Lezione 5

MARCATORI POLIMORFICI DEL DNA
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) (Studi
di associazione)
Variable Number of Tandem Repeats (VNTR)
Minisatelliti (Diagnostica forense)
Microsatelliti (Studi di associazione e diagnostica
forense)
Single Nucleotide Polymorphism (SNP) (Studi di
associazione anche per caratteri quantitativi)
Enzimi di restrizione
1) Sequenza di riconoscimento (da 4 a 8 basi) detta palindrome: rispetto
ad un asse di simmetria esiste la stessa sequenza di basi su entrambi i
filamenti quando questi vengono letti in direzione 5’- 3’;
2) Sporgenze al 5’ o al 3’;
3) Estremità coesive o non coesive;
4) Isoschizomeri (enzimi diversi che riconoscono la stessa sequenza);
5) Enzimi con sequenze di riconoscimento diverse ma che creano
estremità compatibili (isoschizomeri) (es: BamHI e MboI).
Enzimi di restrizione
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Polimorfismo per lunghezza di frammenti di restrizione
Identificazione di RFLP attraverso Southern blot
1.
Digestione del DNA genomico
con enzimi di restrizione
2.
Separazione dei frammenti per
elettroforesi su agarosio
3.
Immobilizzazione DNA con
trasferimento su membrana
4.
Ibridazione con sonda marcata
5.
Identificazione dell’ RLFP
Identificazione di RFLP attraverso Southern blot
Identificazione del peso molecolare delle bande dopo corsa
elettroforetica
DNA I: 19 mm = ~ 6,5 Kb
37 mm = ~ 1,2 kb
DNA II: 20 mm = ~ 5 Kb
35 mm = ~ 1,6 kb
37 mm = ~ 1,2 kb
Identificazione di RFLP dopo corsa elettroforetica
Dimensioni bande
Non digerito: 15 kb
EcoRI: 4, 5, 6 kb
BamHI: 3, 5, 7 kb
EcoRI + BamHI: 1, 3, 5 kb
4E
5E
3B
7B
B
3
6E
E
1
5B
E
5
B
1
5
Southern blot, Northern, Western …
Identificazione dell’allele S per la falcemia attraverso un RFLP
nel gene beta della globina: quando la mutazione altera il sito di
restrizione
Identificazione della segregazione di un allele patologico
attraverso un RFLP quando la mutazione altera il sito di
restrizione
Identificazione della segregazione di un allele patologico in una
malattia mendeliana attraverso l’associazione con un RFLP
MINISATELLITI
Sequenze ripetitive ipervariabili disperse nel genoma principalmente
nei telomeri (9-64 bp in blocchi da 0,1 a 20 kb).
Variabilità inter-individuale dovuta al numero di ripetizioni in tandem
Un locus
1
Un altro locus
2
Un altro locus
3
Esempio:
Sequenza di minisatellite: GGGCAGGAXC (core) simile alla sequenza
“chi” di E. coli, segnale per la ricombinazione generalizzata
Uso del fingerprint del
DNA per scopi medicolegali
(minisatelliti di Jeffreys)
(A) test di paternità
(B) test per casi di
violenza sessuale
VNTR: MICROSATELLITI o STR (SHORT TANDEM REPEATS)
Simple Tandem Repeats (1-5 bp) disperse nel genoma (blocchi inferiori a
100 bp)
Variabilità inter-individuale per numero di ripetizioni in tandem
ESEMPIO DI ALLELI DI UN LOCUS MICROSATELLITE NEL
GENOMA
Nel genoma umano ci sono circa:
130.000 STR dinucleotidici
8.700 STR trinucleotidici
23.700 STR tetranucleotidici
4.300 STR pentanlucleotidici
230 STR esanucleotidici
Microsatelliti analizzati con PCR e gel di acrilammide
Eredità di un locus microsatellite in una famiglia
Tre loci microsatelliti amplificati con PCR multiplex e analizzati
con sequenziatore
Marcatura di un primer
di ogni PCR con
diverso fluoroforo
Microsatelliti amplificati con PCR multiplex e analizzati con
sequenziatore
Prodotti di ogni singola PCR
marcati con coloranti
fluorescenti
Microsatelliti analizzati con sequenziatore
Tutti gli alleli noti per ogni locus microsatellite marcati con fluorofori
Fingerprinting genetico mediante loci microsatelliti
Fingerprinting genetico mediante loci microsatelliti
1
sbagliato!
IDENTIFICAZIONE DEL SESSO MEDIANTE PCR Y-SPECIFICA
MAPPA CROMOSOMICA DEI GENI AmelX E AmelY
Amelogenina: proteina presente nello smalto dei denti
Primo esone del gene AmelY (pseudogene) più lungo di 6 basi rispetto al gene AmelX.
Nel maschio: due bande di 106bp (AmelX) e 112bp (AmelY).
Nella femmina: due bande sovrapposte di 106bp (AmelX).
Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
Solitamente 2 alleli
Frequenti nel genoma (1 ogni kb)
Tasso mutazione: ca 10-9
Tipizzazione con procedura sequenziamento automatizzato
1000 Genomes Project: identificati oltre 11 milioni di SNP in
sequenze codificanti
Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
Esempio:
un soggetto
eterozigote
C/T
Coppia di
cromosomi
omologhi
In quella particolare posizione del genoma (locus) gli individui
possono essere classificati con 3 possibili genotipi:
omozigoti C/C, omozigoti T/T, o eterozigoti C/T
Analisi di SNP per lo studio delle relazioni evolutive
APLOTIPO
Specifica combinazione di due o più alleli di marcatori del
DNA situati vicino l’uno all’altro sulla stessa molecola di
DNA.
I polimorfismi per singolo nucleotide (SNP) sono i marcatori
più frequenti utilizzati per costruire aplotipi.
Gli aplotipi si generano per caso quando una serie di
mutazioni strettamente associate si accumulano nel corso
del tempo in cromosomi discendenti da un cromosoma
ancestrale
Analisi della combinazione di SNP adiacenti: l’aplotipo
Individuo 1
Individuo 2
Specifica combinazione di due o più alleli SNP situati vicino l’uno all’altro sulla
stessa molecola di DNA. Gli SNP sono i marcatori polimorfici più frequenti utilizzati
per costruire aplotipi.
Gli aplotipi si generano per caso quando una serie di mutazioni strettamente
associate si accumulano nel corso del tempo in cromosomi discendenti da un
cromosoma ancestrale
Formazione di aplotipi nel corso di un tempo evolutivo
Comparsa di 2
mutazioni
Comparsa di 3
mutazioni
Diversi tra loro
per 5 SNP
APLOTIPO
introne
esone
3’ UTR
+/-
+/-
Locus genico
Alleli RFLP
+/C/T
Alleli SNP
Popolazione A
1
Aplotipi RFLP 2
3
Aplotipi SNP 1
2
3
4
A/G
C/T
+
+
-
+
+
+
+
-
-
C
T
T
C
G
G
C
C
A
C
C
A
MAPPATURA RISPETTO AD APLOTIPO CON MARCATORI
MICROSATELLITI DEL DNA
Possibile
localizzazione
gene malattia
Rispetto ai marcatori sul braccio lungo del cromosoma, il gene
patologico mappa prossimalmente rispetto a S129.