Laboratorio n° 3:
Sintomatologia fitopatologica
L’isolamento dei funghi
fitopatogeni
Indice della lezione
Sezione teorica
1.1. La sintomatologia
2.1. I postulati di Koch
2.2. Isolamento di fughi fitopatogeni
2.3. I substrati base
2.4. I substrati selettivi
Attività di laboratorio
3.1. Preparazione dei substrati (PDA e PDA + AL)
3.2. Pulizia dei tessuti vegetali
3.3. Prelievo dei tessuti vegetali
3.4. Piastramento dei tessuti vegetali
Lo studio dei sintomi
Malattia: condizione di sofferenza derivante da un’alterazione dei
normali processi fisiologici della pianta
Sintomi: manifestazioni visibili della malattia che sono conseguenza
delle alterazioni della fisiologia della pianta. Lo studio dei sintomi è
indicato come sintomatologia ed è una fase cruciale nel procedimento
diagnostico (processo volto a individuare le cause di una malattia).
L’insieme dei sintomi viene indicata come sindrome o quadro
sintomatologico.
Segni: presenza degli organi vegetativi o riproduttivi dei patogeni
(micelio, spore, sclerozi ecc)
Lo studio dei sintomi
Sintomi: i sintomi possono essere localizzati (compaiono soltanto sui
tessuti circostanti il punto di ingresso del patogeno) o sistemici (si
manifestano in modo diffuso su diverse parti o su tutta la pianta, quindi
lontano dal punto di ingresso del patogeno)
Classificazione dei sintomi:
- Modificazioni cromatiche
- Modificazioni di forma e dimensione
- Necrosi ed alterazioni degenerative
Modificazioni cromatiche: clorosi
Clorosi internervale (es.
carenza di ferro). La clorosi è
indice di un ridotto contenuto di
clorofilla del tessuto fotosintetico.
In caso di intense clorosi, si può
rilevare l’ingiallimento dei tessuti
fogliari.
Modificazioni cromatiche:
clorosi delle nervature
Le clorosi, in particolare quelle di origine virale, possono interessare
le nervature che divengono così più evidenti.
Modificazioni cromatiche: mosaico e striature
Mosaico: irregolare distribuzione
di zone decolorate.
Striature: nelle monocotiledoni gli
ingiallimenti e le decolorazioni
hanno andamento longitudinale,
parallelo alle nervature.
Modificazioni cromatiche: variegature
Variegatura:
quando
la
distribuzione di zone clorotiche
ingiallite diviene più estesa e di
forma irregolare si parla di
variegatura e non di mosaico.
Modificazioni cromatiche:
Ingiallimenti, arrossamenti e argentature
Arrossamenti internervale
imputabile a carenza di P
o K oppure a virosi
Plasmopara viticola
Chondrostereum purpureum
Modificazioni cromatiche:
screziature e rotture di colore
Screziature e rotture di colore: presenza di zone dei petali con aree di
colore diverso da quello normale.
Modificazioni cromatiche:
virescenza e fillomania
virescenza: condizione in cui un
tessuto colorato o bianco diviene
verde (es. petali)
fillomania: alterazione morfologica,
oltre che cromatica, per cui i petali si
trasformano in strutture simili a foglie
L’isolamento
dei funghi fitopatogeni
I postulati di Koch
I postulati di Koch sono originalmente dei criteri destinati a stabilire la relazione
di causa-effetto che lega un microrganismo ad una malattia. Koch isolò dai
tessuti di animali malati i bacilli del carbonchio, li coltivò in laboratorio e ne
identificò il ciclo vitale di tipo sporigeno. Attraverso l'inoculazione delle cellule
in animali non affetti da alcuna patologia osservò l'insorgenza della malattia e
la possibilità di isolare tale microrganismo dal tessuto degli animali infettati
sperimentalmente. Questi criteri sono conosciuti appunto come postulati di
Koch.
Robert Koch fu il primo ad adottare sperimentalmente alcuni criteri utili per
stabilire se un certo microrganismo sia o meno la causa di una certa malattia.
I postulati sono i seguenti:
1_ deve essere possibile isolare il microrganismo dall'ospite malato e farlo
crescere in coltura pura
2_ ogni volta che una coltura pura del microrganismo viene inoculata in un ospite
sano (ma suscettibile alla malattia), si riproduce la malattia
3_il microrganismo deve poter essere isolato nuovamente dall'ospite infettato
sperimentalmente.
I postulati di Koch
1°
3°
2°
L’isolamento dei funghi fitopatogeni
I microrganismi in natura non vivono mai in coltura pura ma
sempre in comunità microbiche diversificate. In particolare nel
suolo e nei residui vegetali sono presenti comunità miste
composte da organismi patogeni (capaci di una fase saprofitaria) e
saprofiti
I microrganismi esclusivamente saprofiti hanno una maggiore
capacità di colonizzare la sostanza organica morta rispetto ai
funghi fitopatogeni
L’isolamento di funghi fitopatogeni in presenza di microrganismi
saprofiti può essere difficoltosa, in particolare in presenza di
tessuti in fase avanzata di decomposizione. Conseguentemente si
può facilmente incappare in diagnosi errate.
I substrati nutritivi base
Numerosi microrganismi saprofiti possono essere coltivati su
substrati liquidi o solidi (agarizzati) contenenti:
- fonti di carbonio organico (glucosio, mannitolo, cellulosa, amido
ecc ecc)
- nutrienti in forma minerale o organica (N minerale oppure
organico presente nelle proteine, nei peptidi o negli aminoacidi)
- minerali e vitamine
PDA (Potato dextrose agar) e PDB (Potato dextrose broth)
- Estratto di patata (4 g /l)
- Destrosio (20 g / l)
- Agar (15 g / l)
I substrati generici sono in gradi di supportare la crescita di una
grande varietà di microbi (funghi, batteri, attinomiceti), quindi
hanno una bassa selettività
I substrati nutritivi selettivi
Può essere necessario isolare solo un gruppo di microrganismi (funghi
vs. batteri) o una singola specie di microrganismo da una comunità
microbica diversificata. In tal caso è necessario ricorrere ai substrati
selettivi.
La selettività si basa su principi:
1_Inibizione selettiva: si basa sull’utilizzo
di prodotti con attività antimicrobica
(comunemente antibiotici) verso alcuni microbi ma con attività assente o ridotta verso
l’organismo target. Es: antibiotici attivi contro batteri gram positivi (penicillina, vancomicina)
contro i gram negativi (streptomicina) e ad ampio spettro (tetraciclina, kanamicina,
cloramfenicolo ecc) ed attivi anche contro i funghi (pimaricina ecc). Spesso sono utilizzati
anche fungicidi commerciali (pentacloronitrobenzene = PCNB ecc)
2_Stimolazione selettiva:
si basa sull’utilizzo di fonti di carbonio o nutrienti
assimilabili esclusivamente o preferenzialmente dall’organismo target che risulta così
favorito nella competizione per il substrato. Es: mannitolo, cellobiosio, amido ecc.
3_Alterazione delle condizioni “ambientali”:
si basa sull’utilizzo di
molecole che non sono tossiche o substrati nutritivi ma che alterano le “condizioni
ambientali del substrato” (acidità, pressione osmotica, alcalinità). Es: acido lattico che
abbassando il pH fino a 3,5 favorisce i fughi a discapito dei batteri.
Isolamento di funghi fitopatogeni (1:4)
Isolamento da foglie e radici infette:
- Piante di lattuga presumibilmente attaccate da Sclerotinia
sclerotiorum
Sintomi e segni osservabili:
- Appassimento delle piante
- Marciume molle dei tessuti vegetali (colletto)
- Feltro di micelio bianco-grigiastro
- Strutture di resistenza del micete (sclerozi)
Isolamento di funghi fitopatogeni (2:4)
Isolamento da frutti:
- frutti di agrumi presumibilmente attaccati attaccati da Penicillium
italicum e Penicillium spp. (muffa verde-azzurra degli agrumi)
Sintomi e segni osservabili:
- Marciume molle dei tessuti vegetali
- Micelio bianco e verde-azzurro a seguito della sporulazione del
micete
Isolamento di funghi fitopatogeni (3:4)
Isolamento da rami infetti:
- Rami e germogli con sintomi di cancro del pesco
Fusicoccum amygdali
Cytospora spp.
Le infezioni sui germogli si presentano sotto forma di lesioni ellittiche, di colore brunonocciola, leggermente depresse e centrate solitamente in corrispondenza delle
gemme (imbrunimento perigemmale) per il Fusicoccum. Quando l’area imbrunita si
estende a formare cancri (zone necrotiche della zona corticale) tutta la circonferenza
del ramo provocare la morte della parte distale. Sui rami colpiti appaiono delle piccole
masserelle nerastre rotondeggianti di meno di 1 mm di diaetro, dapprima
sottoepidermiche e poi leggermente erompenti (picnidi). Ogni picnidio produce un
filamento (cirro) di colore biancastro o rosso-rosato (nel caso di Cytospora)
mucillaginoso, contenente gli organi di diffusione della malattia (conidi). Spesso si
assiste all’emissione di gomma dai cancri.
Isolamento di funghi fitopatogeni (4:4)
Isolamento da foglie:
- Foglie presumibilmente attaccate Microdochium panattonianum
(sinonimo:
Marssonina
panattoniana)
agente
causale
dell’antracnosi della lattuga e della scarola
Sintomi e segni osservabili:
- Lesioni circolari che divengono necrotiche fino all’impallinatura
- Presenza di ammassi di spore bianco-rosate sulla superficie delle
lesioni
Protocollo di isolamento (1:2)
1_Pulizia superficiale
- Primo lavaggio superficiale in acqua corrente. Segue un lavaggio in ipoclorito di sodio
(3%) per 5 minuti. Segue un lavaggio in acqua sterile per eliminare l’ipoclorito.
2_Taglio e prelievo del campione
- dimensioni del campione infetto da asportare (1-3 mm)
- asportare 6-10 porzioni di vegetale da ogni campione
- la zona di incisione va scelta accuratamente, evitando aree in avanzato stato di
decomposizione
- porre particolare attenzione nell’uso del bisturi
3_Lavaggio in acqua sterile
- i campioni devono essere lavati in acqua sterile tre volte (2-3 minuti per ogni lavaggio)
- al termine dei lavaggi i campioni devono essere posti ad asciugare in condizioni di
sterilità
4_Utilizzo del substrati
- i campioni lavati devono essere posti sul substrato selezionato in condizioni di sterilità
Protocollo di isolamento (2:2)
Computo materiali
- campioni vegetali infetti
- bisturi
- PDA (2 beute da 500 ml)
- Acido Lattico sterile da aggiungere al PDA (500 µl l-1)
- Piastre petri sterili (n° 35)
- Acqua sterile (1,000 ml)
- Falcon (15 ml) o eppendorf (2 ml) sterili
