PRINCIPI DI SEPARAZIONE DELLE PROTEINE PRINCIPI DI ELETTROFORESI Acidi nucleici Aminoacidi Proteine Peptidi Nucleotidi Biomolecole cariche: possiedono gruppi ionizzabili in soluzione ad opportuni pH, sia come cationi che come anioni, e possono essere separate tra loro per la diversa carica applicando un campo elettrico. Alimentatore – Cella elettroforetica ELETTROFORESI MOVIMENTO DI IONI IN UN CAMPO ELETTRICO Processo di elettrolisi al catodo e all’anodo al catodo: 2e-+ 2H2O 2OH- + H2 all'anodo: H2O 2H+ + ½ O2 + 2e- Legge di Ohm: V= IR I= V/R Legge di Ohm applicata all’elettroforesi: R dipende da: distanza dagli elettrodi (d) presenza o meno di supporto, tipo di supporto, tampone e sua concentrazione. Carica: q; Campo elettrico: E, in V (volt)/d; dove: V= diff. potenziale tra i due elettrodi e d= distanza tra i due elettrodi; Vel qE/f, proporzionale alla carica e al campo, inv. proporzionale alle forze d’attrito – densità di carica (carica/massa). Vel = qE/f = q V/d f La velocità di migrazione dipende dal rapporto tra forza di spinta del campo elettrico e le forze frenanti esistenti tra ioni e mezzo circostante. f (forze frizionali) = 6pr, dimensioni, forma molecola e resistenza del mezzo. L’elettroforesi può essere condotta: in fase libera (bassa resistenza frizionale) o utilizzando un supporto solido. Con supporto solido: di larga applicazione sia per separare acidi nucleici che proteine Elettroforesi in supporto solido: il campione viene sciolto in un opportuno tampone così come il supporto viene immerso in tampone a opportuni pH e forza ionica per saturarlo e consentire la conduzione della corrente. Le componenti migrano come bande nette ben visualizzabili mediante varie strategie di colorazione al termine della corsa elettroforetica: elettroforesi zonale. Caratteristiche del supporto: stabile, inerte, omogeneo. Supporti non setaccianti o setaccianti - “setaccio” controllabile o a porosità definita. TIPI DI SUPPORTO: - Carta da filtro - acetato di cellulosa non setacciante – proteine del siero (diagnostica di lab.) - gel di agarosio - setacciante - gel di poliacrilammide - setacciante Gel proteine in poliacrilamide Gel agarosio acidi nucleici Fattori che influenzano la migrazione: • carica e dimensioni delle molecole (densità di carica - carica/massa) • forma delle molecole • forza ionica (1/2 cz2) – tampone di corsa, del supporto, del campione • pH: tampone di corsa, del supporto, del campione • temperatura – effetto Joule - W=I2R, potenza dissipata • Tipo di supporto Forza ionica: aumentando la forza ionica del tampone aumenta la f.e.m. della cella, ma se f.i. è troppo elevata non favorisce la migrazione delle molecole da separare perché aumenta la competizione tra ioni del campione e ioni del tampone. A forza ionica troppo bassa, viceversa, si favoriscono fenomeni di diffusione e scarsa risoluzione finale. Tra 0,05 e 0,1 M. pH: ha un ovvio ruolo condizionando il grado di ionizzazione sia degli ioni da separare (del campione) che degli ioni trainanti del tampone (acidi deboli). Mobilità effettiva delle molecole e degli ioni. Temperatura: fattore molto importante - diminuisce la viscosità del mezzo e diminuisce le forze di attrito e la resistenza- d’altra parte un aumento eccessivo di temperatura può sia alterare il supporto sia concentrare il tampone riducendo la migrazione. Resistenza durante la corsa elettroforetica comporta aumento di T; T=k, 20-22°C – termostati, condizionatori (alti voltaggi)- celle isolate- lavorando a corrente costante invece che a voltaggio costante (vedi legge Ohm). Supporto: per uno studio “fine” sono preferibili i supporti setaccianti e a porosità controllabile. Studio delle proteine: Condizioni NATIVE Tecnica elettiva : PAGE (elettroforesi su gel di poliacrilammide) SDS-PAGE (denaturanti) PREPARAZIONE DEI GEL DI POLIACRILAMMIDE Gel di poliacrilammide: e’ un polimero formato da monomeri di acrilammide. L’acrilamide prima della polimerizzazione è liquida ed è, in tale stato, neurotossica e cancerogena. Il polimero solido non è più tossico per l’operatore. Si utilizza per separare proteine grazie alla sua porosità controllabile: pori del gel più o meno stretti in base alla concentrazione % di acrilammide di partenza. Può essere utilizzata sia per l’elettroforesi di proteine in condizioni native che denaturanti. Separa proteine con PM da 5000 a 200.000 Da. Vantaggi dell’uso della poliacrilammide: - Resistenza meccanica, trasparenza nell’ UV e visibile, alta aderenza al vetro I gel di poliacrilammide vengono preparati al momento dell’uso: si fa polimerizzare l’acrilammide insieme al derivato metilen-bis-acrilammide. Si prepara una soluzione stock di acrilammide e bis-acrilammide (o dal commercio) e si diluisce opportunamente nel tampone assieme agli agenti di polimerizazzione: il TEMED (N-tetrametilendiammina), catalizzatore della formazione di radicali liberi, e l’APS, ammonio persolfato, iniziatore della reazione radicalica. Si può usare riboflavina al posto di APS (stacking gels) ma quest’ultimo + utilizzato. APS in presenza di TEMED dà origine ad una specie radicalica -radicale libero dal persolfato: S2O82- + 1ePolimerizzazione radicalica inibita da O2 SO42- + SO4-. % acrilammide range ottimale di PM (KDa) 5-12 20-150 10-15 10-80 > 15 < 15 ELETTROFORESI PAGE IN CONDIZIONI NATIVE Le proteine vengono separate sia in base alla carica propria e quindi in base alla diversa sequenza di AA sia in base alle diverse dimensioni e forma. I gel in condizioni native hanno un potere risolutivo relativamente minore pI delle proteine – proteine basiche migrano a pH acido ma a pH + vicini al pI si ha > probabilità di separazione proteine con pI tra 4 e 7 separate con tamponi a pH 8-9.5 (buon compromesso). I gel in condizioni native hanno i seguenti vantaggi: discriminano tra proteine con PM uguale e diversa carica consentono il recupero e la rapida purificazione di proteine nella loro forma nativa consentono di separare proteine e enzimi nella loro forma attiva consentono colorazioni molto specifiche di tipo catalitico Si possono studiare proteine polimeriche, senza separare le subunità polipeptidiche. ELETTROFORESI SDS-PAGE IN CONDIZIONI DENATURANTI Sia il gel di poliacrilammide, il campione che deve essere sottoposto ad elettroforesi che il tampone di corsa, vengono preparati aggiungendo un detergente anionico: il sodio dodecilsolfato SDS In presenza di SDS la struttura terziaria delle proteine viene destabilizzata, le proteine si denaturano, assumono una forma a bastoncino, linearizzata e la carica netta della forma nativa viene resa trascurabile dalla carica dell’SDS, mentre tutte diventano cariche negativamente. Forma simile e carica/massa simile: cariche dirett. prop. a massa. Separazione solo per PM diverso. Nel “setaccio” del gel: le proteine più grosse migreranno meno; le più piccole migreranno più velocemente. SDS separa anche subunità non associate covalentemente. b-mercaptoetanolo: rompe i ponti disolfuro Bollitura: per campioni biologici I gel di poliacrilammide SDS-PAGE e nativi sono gel preparati verticalmente: gel verticali. L’elettroforesi SDS-PAGE viene condotta in condizioni dette discontinue: il gel viene preparato in due tempi ed è diviso in due parti: STACKING GEL RUNNING GEL Il campione viene posto in una soluzione detta di LAEMMLI; questa contiene: SDS, bmercaptoetanolo, blue di bromofenolo, glicerolo, tampone. Denaturazione al calore. STACKING GEL: gel d’impaccamento o compressione 4% acrilammide; pori molto grandi; vi si formano i pozzetti di caricamento del campione RUNNING GEL: gel separatore; solitamente 7.5-15-20% acrilammide; (RESOLVING) Running Buffer Elettroforesi SDS-PAGE: separazione molto efficiente delle proteine solo in funzione del P.M. Per questo è una tecnica di partenza per molte altre analisi e valutazioni relative alle proteine in un campione biologico. Il doppio gel “discontinuo” che viene preparato consente la compressione delle proteine in una linea sottile nello stacking gel prima di entrare nel gel separatore. Questo si realizza attraverso la diversa composizione di (sistema discontinuo di Ornstein-Davis ): STACKING GEL: poliacrilammide al 3-5% (4%), Tampone Tris HCl 0,125M, pH 6.8 + SDS RUNNING GEL: poliacrilammide al 7.5-20%, tampone Tris HCl 0.37M, pH 8.8, + SDS Tampone di corsa: viene posto in contenitori posti sup. e inf. al gel e nella camera del gel: Tris-glicina pH 8.3, + SDS. Glicina: AA, acido debole. Migrazione in stacking gel: gli ioni Cl- (ioni di testa) si muovono velocemente verso l’ anodo (estremità inf del gel a bassa resistenza) mentre le proteine migrano più velocemente della glicina (ioni di coda) che rimane indietro (zona del gel superiore ad alta resistenza); migrando tra la glicina e gli ioni Cl- le proteine si “comprimono” e si allineano («protein stack») tutte su una linea sottile, anche grazie ai pori larghi dello stacking gel (3-5% acrilammide). Migrazione in running gel: gli ioni glicina a pH 8.8, sono più carichi neg. e si muovo + veloci delle proteine, e sono loro che portano la corrente. Le proteine rallentano e si separano in base al PM. SDS-PAGE: Per monitorare la corsa elettroforetica: – si controlla la posizione sul gel del blue di Bromofenolo (fa parte della soluzione di LAEMMLI), indicatore di migrazione; sostanza colorata a basso P.M. , con carica negativa, migra + veloce della proteina + piccola. -Si utilizzano uno o più pozzetti per caricare dei campioni di riferimento standard proteine a PM noto che indicano la migrazione di proteine a PM simile. A fine corsa il gel è trasparente e le proteine da valutare devono essere colorate x essere visualizzate. Rf = distanza migrazione proteina distanza migrazione colorante COLORAZIONE DEL GEL Il gel può essere colorato con diverse metodiche: Blue comassie (100 ng), colorazione silver-staining (1ng), colorazione reversibile con Zn o Cu. Colorazione con coloranti fluorescenti. logPM Colorante di Coomassie: brilliant blue R-250, in isopropanolo, acido acetico. La miscela fissa le proteine e impedisce che vengano lavate via durante la colorazione. Il gel viene decolorato in isopropanolo, acido acetico senza colorante. Il gel di elettroforesi PAGE delle proteine è il punto di partenza per altre metodiche: Per conservarlo a lungo termine, può essere essiccato; si conserva in glicerolo tra due foglietti di plastica; può essere fotografato dopo la colorazione; può essere utilizzato nell’analisi di singole proteine che vengono individuate e misurate – tecnica del Western blot. GEL FILTRATION CHROMATOGRAPHY