Piffaretti J.C. Terapie geniche e genetiche, 11 marzo 2008.
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TERAPIE GENICHE E GENETICHE Terapia genica: consiste a modificare il repertorio genetico di alcune cellule con uno scopo terapeutico Modifica di cellule somatiche! Modifica per addizione, non per sostituzione Istituto cantonale di patologia 11 marzo 2008 Cassetta di espressione = gene + promotore + enhancers Terapia genica: quali malattie trattare? Transfer ex vivo Malattie genetiche classiche 1 gene coinvolto Ripercussioni in diversi organi o tessuti Controllo dell’espressione del gene Transfer in vivo Terapia genica: quali malattie trattare? Esempi di malattie genetiche classiche che possono essere trattate tramite terapia genica Gene coinvolto Malattia Adenosina deaminasi Immunodeficienza Severa Combinata Regolatore transmembranario Fattore IX Mucoviscidosi Emofilia B Fattore VIII Emofilia A α1-antitripsina β-globina Enfisema Talassemia Malattie genetiche classiche 1 gene coinvolto Ripercussioni in diversi organi o tessuti Controllo dell’espressione del gene Malattie genetiche complesse Più di un gene è coinvolto Tumori, malattie cardiovascolari, ipertensione, artrite 1 Terapia genica: quali malattie trattare? Malattie genetiche classiche 1 gene coinvolto Ripercussioni in diversi organi o tessuti Controllo dell’espressione del gene Malattie genetiche complesse Più di un gene è coinvolto Tumori, malattie cardiovascolari, ipertensione, artrite Barriere fisiologiche al transfer di acidi nucleici nella cellula 1. 2. 3. 4. 5. 6. Stabilità Penetrazione nella cellula Sopravivenza nel citoplasma Penetrazione nel nucleo Rilascio dell'acido nucleico Espressione Malattie genetiche acquisite Tumori d’origine virale, AIDS Davis P.B. and Cooper M.J. (2007), AAPS Journal 9: E11 Costruzione dei vettori virali Transfer dei geni Vettori virali Retrovirus / Lentivirus Adenovirus Adeno-associated virus (AAV) Virus Pox Vettori non virali Liposomi DNA nudo Verma I.M. and Weitzman M.D. (2005), Annu. Rev. Biochem.74: 711 2 Adenovirus ricombinanti Cassetta d'espressione: 8 kb Assenza di integrazione ⇒ assenza di replicazione ⇒ perdita del plasmide Inoculazioni periodiche ⇒ stimolazione sistema immunitario ⇒ neutralizzazione del virus ricombinante Reazioni tossiche, infiammatorie AAV (adeno-associated virus) Virus Pox 1977: Ultimo caso di vaiolo • AAV: parvovirus non patogeni • Virus difettivi (necessitano adenovirus o herpes virus per la replicazione) • Produzione complessa • Integrazione possibile nel genoma Vaccinia • Facile a produrre • Costo basso • Stabile • Protezione di lunga durata • Cassetta d'espressione: 4.5 kb AAV particles around a single adenovirus. Bar: 100 nm 187 kb, trascrizione e replicazione nel citoplasma Vaccinia Ankara, canaripox, ecc. 3 Construction de recombinants du virus de la vaccine SYSTEMA PLASMIDE - LIPOSOMA Plasmidi Liposomi Endosoma Nucleo Prodotto d'espressione della cassetta Cassette d'espressione: 50 kb Nessuna tossicità VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) e ischemia muscolare Iniezione di DNA nudo Plasmide ricombinante VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor Ischemia muscolare Baumgartner I., Isner J.M., et al., 1998 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) et ischemia muscolare Immunodeficienza Severa Combinata Deossiadenosina ADA: Adenosina deaminasi Deossinosina Deficienza ADA ⇒ ↑ deossiadenosina ⇒ tossicità per linfociti T Settembre 1990: Introduzione di ADA + neoR tramite retrovirus nei linfociti T di due piccole bambine Immunità ↑ Baumgartner I., Isner J.M., et al., 1998 4 1999-2002 Ottobre 2002: - 10 bambini trattati, di età <1 anno - 9/10: Correzione OK 7/9: Ricostituzione cellule T: completa, stabile Î vita normale (2007) 2/9: Ricostituzione cellule T: parziale ! Malattia linfooproliferativa monoclonale in 2 pazienti! 1 decesso Gennaio 2005: 3° caso 2007: 4°, 5° caso 1999-2007 F + UK: 17/20 bambini trattati con successo Inserzione del virus ricombinante Possibile meccanismo della malattia linfoproliferativa Mutazione oncogena ? LMO2 gene map of activating retrovirus vector insertions MFG-γc: retroviral vector La sovrapproduzione della proteina LMO2 nelle cellule T blocca la differenziazione delle cellule T e aumenta la loro propensione alla divisione. LMO2 è un oncogeno. Berns A., 2004, NEJM 350:1679 Cavazzana-Calvo M. and Fischer A., J. Clin. Invest. (2007): 117: 1456 5 RT+Gendicina / RT: ↑3x della regressione completa, sia 64% Ottobre 2003: autorizzazione e commercializzazione Luglio 2005: 2'600 pazienti trattati 2006: 50'000 pazienti previsti Update: March 2008 Vue d’ensemble des essais de TG en Suisse ADA (1) CLI / PAOD (4) ALS (2) CRI (1) CF (1) VIH (4) CLI: Critical limb ischemia Ischemia critica degli arti inferiori PAOD: Peripheral artery occlusive disease arteriopatia obliterante degli arti CRI: Chronic renal insufficiency ALS: Amyotrophic lateral sclerosis Sclerosi laterale amiotrofica CF: Cystic fibrosis Mucoviscidosi Cancer (26) Problemi legati alla terapia genica Vecteurs utilisé utilisés Sicurezza del transfer dei geni AAV (1) Terapia genica su cellule germinali AdV (8) "Miglioramento" di un individuo Vaccinia (13) Retro (3) Plasmid (14) 6 Two component zinc-finger nuclease NUOVE POSSIBILITÀ DI TERAPIE GENETICHE • Riparazione di un gene mutato • Oligonucleotidi antisens • siRNA Wilson JH (2003): Nature Biotechnology 7: 759 ZFN (Zinc finger nuclease) repair of a mutated gene Oligonucleotidi antisens New England Journal of Medecine 1996, 334: 316-318 [Vitravene: inibitore della replicazione del CMV] Cavazzana-Calvo M. and Fischer A. (2007), J. Clin. Invest. 117: 1456 Short interfering RNA Antisense oligonucleotidebased manipulation of pre-mRNA splicing A. Thalassemia B. Duchenne Muscular Dystrophy C. Spinal Muscular Atrophy Wood M., Yin H., McClorey G. (2007), PLoS Genetics 3: e109 RISC: RNA-induced silencing complex New England Journal of Medecine 2006, 355: 2391 7 siRNA for isoformand allelic-specific silencing A. Tumour angiogenesis B. Autosomal dominant slow channel congenital myasthenic syndrome Wood M., Yin H., McClorey G. (2007), PLoS Genetics 3: e109 8
