Effetti sul fenotipo dei diversi tipi di mutazione
Mutazioni con perdita di funzione
Quasi sempre sono Mutazioni recessive (genotipo in omozigosi):
- l’eterozigote non esprime il fenotipo mutante, quindi senza
aploinsufficienza (per meccanismi compensatori dell’altro allele?)
- con aploinsufficienza (pochissimi i casi di alleli recessivi che esprimono
questo fenotipo)
Mutazioni con acquisto di funzione
In genere sono Mutazioni dominanti
- per aumento della produzione proteica (e funzione) rispetto al wt
- per produzione di una nuova proteina (e funzione) rispetto al wt
APPLICAZIONI DELLA TERAPIA GENICA
- malattie ereditarie monogeniche con ereditarietà mendeliana
- malattie infettive
- malattie multigeniche (cancro)
Terapia genica classica:
1) Produzione e somministrazione della proteina che manca al paziente
2) Eliminazione delle cellule malate
3) Attivazione delle cellule del sistema immunitario che determinano
l’uccisione delle cellule malate
Terapia genica non convenzionale:
Correzione del difetto genetico restaurando la normale espressione
genica.
1) Inserimento completo del gene wt nelle cellule somatiche
2) Mutagenesi mirata nelle cellule somatiche per ripristino gene wt
3) Silenziamento nelle cellule somatiche del trascritto del gene mutato
4) Terapia genica nelle cellule germinali (solo in animali modello)
Strategie per la terapia genica
somatica
Aggiunta genica
Correzione
genica per
mutagenesi
mirata (gene
targeting)
Inibizione genica
Eliminazione
cellulare
controllata
Eliminazione
cellulare mediata
dal sistema
immunitario
Terapia genica somatica in vivo ed ex vivo
in vivo
ex vivo
Terapia genica somatica ex vivo
- Applicabile solo a certi tipi cellulari: cellule in divisione e coltivabili in vitro
(es: da midollo osseo, pelle, tumori)
Terapia genica somatica ex vivo
-Estrazione/preparazione delle cellule primarie o della linea cellulare
del paziente (cellule autologhe)
- Trasferimento del gene in vitro
- Quando possibile controllo dei trasformanti
- Reimpianto delle cellule nel paziente
SVANTAGGI
- Applicabile a pochi tessuti (sistema emopoietico, cellule epiteliali, ecc)
- Tecnica difficile con scarsa efficienza
- Necessità di trattamenti ripetuti nel tempo
Esempi: cellule staminali di midollo osseo trattate in emofilici e
talassemici
Terapia genica somatica in vivo
Introduzione diretta del gene in vivo nelle cellule bersaglio:
- iniezione diretta in tipi cellulari non coltivabili in vitro (es. c. cerebrali)
o per aumentare il numero di cellule trattate rispetto alla terapia ex vivo
(es. nel muscolo scheletrico distrofico)
- somministrazione in prossimità del tessuto bersaglio (ad es. vie
respiratorie nella fibrosi cistica)
Problemi:
- Trasferimento quantitativamente limitato
- Rischio di inserimento in cellule sane
- Reazione immunitaria (alle proteine virali, se si utilizzano virus; talvolta
alla proteina espressa)
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO
1) Trasferimento genico diretto:
- trasfezione di DNA “nudo” in plasmidi (applicato a volte a cellule muscolari)
- trasfezione mediata da liposomi (vescicole formate da doppio
strato lipidico)
2) Trasferimento tramite vettori
- retrovirus
- adenovirus
- virus adeno-associati
3) Tipi di inserzione:
- ectopica
- mirata
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO
1) Trasferimento genico diretto
Vantaggi:
- Non si generano nuovi virus patogeni
- Riduzione del rischio di reazione immunitaria
- Possono trasferire molecole di DNA anche molto grandi
Svantaggi:
- Scarsa efficienza sia di trasferimento che di integrazione
- Se integrati, possibile mutagenesi inserzionale
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO
2) Trasferimento tramite vettori virali
Caratteristiche necessarie:
- Le particelle virali ricombinanti devono essere difettive rispetto alla
replicazione (deleti per geni responsabili di replicazione e assemblaggio
del virione), non produrre composti tossici per l’ospite.
Vantaggi:
- Alta efficienza di trasferimento genico
Svantaggi:
- Espressione transiente
- Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con
eventuali virus presenti nell’ospite
- Inserzione di geni (o molecole di DNA) di dimensioni limitate
- Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale
nel genoma) (attivazione di oncogèni)
- Possibilità di reazioni immunitarie
- Tecniche con bassa efficienza e costi elevati
Retrovirus (ad RNA): hanno specifici recettori per entrare nelle cellule; si
integrano nei cromosomi in localizzazioni casuali, entrano nel nucleo solo quando
si dissolve membrana nucleare (solo cellule in divisione)
Adenovirus: legame a specifici recettori cellulari che permettono l'ingresso del
virus tramite endocitosi; infettano molti tipi cellulari, anche non in divisione; geni
non integrati (episomi); espressione per brevi periodi; necessità di trattamenti
ripetuti (es. trattamento fibrosi cistica)
Virus adeno-associati (AAV): non sono in grado di replicarsi autonomamente ma
necessitano di virus helper co-infettanti come adenovirus o Herpex simplex. Si
integrano in sito specifico (19q13.3).
Vettore virale
Vantaggi
Svantaggi
Retrovirus
Capacità d'inserimento del gene,
integrazione stabile nel DNA dell'ospite,
elevati titoli di virus ricombinante, ampio
tropismo d'infettività, relativa facilità di
manipolazione del genoma virale
Difficoltà nel controllare l'infezione
virale, mancata infezione delle cellule
non in divisione, integrazione a caso
nel genoma dell'ospite
Lentivirus
Infezione delle cellule in divisione o meno,
espressione stabile del gene, elevata
capacità d'inserimento
Mutagenesi potenziale presenza di
sequenze proteiche regolatrici e
accessorie
Elevati titoli di virus, alta espressione
genica, grande capacità d’infezione di
cellule in divisione e non in divisione
Risposte immuni alle proteine virali,
nessuna integrazione nel genoma
dell'ospite, espressione genica
transitoria
Virus adeno-associati
Infettano le cellule in divisione o meno,
ampio tropismo cellulare, potenziale
d'integrazione, bassa immunogenicità e
non patogenicità
Herpesvirus
Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari,
alta capacità d'inserzione, tropismo
naturale per le cellule neuronali, seguita
dalla produzione di alti titoli virali
Limitate capacità per i transgeni,
difficile generazione di alti titoli virali,
presenza di adenovirus o herpevirus
per la moltiplicazione dei virus adenoassociati
Possibile tossicità, rischio di
ricombinazione, nessuna integrazione
virale nel DNA dell'ospite
Adenovirus
Poxvirus
Alta capacità d'inserzione, possibile
Possibile effetto citopatico
inserzione di grandi frammenti di DNA, alti (cambiamenti cellulari morfologici e
livelli di espressione transgenica, seguita
fisiologici)
da virus vivo ricombinante
Difficoltà di controllare le linee cellulari
Virus di Epstein-Barr Infetta cellule in divisione o meno con
prevalenza per i linfociti B, alta capacità
d'inserimento
Retrovirus
Trascrittasi inversa e integrasi
Maturazione del genoma
a RNA
Proteina per involucro
Psi + non codificante: per impacchettamento nel capside
Lunga sequenza terminale ripetuta
Vettore retrovirale
Sostituzione di gag, pol, env
con gene X: lunghezza max = 8 kb
Marcatore selez: gene Neo
Lunghezza massima: 8Kb
PREPARAZIONE RETROVIRUS PER L’INFEZIONE CELLULARE
Linee cellulari per packaging: forniscono le necessarie funzioni di gag, pol, env,
ma delete per gene psi; hanno inserito stabilmente i geni virali codificanti per
proteine strutturali del capside, produce virioni vuoti per l’assemblaggio dei virioni.
La loro transfezione transiente con vettore ricombinante determina
l’impacchettamento del costrutto nel virione (contiene l’enzima transcrittasi inversa)
vettore virale completo da usare per l’infezione delle cellule da trattare
da Dr. Sara Caldarola
INFEZIONE CON RETROVIRUS DELLA CELLULA BERSAGLIO
IL RETROVIRUS NON E’ IN GRADO DA SOLO DI REPLICARSI E PRODURRE
PARTICELLE FAGICHE PER ALTRE INFEZIONI CELLULARI
Dr. Sara Caldarola
Adenovirus
Patogeno naturale dell’uomo, genoma a DNA a doppio
filamento, causa il comune raffreddore
Come vettore ha una delezione della regione E1 il che lo rende difettivo per la
replicazione. Come cellule d'impaccamento vengono usate cellule renali
embrionali.
Virus Adenoassociati
Appartengono alla famiglia dei parvovirus.
Genoma formato da una molecola di DNA a
singolo filamento di circa 5 kb.
Capside icosaedrico e sono privi d'un involucro
lipidico.
Non sembrano associati a nessuna patologia:
ideali come vettori.
Espressione prolungata del transgene
Ma dimensioni ridotte del transgene (max 4,7
kb)
Terapia genica nei tumori
Se inattivato gene soppressore tumore (oncosoppressore)
introduzione
nuova versione gene;
Se attivato oncogène
spegnimento con gene con RNA antisenso
Strategie di terapia genica somatica in malattie da
aploinsufficienza
Inserimento gene wt
Inserimento mirato
e doppia ricombinazione per ripristino
gene wt
Strategie di terapia genica somatica in malattie da
acquisizione di funzione
Produzione di RNA interferenti introdotti con vettori virali
Produzione di RNA interferenti introdotti con vettori virali
Si introduce nella cellula l’RNA del gene
che si vuole silenziare a doppio filamento (dsRNA)
Complesso Dicer:
RNAsi che degrada lunghi filamenti
di dsRNA a frammenti di circa 20 bp
RISC: RNA-Induced Silencing Complex.
(Formato da RNA e proteine)
srotola ds RNA e il filamento complementare
si appaia con RNA da silenziare,
degradazione dell’ RNA a doppio filamento
Terapia genica dei tumori
Es: ganciclovir
Ganciclovir (Gcv):
analogo di un
nucleoside virale
(metilguanina): uccide le
cellule tk+, ovvero
quelle con il vettore
virale inserito
Tk HSV
Gcv
Tk mamm
Gcv-P
Gcv-PPP
Incorporazione DNA
Terminazione catena
rottura DNA
Terapia genica in vivo per i tumori cerebrali
VPC = Cellule
infettate da
Herpes simplex
(con gene Tk)
che producono
virioni
impiantate
nel tumore
Produzione
di timidina
chinasi virale
Somministrazione
farmaco (GCV)
Neuronavigazione
stereoatassica guidata da MRI
Tk HSV
Gcv
Tk mamm
Gcv-P
Gcv-PPP
Incorporazione DNA
Ganciclovir (Gcv): analogo del nucleoside
erpetico: uccide le cellule tk+, ovvero con il vettore
virale inserito
Terminazione catena
rottura DNA
TERAPIA GENICA NELLE MALATTIE UMANE MENDELIANE
Malattia
ß-talassemia
Immunodef. congenita (SCID)
Distrofia muscolare
Fibrosi cistica
Emofilia A e B
Fenilchetonuria
Morbo di Gaucher
Mucopolisaccaridosi tipo I
Mucopolisaccaridosi tipo VII
Epidermolisi bullosa
Gene introdotto
ß-globina
ADA
Distrofina
CFTR
Fattore VIII e IX
Fenilalanina idrossilasi
Glucocerebrosidasi
-L-iduronidasi
ß-glucuronidasi
Laminina
Tessuto target
Midollo osseo
Midollo/linfociti
Muscolo
Epitelio alveoli
Epatociti/muscoli
Fegato
Midollo osseo
Fibroblasti
Midollo osseo
Cheratinociti
SCID: SEVERE COMBINED IMMUNODEFICIENCY DISEASE
Assenza di Adenosina deaminasi (ADA) (enzima della via di recupero delle purine)
Malattia AR: mancanza di cellule progenitrici dei linfociti T e accumulo metaboliti
tossici (adenosina e derivati)
SCID: UN ESEMPIO DI SUCCESSO DELLA TERAPIA
GENICA SOMATICA
Terapia classica:
-Trapianto di midollo: compatibilità del 90-100% dell’HLA (una
minoranza dei pazienti)
- Somministrazione di enzima ADA estratto dai bovini (correzione
del metabolismo, ripristina in parte funzioni immunitarie).
Terapia genica ex vivo:
- Cellule staminali emopoietiche
- Precursori linfociti T
- Infezione con vettore retrovirale.
Il cDNA dell’ADA dimensioni ridotte(1.5 Kb). Non è necessaria una
regolazione fine dell’espressione genica con ripristino della fisiologia
sia con alta che bassa efficienza di integrazione
- Cellule con copia gene ADA hanno un vantaggio selettivo di crescita
eliminando più facilmente i metaboliti tossici
Terapia con incremento delle copie geniche ex vivo con retrovirus
per la deficienza di adenosina deaminasi (ADA)
Precursori linfociti T
ADA
da midollo osseo
paziente ADA-
Terapia 6-7 volte l’anno.
Dopo 5 anni recupero parziale della funzione immunitaria
Terapia genica per la deficienza di adenosina deaminasi (ADA)
Linfociti T oppure
Cellule staminali midollo osseo
(tutte
le linee emopoietiche transgeniche)
Malattia letale entro i 30 anni senza
trattamenti.
Terapia classica:
- Drenaggio bronchiale
- Somministrazione antibiotici
Terapia genica ex vivo
-Vettori adenovirali per introdurre
il gene CFRT nelle cellule dei
polmoni tramite aereosol
Problematiche:
Tessuto polmonare crea barriere
fisiche (muco) e immunitarie;
difficile ingresso dell’adenovirus nel
nucleo; reazioni infiammatorie;
espressione a breve termine
Terapia con staminali?
Inserimento CFTR in vettori virali e
infezione di staminali paziente (da
midollo), spinte a differenziarsi ad
epiteliali per ripopolare il polmone
COSA È LA DMD
LA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE (DMD) E’ UNA
GRAVE PATOLOGIE GENETICA, CAUSATA DALLA TOTALE
ASSENZA DELLA DISTROFINA NEL MUSCOLO STRIATO E
LISCIO.
colpisce tutti i muscoli scheletrici, la muscolatura liscia e il cuore.
difficoltà di deambulazione e di movimento
insufficienza respiratoria
problemi cardiaci
DMD: conduce alla completa immobilità, l’aspettativa di vita non supera i 25-30
anni. A 10-12 anni i ragazzi vivono sulla carrozzina.
La DMD è una malattia rara, con una ha una frequenza di 1 su 3500
Mutazioni dello stesso gene causano anche:
•
La distrofia di Becker (DMB), meno invalidante con assenza parziale di
distrofina.
•
Cardiomiopatia dilatativa legata all’X
TUTTA COLPA DI UN GENE
• Il gene è localizzato sul braccio corto
del cromosoma X.
• Le donne con una sola copia mutata
del gene sono portatrici sane, gli
uomini, essendo emizigoti, si
ammalano.
• E’ il più lungo gene fin ora identificato,
circa 2,3 Mb (79 esoni)
•
mRNA rappresenta solo lo 0,5% del
gene (circa 12 kb)
• 7 promotori, originano 1 proteina
lunga e 6 versioni più corte.
• La distrofina, formata da 3685
aminoacidi, PM 427 kDa.
LA DISTROFINA
• Ancorata sulla faccia interna della membrana
delle fibre muscolari.
C- terminale è legato ad altre proteine di
membrana.
N-terminale è connesso alle strutture
contrattili all’interno della cellula muscolare.
• Determinante per la stabilità meccanica della
membrana durante la contrazione muscolare,
funziona da ammortizzatore.
• Assenza o malfunzionamento causa rottura
della membrana muscolare:
Ingresso del calcio nelle fibre.
Attivazione di enzimi.
Infiammazione e attivazione dei
fibroblasti.
Formazione di tessuto cicatriziale che
sostituisce quello muscolare.
Degenerazione muscolare e insorgenza
della patologia.
Terapia genica per la DMD
- Terapia di tipo sistemico (muscolatura striata, cuore, diaframma)
- Muscoli target difficilmente raggiungibili
- Transgene di dimensioni elevate (cDNA di 14 kb)
- Pochi vettori utilizzabili
TERAPIA GENETICA: L’EXON SKIPPING
• La mutazione elimina EX50 portando alla
fusione di IVS 49 e IVS50; cambia il
reading frame del gene della distrofina e
cessa la produzione della proteina
funzionale
• Viene indotto l’exon skipping (E.S.)
dell’esone 51 nel pre-mRNA: Antisense
Oligo (AO) che si attaccano alla sequenza
dell’ESE (exonic-splicing-enhancer)
all’interno dell’esone 51
• E.S. ristabilisce il corretto schema di
lettura (reading frame) modificando
l’mRNA (EX49 in frame con EX52)
• La proteina è più corta ma ancora
funzionante
• Converte la DMD in DMB in modo da ridurre
la gravità della malattia
COME FUNZIONA L’EXON SKIPPING 1/2
• AOS o Oligonucleotidi antisenso, corti frammenti di RNA, si appaiano in regioni
coinvolte nello splicing del pre –mRNA, producendo splicing alternativo con
rimozione di uno o piu esoni
• i 2 tipi di AOS più utilizzati nella sperimentazione per l’eliminazione dell’esone
51 sono:
2’O- metyl- fosforotioates, PRO05, formato da 20 basi
Morfolino, AVI-4658, ha 30 basi, e include le 20 del PRO05
2’O-Metil AO
morfolino AO
UCUUUACGGUGAAGGAACU
GAUCUUUACGGUGAAGGAACUACAACCYC
Il trattamento con una molecola antisenso, somministrata con iniezione intramuscolare.
Lo studio, compiuto presso UCL (Londra) ha riguardato 7 ragazzi di età compresa
tra 10 e 17 anni con DMD a cui era stata diagnosticata la malattia e in cui poteva
risultare di beneficio lo skipping (salto) dell’esone 51.
Due dei pazienti hanno ricevuto 0.09 mg dell’oligonucleotide antisenso AVI-4658,
iniettato localmente in un piccolo muscolo del piede (extensor digitorum brevis).
Gli altri 5 pazienti hanno ricevuto 0.9 mg di AVI-4658 nell’altro piede.
I pazienti che hanno ricevuto il più basso dosaggio (0.09 mg) di AVI-4658
hanno mostrato poca espressione di distrofina, il dosaggio più alto (0.9 mg) ha
prodotto un aumento dell’espressione di distrofina nel muscoli trattati.
Nelle aree delle sezioni immunocolorate adiacenti al luogo in cui AVI-4658 è stato
iniettato, il 44-79% delle miofibre ha aumentato l’espressione della distrofina.
Fonte: Lancet Neurology, 2009
Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA
• Efficienza (trasduzione di un numero di cellule elevato).
• Garanzia di una prolungata produzione della proteina terapeutica (a livelli
adeguati).
• Capacità di incorporare DNA di varie dimensioni.
• Garanzia nella regolazione (trascrizionale, traduzionale o post-traduzionale)
dell’espressione del gene introdotto
• Non patogenicità
• Facilità di somministrazione al paziente.
• Capacità di raggiungere specificamente le cellule bersaglio.
• Buona tolleranza.
• Assenza di immunogenicità
• Facilità di costruzione e riproducibilità
IL VETTORE IDEALE NON ESISTE.
I VETTORI PIU’ UTILIZZATI OGGI SONO I RETROVIRUS
