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PRINCIPI DI SEPARAZIONE DELLE PROTEINE
PRINCIPI DI ELETTROFORESI
Acidi nucleici
Aminoacidi
Proteine
Peptidi
Nucleotidi
Biomolecole cariche: possiedono gruppi
ionizzabili in soluzione ad opportuni pH, sia
come cationi che come anioni, e possono
essere separate tra loro per la diversa carica
applicando un campo elettrico.
Alimentatore – Cella elettroforetica
ELETTROFORESI
MOVIMENTO DI IONI IN UN CAMPO ELETTRICO
Processo di elettrolisi al catodo e all’anodo
al catodo: 2e-+ 2H2O
2OH- + H2
all'anodo: H2O
2H+ + ½ O2 + 2e-
Legge di Ohm: V= IR
I= V/R
Legge di Ohm applicata all’elettroforesi: R dipende da: distanza dagli elettrodi (d)
presenza o meno di supporto, tipo di supporto, tampone e sua concentrazione.
Carica: q; Campo elettrico: E, in V (volt)/d; dove: V= diff. potenziale tra i due
elettrodi e d= distanza tra i due elettrodi;
Vel  qE/f, proporzionale alla carica e al campo, inv. proporzionale alle
forze d’attrito – densità di carica (carica/massa). Vel = qE/f = q V/d f
La velocità di migrazione dipende dal rapporto tra forza di spinta del
campo elettrico e le forze frenanti esistenti tra ioni e mezzo circostante.
f (forze frizionali) = 6pr, dimensioni, forma molecola e resistenza del
mezzo.
L’elettroforesi può essere condotta:
in fase libera (bassa resistenza frizionale) o utilizzando un supporto solido.
Con supporto solido: di larga applicazione sia per separare acidi nucleici che proteine
Elettroforesi in supporto solido: il campione viene sciolto in un opportuno tampone
così come il supporto viene immerso in tampone a opportuni pH e forza ionica per
saturarlo e consentire la conduzione della corrente. Le componenti migrano come
bande nette ben visualizzabili mediante varie strategie di colorazione al termine della
corsa elettroforetica: elettroforesi zonale.
Caratteristiche del supporto: stabile, inerte, omogeneo. Supporti non setaccianti o
setaccianti - “setaccio” controllabile o a porosità definita.
TIPI DI SUPPORTO: - Carta da filtro - acetato di cellulosa non setacciante –
proteine del siero (diagnostica di lab.)
- gel di agarosio
- setacciante
- gel di poliacrilammide - setacciante
Gel proteine in poliacrilamide
Gel agarosio acidi nucleici
Fattori che influenzano la migrazione:
• carica e dimensioni delle molecole (densità di carica - carica/massa)
• forma delle molecole
• forza ionica (1/2  cz2) – tampone di corsa, del supporto, del campione
• pH: tampone di corsa, del supporto, del campione
• temperatura – effetto Joule - W=I2R, potenza dissipata
• Tipo di supporto
Forza ionica: aumentando la forza ionica del tampone aumenta la f.e.m. della cella,
ma se f.i. è troppo elevata non favorisce la migrazione delle molecole da separare
perché aumenta la competizione tra ioni del campione e ioni del tampone. A forza
ionica troppo bassa, viceversa, si favoriscono fenomeni di diffusione e scarsa
risoluzione finale. Tra 0,05 e 0,1 M.
pH: ha un ovvio ruolo condizionando il grado di ionizzazione sia degli ioni da separare
(del campione) che degli ioni trainanti del tampone (acidi deboli). Mobilità effettiva
delle molecole e degli ioni.
Temperatura: fattore molto importante - diminuisce la viscosità del mezzo e
diminuisce le forze di attrito e la resistenza- d’altra parte un aumento eccessivo di
temperatura può sia alterare il supporto sia concentrare il tampone riducendo la
migrazione. Resistenza durante la corsa elettroforetica comporta aumento di T;
T=k, 20-22°C – termostati, condizionatori (alti voltaggi)- celle isolate- lavorando a
corrente costante invece che a voltaggio costante (vedi legge Ohm).
Supporto: per uno studio “fine” sono preferibili i supporti setaccianti e a porosità
controllabile.
Studio delle proteine:
Condizioni NATIVE
Tecnica elettiva : PAGE (elettroforesi su gel di
poliacrilammide)
SDS-PAGE (denaturanti)
PREPARAZIONE DEI GEL DI POLIACRILAMMIDE
Gel di poliacrilammide: e’ un polimero formato da monomeri di acrilammide. L’acrilamide
prima della polimerizzazione è liquida ed è, in tale stato, neurotossica e cancerogena. Il
polimero solido non è più tossico per l’operatore. Si utilizza per separare proteine grazie alla
sua porosità controllabile: pori del gel più o meno stretti in base alla concentrazione % di
acrilammide di partenza. Può essere utilizzata sia per l’elettroforesi di proteine in condizioni
native che denaturanti. Separa proteine con PM da 5000 a 200.000 Da.
Vantaggi dell’uso della poliacrilammide:
- Resistenza meccanica, trasparenza nell’ UV e visibile, alta aderenza al vetro I gel di poliacrilammide vengono preparati al momento dell’uso: si fa polimerizzare l’acrilammide
insieme al derivato metilen-bis-acrilammide. Si prepara una soluzione stock di acrilammide e
bis-acrilammide (o dal commercio) e si diluisce opportunamente nel tampone assieme agli agenti
di polimerizazzione: il TEMED (N-tetrametilendiammina), catalizzatore della formazione di
radicali liberi, e l’APS, ammonio persolfato, iniziatore della reazione radicalica. Si può usare
riboflavina al posto di APS (stacking gels) ma quest’ultimo + utilizzato.
APS in presenza di TEMED dà origine ad una specie radicalica -radicale libero
dal persolfato:
S2O82- + 1ePolimerizzazione radicalica inibita da O2
SO42- + SO4-.
% acrilammide
range ottimale di PM (KDa)
5-12
20-150
10-15
10-80
> 15
< 15
ELETTROFORESI PAGE IN CONDIZIONI NATIVE
Le proteine vengono separate sia in base alla carica propria e quindi in base
alla diversa sequenza di AA sia in base alle diverse dimensioni e forma.
I gel in condizioni native hanno un potere risolutivo relativamente minore
pI delle proteine – proteine basiche migrano a pH acido
ma a pH + vicini al pI si ha > probabilità di separazione
proteine con pI tra 4 e 7 separate con tamponi a pH 8-9.5 (buon
compromesso).
I gel in condizioni native hanno i seguenti vantaggi:
discriminano tra proteine con PM uguale e diversa carica
consentono il recupero e la rapida purificazione di proteine nella loro forma nativa
consentono di separare proteine e enzimi nella loro forma attiva
consentono colorazioni molto specifiche di tipo catalitico
Si possono studiare proteine polimeriche, senza separare le subunità
polipeptidiche.
ELETTROFORESI SDS-PAGE IN CONDIZIONI DENATURANTI
Sia il gel di poliacrilammide, il campione che deve essere sottoposto ad elettroforesi
che il tampone di corsa, vengono preparati aggiungendo un detergente anionico: il
sodio dodecilsolfato SDS
In presenza di SDS la struttura terziaria delle proteine viene destabilizzata, le proteine si
denaturano, assumono una forma a bastoncino, linearizzata e la carica netta della forma
nativa viene resa trascurabile dalla carica dell’SDS, mentre tutte diventano cariche
negativamente. Forma simile e carica/massa simile: cariche dirett. prop. a massa.
Separazione solo per PM diverso.
Nel “setaccio” del gel: le proteine più grosse
migreranno meno; le più piccole migreranno
più velocemente. SDS separa anche subunità
non associate covalentemente.
b-mercaptoetanolo: rompe i
ponti disolfuro
Bollitura: per campioni biologici
I gel di poliacrilammide SDS-PAGE e nativi sono gel preparati verticalmente:
gel verticali. L’elettroforesi SDS-PAGE viene condotta in condizioni dette
discontinue: il gel viene preparato in due tempi ed è diviso in due parti:
STACKING GEL
RUNNING GEL
Il campione viene posto in una
soluzione detta di LAEMMLI;
questa contiene: SDS, bmercaptoetanolo,
blue di bromofenolo, glicerolo,
tampone. Denaturazione al calore.
STACKING GEL: gel
d’impaccamento o compressione
4% acrilammide; pori molto grandi;
vi si formano i pozzetti di caricamento del campione
RUNNING GEL: gel separatore; solitamente 7.5-15-20% acrilammide;
(RESOLVING)
Running Buffer
Elettroforesi SDS-PAGE: separazione molto efficiente delle proteine solo in
funzione del P.M. Per questo è una tecnica di partenza per molte altre analisi e
valutazioni relative alle proteine in un campione biologico.
Il doppio gel “discontinuo” che viene preparato consente la compressione delle
proteine in una linea sottile nello stacking gel prima di entrare nel gel separatore.
Questo si realizza attraverso la diversa composizione di (sistema discontinuo
di Ornstein-Davis ):
STACKING GEL: poliacrilammide al 3-5% (4%), Tampone Tris HCl 0,125M,
pH 6.8 + SDS
RUNNING GEL: poliacrilammide al 7.5-20%, tampone Tris HCl 0.37M, pH 8.8, +
SDS
Tampone di corsa: viene posto in contenitori posti sup. e inf. al gel e nella camera
del gel: Tris-glicina pH 8.3, + SDS. Glicina: AA, acido debole.
Migrazione in stacking gel: gli ioni Cl- (ioni di testa) si muovono velocemente
verso l’ anodo (estremità inf del gel a bassa resistenza) mentre le proteine migrano
più velocemente della glicina (ioni di coda) che rimane indietro (zona del gel
superiore ad alta resistenza); migrando tra la glicina e gli ioni Cl- le proteine si
“comprimono” e si allineano («protein stack») tutte su una linea sottile, anche grazie
ai pori larghi dello stacking gel (3-5% acrilammide).
Migrazione in running gel: gli ioni glicina a pH 8.8, sono più carichi neg. e si
muovo + veloci delle proteine, e sono loro che portano la corrente. Le proteine
rallentano e si separano in base al PM.
SDS-PAGE:
Per monitorare la corsa elettroforetica:
– si controlla la posizione sul gel del blue di Bromofenolo (fa parte della soluzione di
LAEMMLI), indicatore di migrazione; sostanza colorata a basso P.M. , con carica
negativa, migra + veloce della proteina + piccola.
-Si utilizzano uno o più pozzetti per caricare dei campioni di riferimento standard
proteine a PM noto che indicano la migrazione di proteine a PM simile.
A fine corsa il gel è trasparente e le proteine da valutare devono essere colorate x
essere visualizzate.
Rf = distanza migrazione proteina
distanza migrazione colorante
COLORAZIONE DEL GEL
Il gel può essere colorato con diverse metodiche:
Blue comassie (100 ng), colorazione silver-staining (1ng), colorazione reversibile
con Zn o Cu. Colorazione con coloranti fluorescenti.
logPM
Colorante di Coomassie: brilliant blue R-250, in isopropanolo, acido acetico. La
miscela fissa le proteine e impedisce che vengano lavate via durante la colorazione.
Il gel viene decolorato in isopropanolo, acido acetico senza colorante.
Il gel di elettroforesi PAGE delle proteine è il punto di
partenza per altre metodiche:
Per conservarlo a lungo termine, può essere essiccato; si
conserva in glicerolo tra due foglietti di plastica; può essere
fotografato dopo la colorazione; può essere utilizzato
nell’analisi di singole proteine che vengono individuate e
misurate – tecnica del Western blot.
GEL FILTRATION CHROMATOGRAPHY