lez. 4 Miglioramento

La coltura microbica (ceppo) usata nel bioprocesso brevettato costituisce parte
integrante ed essenziale del procedimento ed è, quindi, protetta dal brevetto
(1949, U.S.A.)
Caratteristiche di un ceppo industriale:
geneticamente stabile
puro, non contaminato
produttivo
dovrebbe produrre solo il prodotto desiderato e non altri sottoprodotti
facilmente conservabile
suscettibile di miglioramento
Miglioramento dei ceppi
Insieme delle tecniche che permettono di ottenere e selezionare (micro)organismi
opportunamente modificati per le fermentazioni industriali (strain development)
Negli organismi viventi catabolismo e anabolismo sono finemente regolati
Un approccio razionale al miglioramento richiede la conoscenza delle vie
metaboliche, degli enzimi coinvolti dei meccanismi di regolazione
Le tecniche impiegate:
1.Mutagenesi e selezione
2.Ricombinazione
3.Ingegneria genetica
4. Ingegneria metabolica e systems biotechnology
Ricerca nel suolo di ceppi
produttori di antibiotici
Nature, 22 January 2015
A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance
Antibiotic resistance is spreading faster than the introduction of new compounds into clinical
practice, causing a public health crisis. Most antibiotics were produced by screening soil
microorganisms, but this limited resource of cultivable bacteria was overmined by the 1960s.
Synthetic approaches to produce antibiotics have been unable to replace this platform.
Uncultured bacteria make up approximately 99% of all species in external environments, and
are an untapped source of new antibiotics. We developed several methods to grow uncultured
organisms by cultivation in situ or by using specific growth factors. Here we report a new
antibiotic that we term teixobactin, discovered in a screen of uncultured bacteria. Teixobactin
inhibits cell wall synthesis by binding to a highly conserved motif of lipid II (precursor of
peptidoglycan) and lipid III (precursor of cell wall teichoic acid). We did not obtain any mutants
of Staphylococcus aureus or Mycobacterium tuberculosis resistant to teixobactin. The
properties of this compound suggest a path towards developing antibiotics that are likely to
avoid development of resistance.
1. Mutagenesi
La mutazione è un’alterazione stabile dell’informazione genetica contenuta nel
DNA
-è un’alterazione del genotipo, che non sempre si traduce in un’alterazione del
fenotipo
-è un evento casuale: la frequenza di mutazione spontanea è di 10-7- 10-9 per
cellula per generazione
-è indotta da agenti mutageni, l’azione mutagena aumenta la frequenza di
mutazione
Mutagenesi con UV
Distribuzione della produttività dell’
antibiotico tetraclorociclina nell’ambito
di un insieme di varianti naturali di
Streptomyces viridifaciens
Distribuzione della produttività dell’
antibiotico tetraclorociclina nell’ambito
di un insieme di sopravvissuti di
Streptomyces viridifaciens al trattamento
mutageno UV.
Selezione dei mutanti
Se il trattamento mutageno ha fatto aumentare la frequenza di mutazione fino a 10-4,
occorre effettuare una selezione (screening) su almeno 104 cloni per trovarne uno
mutato.
Come si effettua la selezione dei mutanti? Attraverso l’isolamento dei mutanti con
diversi metodi.
metodi diretti:
valutando la capacità di produzione dei cloni sopravvissuti al
trattamento
metodi indiretti:
utilizzando un metodo in grado di selezionare i mutanti dal selvatico
(wild type) in base a caratteristiche diverse dalla produzione ma ad
essa correlate
Diversi tipi di mutanti:
mutanti produttori
mutanti costitutivi
mutanti auxotrofi
Mutanti produttori
(produzione di antibiotici)
producono quantità molto più elevate di un determinato antibiotico
Per isolare mutanti iperproduttori di un dato antibiotico, efficace nei riguardi di
un dato microrganismo, si utilizza quest’ultimo come indicatore.
Si seminano su terreno opportuno tutte le cellule sopravvissute al trattamento
mutageno, e, una volta che le colonie si sono sviluppate, si semina il microrganismo
indicatore.
I mutanti iperproduttori si riconoscono per il maggiore diametro dell’ alone di
inibizione, cioè di quell’area circolare intorno alla colonia dove non è avvenuta la
crescita del microrganismo indicatore.
Mutanti costitutivi
(produzione di enzimi)
Presentano difetti di regolazione: esempio incapacità ad esprimere il repressore
attivo, pertanto la produzione dell’enzima da inducibile diventa costitutiva.
Isolamento diretto : determinazione dell’attività enzimatica in assenza di induttore
Anche attraverso coltura continua utilizzando l’induttore come substrato limitante.
Poiché il substrato limitante è presente a conc. molto basse, al di sotto della soglia
di induzione, il mutante costitutivo avrà un vantaggio selettivo sul wild type.
Mutanti auxotrofi
(produzione di amminoacidi)
Mutanti che acquisiscono un’esigenza nutrizionale in seguito alla perdita di
un’attività enzimatica necessaria alla biosintesi di una molecola essenziale.
Possono accumulare intermedi metabolici.
Via biosintetica
1
E1
2
E2
3
E3
4
E4
5
Rifornendo di 5 in conc. limitanti si avrà crescita, ma non inibizione/repressione,
si accumula l’intermedio 3
Isolamento indiretto: confronto della crescita delle colonie su terreni selettivi
e non selettivi (replica plating)
2. Ricombinazione
Processo che produce nuove combinazioni di geni originariamente
presenti in individui diversi.
Il vantaggio dell’utilizzo di tecniche di ricombinazione consiste nella
possibilità di ottenere una grande variabilità nella progenie.
Eucarioti:
Procarioti:
Ricombinazione sessuale (incroci)
Coniugazione
Trasformazione
Trasduzione
Procarioti ed eucarioti:
Fusione dei protoplasti
Fusione dei protoplasti
3. Ingegneria genetica
Tecnologia del DNA ricombinante
Insieme delle tecniche e delle procedure per l’isolamento, la manipolazione e
l’espressione di materiale genetico (DNA e RNA).
E’ possibile isolare geni e trasferirli a cellule di organismi diversi, effettuare cioè
la cosiddetta espressione eterologa di un gene.
Vantaggi dell’espressione eterologa:
Consente di aumentare la disponibilità di proteine rare
Consente di utilizzare per la produzione di queste proteine microrganismi di facile
coltivazione
Svantaggi dell’espressione eterologa:
La qualità del prodotto ricombinante può essere diversa da quella del prodotto
nativo
I costrutti ricombinanti sono instabili
Le regolamentazioni legislative sono severe
Clonaggio di un gene
è un termine che descrive una serie di tecniche con le quali è possibile
ottenere più copie di una determinata sequenza nucleotidica
Il gene per essere clonato deve essere legato ad un vettore
La tecnica di clonaggio risale agli anni '70 e utilizza gli enzimi di restrizione
e i vettori di clonaggio
Gli enzimi di restrizione
Sono enzimi (endonucleasi sequenza-specifiche), isolati generalmente da
batteri, in grado di riconoscere e tagliare/digerire il DNA in corrispondenza di
sequenze specifiche dette “siti di restrizione”.
I siti di restrizione sono sequenze ripetute invertite (palindromi), che
risultano essere uguali se lette nella stessa polarità.
I batteri producono enzimi di restrizione essenzialmente per difendersi da DNA estraneo.
Vettori di clonaggio (plasmidici)
I vettori plasmidici sono molecole circolari di DNA a doppia elica (< di
10k bp), ottenuti dalla modificazione di plasmidi naturali, capaci di
replicazione autonoma, possono essere presenti in elevato numero di
copie
I vettori plasmidici sono caratterizzati da:
sequenze artificiali (polylinker) con numerosi siti di restrizione
sequenze per la selezione (es: resistenza ad un antibiotico)
Clonaggio di un gene eucariotico : sintesi del cDNA
4. Ingegneria metabolica e systems biotechnology: un approccio globale
Metabolic engineering (Bailey, 1991) is the directed improvement of product
formation or cellular properties through the modification of specific biochemical
reactions or introduction of new ones with the use of recombinant DNA technology.
An essential element the identification of the biochemical reactions targeted
for modification or to be newly introduced.
Once such reaction targets are identified, molecular biological techniques are
applied in order to amplify, inhibit or delete, transfer, or deregulate the corresponding genes or enzymes.
Esempio ingegneria metabolica:
S. cerevisiae per la produzione di acido lattico, cap. 7
Attualmente, l’approccio della systems biotechnology utilizza le metodologie «omiche»