidi
Alcune proteine associate a processi di signaling sembrano localizzarsi
preferenzialmente nei lipid rafts
doubly-acylated tyrosine kinases of the Src family
ACILAZIONE
Alcune di queste proteine si associano ai LR solo quando sono nello stato attivato
B cell receptors (BCRs), T cell receptors (TCRs)
Mutanti FACKEL:
Le mutazioni nel gene FACKEL determinano la delezione della parte centrale
del’asse apicale-basale
Mutanti fackel hanno i cotiledoni uniti direttamente alla radice
Funzione del gene FACKEL (FK):
Codifica per una sterolo C-14 reduttasi
biosintesi degli steroli
In arabidopsis
i livelli di sitosterolo
campestrolo, stigmasterolo
e brassinolide sono ridotti
nei mutanti fk
mutante fk
0
10
50
100
Le mutazioni fk possono essere fenocopiate
dal fenpropimorph, un inibitore della C-14 reduttasi
mg/ml fenpropimorph
Mutazioni fk non sono complementate dall’aggiunta di brassinolidi
gli steroli ( CH, ER, ST,) che si accumulano nei mutanti fk
responsabili degli effetti?
trattamenti con CH, ER, ST dovrebbero FENOCOPIARE i mutanti fk
Non hanno difetti embrionali pur avendo
livelli ridotti di steroli
Mutanti BR sono complementati
da BRs Mutanti fackel no
STEROLI
Componenti della membrana cellulare
influenzano permeabilità e fluidità della membrana e
l’attività di proteine
animali: colesterolo
piante: sitosterolo, campestrolo
Precursori degli ormoni steroidei
animali: androgeni, estrogeni, glucocorticoidi
piante: brassinosteroidi
STEROLI ANIMALI
Essenziali per lo sviluppo embrionale
COLESTEROLO
Negli animali evidenze che sia coinvolto in vie di trasduzione del
segnale che controllano la formazione del pattern (Hedgehog (Hh)
transduction pathway: proteine Hh secrete , modificate da colesterolo
promuovono interazioni con altre proteine per la trascrizione dei geni
delle cicline E e D)
NELLE PIANTE GLI STEROLI POSSONO AVERE UN RUOLO NELL’EMBRIOGENESI?
Nelle piante PHABULOSA (PHB) è un fattore di trascrizione Leucin –Zipper
Homeodomain possiede un domain di binding per steroli/lipidi. E’ implicato nel
controllo della formazione del pattern radiale nel germoglio
