TERAPIE GENICHE
E GENETICHE
Terapia genica: consiste a modificare il repertorio
genetico di alcune cellule con uno scopo
terapeutico
Modifica di cellule somatiche!
Modifica per addizione, non per sostituzione
Istituto cantonale di patologia
11 marzo 2008
Cassetta di espressione = gene + promotore + enhancers
Terapia genica: quali malattie trattare?
Transfer ex vivo
Malattie genetiche classiche
1 gene coinvolto
Ripercussioni in diversi organi o tessuti
Controllo dell’espressione del gene
Transfer in vivo
Terapia genica: quali malattie trattare?
Esempi di malattie genetiche classiche che possono essere
trattate tramite terapia genica
Gene coinvolto
Malattia
Adenosina deaminasi
Immunodeficienza Severa Combinata
Regolatore transmembranario
Fattore IX
Mucoviscidosi
Emofilia B
Fattore VIII
Emofilia A
α1-antitripsina
β-globina
Enfisema
Talassemia
Malattie genetiche classiche
1 gene coinvolto
Ripercussioni in diversi organi o tessuti
Controllo dell’espressione del gene
Malattie genetiche complesse
Più di un gene è coinvolto
Tumori, malattie cardiovascolari, ipertensione,
artrite
1
Terapia genica: quali malattie trattare?
Malattie genetiche classiche
1 gene coinvolto
Ripercussioni in diversi organi o tessuti
Controllo dell’espressione del gene
Malattie genetiche complesse
Più di un gene è coinvolto
Tumori, malattie cardiovascolari, ipertensione,
artrite
Barriere fisiologiche al transfer di acidi
nucleici nella cellula
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Stabilità
Penetrazione nella cellula
Sopravivenza nel citoplasma
Penetrazione nel nucleo
Rilascio dell'acido nucleico
Espressione
Malattie genetiche acquisite
Tumori d’origine virale, AIDS
Davis P.B. and Cooper M.J. (2007), AAPS Journal 9: E11
Costruzione dei vettori virali
Transfer dei geni
Vettori virali
Retrovirus / Lentivirus
Adenovirus
Adeno-associated virus (AAV)
Virus Pox
Vettori non virali
Liposomi
DNA nudo
Verma I.M. and Weitzman M.D. (2005), Annu. Rev. Biochem.74: 711
2
Adenovirus ricombinanti
Cassetta d'espressione: 8 kb
Assenza di integrazione ⇒ assenza di replicazione ⇒ perdita del
plasmide
Inoculazioni periodiche ⇒ stimolazione sistema immunitario
⇒ neutralizzazione del virus ricombinante
Reazioni tossiche, infiammatorie
AAV (adeno-associated virus)
Virus Pox
1977: Ultimo caso di vaiolo
• AAV: parvovirus non patogeni
• Virus difettivi (necessitano adenovirus
o herpes virus per la replicazione)
• Produzione complessa
• Integrazione possibile nel genoma
Vaccinia • Facile a produrre
• Costo basso
• Stabile
• Protezione di lunga durata
• Cassetta d'espressione: 4.5 kb
AAV particles around a single
adenovirus. Bar: 100 nm
187 kb, trascrizione e replicazione nel citoplasma
Vaccinia Ankara, canaripox, ecc.
3
Construction de recombinants du virus de la vaccine
SYSTEMA PLASMIDE - LIPOSOMA
Plasmidi
Liposomi
Endosoma
Nucleo
Prodotto d'espressione
della cassetta
Cassette d'espressione: 50 kb
Nessuna tossicità
VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) e ischemia muscolare
Iniezione di DNA nudo
Plasmide ricombinante
VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor
Ischemia muscolare
Baumgartner I., Isner J.M., et al., 1998
VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) et ischemia muscolare
Immunodeficienza Severa Combinata
Deossiadenosina
ADA: Adenosina deaminasi
Deossinosina
Deficienza ADA ⇒ ↑ deossiadenosina ⇒ tossicità per linfociti T
Settembre 1990: Introduzione di ADA + neoR tramite retrovirus nei
linfociti T di due piccole bambine
Immunità ↑
Baumgartner I., Isner J.M., et al., 1998
4
1999-2002
Ottobre 2002:
- 10 bambini trattati, di età <1 anno
- 9/10: Correzione OK
7/9: Ricostituzione cellule T: completa, stabile
Î vita normale (2007)
2/9: Ricostituzione cellule T: parziale
!
Malattia linfooproliferativa
monoclonale in 2 pazienti!
1 decesso
Gennaio 2005:
3° caso
2007: 4°, 5° caso
1999-2007
F + UK: 17/20 bambini trattati con successo
Inserzione del virus
ricombinante
Possibile meccanismo della malattia linfoproliferativa
Mutazione
oncogena
?
LMO2 gene map of activating retrovirus vector insertions
MFG-γc: retroviral vector
La sovrapproduzione della proteina LMO2 nelle cellule T blocca la differenziazione delle
cellule T e aumenta la loro propensione alla divisione. LMO2 è un oncogeno.
Berns A., 2004, NEJM 350:1679
Cavazzana-Calvo M. and Fischer A., J. Clin. Invest. (2007): 117: 1456
5
RT+Gendicina / RT: ↑3x della regressione completa, sia 64%
Ottobre 2003: autorizzazione e commercializzazione
Luglio 2005: 2'600 pazienti trattati
2006: 50'000 pazienti previsti
Update: March 2008
Vue d’ensemble des essais de TG en
Suisse
ADA (1)
CLI / PAOD (4)
ALS (2)
CRI (1)
CF (1)
VIH (4)
CLI: Critical limb ischemia
Ischemia critica degli arti inferiori
PAOD: Peripheral artery occlusive disease
arteriopatia obliterante degli arti
CRI: Chronic renal insufficiency
ALS: Amyotrophic lateral sclerosis
Sclerosi laterale amiotrofica
CF: Cystic fibrosis
Mucoviscidosi
Cancer (26)
Problemi legati alla terapia genica
Vecteurs utilisé
utilisés
Sicurezza del transfer dei geni
AAV (1)
Terapia genica su cellule germinali
AdV (8)
"Miglioramento" di un individuo
Vaccinia (13)
Retro (3)
Plasmid (14)
6
Two component zinc-finger nuclease
NUOVE POSSIBILITÀ DI TERAPIE
GENETICHE
• Riparazione di un gene mutato
• Oligonucleotidi antisens
• siRNA
Wilson JH (2003): Nature Biotechnology 7: 759
ZFN (Zinc finger nuclease) repair of a mutated gene
Oligonucleotidi antisens
New England Journal of Medecine 1996, 334: 316-318
[Vitravene: inibitore della replicazione del CMV]
Cavazzana-Calvo M. and Fischer A. (2007), J. Clin. Invest. 117: 1456
Short interfering RNA
Antisense
oligonucleotidebased manipulation
of pre-mRNA
splicing
A. Thalassemia
B. Duchenne Muscular Dystrophy
C. Spinal Muscular Atrophy
Wood M., Yin H., McClorey G. (2007),
PLoS Genetics 3: e109
RISC: RNA-induced silencing complex
New England Journal of Medecine 2006, 355: 2391
7
siRNA for isoformand allelic-specific
silencing
A. Tumour angiogenesis
B. Autosomal dominant slow
channel congenital
myasthenic syndrome
Wood M., Yin H., McClorey G. (2007),
PLoS Genetics 3: e109
8
