Medicina di laboratorio
Biochimica clinica
Prof. Zuppi
30-03-06 ore 10.30-12-30
Effetto gancio (definione di Davide…): è l’effetto per cui all’aumentare della concentrazione
dell’antigene per esempio in una soluzione abbiamo all’inizio la formazione di poco complesso
antigene-anticorpo poi aumenta, entra in una fase di aumento lineare in cui è possibile avere il
dosaggio poi si arriva ad un equilibrio tra il numero di antigene e il numero di anticorpi per cui c’è
una specie di plateau (già qui non è possibile misurare) fino a che aumenta troppo la quantità
d’antigene e i complessi si abbassano e il grafico ha proprio la forma di un gancio per cui se noi
andiamo a dosare nella zona del loop del gancio avremo una concentrazione bassissima, sembrerà
che l’antigene non è presente quando invece è presente in altissime concentrazioni.
Se in laboratorio capita un valore basso cosa facciamo? (domanda della prof.)
Si diluisce. (Davide) faccio diluizioni seriali e rifaccio la prova in modo da accertare che
effettivamente il valore è basso, facendo le diluizioni posso rientrare nella famosa parte della salita
lineare.
Un altro tipo di interferenza nei dosaggi di immunochimica quale può essere?(PROF.)
Per esempio delle grosse reazioni.
La cosa più frequente che può capitare è che arriva l’alta incidenza dei pazienti diabetici, con
patologie del metabolismo glucidico e quindi ne studiamo la patologia.
METABOLISMO GLUCIDICO
I carboidrati sono i composti importanti per l’organismo e sono una fonte prima e più rapida di
energia,precursori di numerosi composti e sono classificati in mono-dimeri e polisaccaridi e con la
dieta si introduce soprattutto amido e glucosio oltre a lattosio e saccarosio. Questi carboidrati
vengono attaccati subito dall’amilasi salivare e formano destrine e maltosio. (ricordiamo che vanno
sotto il nome di amilasi pancreatiche tutte le amilasi non salivari e che quelle salivari possono
avere un valore di 10.000).
Questa amilasi salivare si blocca a livello dello stomaco perché è inibita dal pH acido e poi
interviene l’amilasi pancreatica che finisce la digestione del glucosio e del maltosio. Nell’intestino
tutti gli zuccheri devono essere assorbiti in forma di monosaccaridi quindi c’è un ulteriore scissione
da parte delle idrolasi intestinali (lattasi, maltasi,saccarasi..).
Glucosio e galattosio vengono trasportati nelle cellule intestinali da un carrier, il fruttosio entra per
gradiente (importate per terapie) poi dalla cellula intestinale vengono rilasciati in circolo e tramite
il sistema portale arrivano al fegato e qui viene attivata l’esochinasi epatica (glucochinasi) che
fosforila il glucosio. (per chi non se lo ricorda la glucochinasi non è inibita da Glu-6-P, ha
specificità assoluta per il glucosio e ha Km maggiore dell’Esochinasi). Avevamo già parlato della
glucochinasi a proposito della curva da carico. Infatti la quantità della glucochinasi è dipendente
dalla dieta, dall’età e dall’insulina: l’assorbimento del Glu che troviamo in circolo cambia da
persona a persona.
Il Glu-6-P può seguire varie vie metaboliche:
- utilizzato per la sintesi di glicogeno e quindi immagazzinato nel fegato;
- entra nel ciclo dei pentosi-fosfati;
- via glicolitica
- defosforilato a glucosio
GLUCONEOGENESI:
Sintesi ex novo di glucosio e glicogeno a partire da precursori non glucidici:
- ac.lattico di cui ne produciamo una grandissima quantità sia negli eritrociti e nei muscoli e
nel cervello;
- glicerolo che si forma per idrolisi dei trigliceridi
-
Amminoacidi glucogenici (la prof. ci esorta a rivedere gli enzimi che partecipano a questo
livello);
REGOLAZIONE DELLA GLICEMIA:
La glicemia del soggetto normale è di 110.
Abbiamo un controllo ormonale: insulina, glucagone, nora/adrenalina, cortisolo, GH.
L’Insulina riduce la concentrazione di glucosio perché:
-aumenta il trasporto di glucosio
-aumenta la sintesi del glicogeno
-aumenta l’utilizzo a livello cellulare
-aumenta la conversione degli ac.grassi
-aumenta la sintesi proteica
-inibisce la neoglucogenesi
-inibisce la chetogenesi
-inibisce la glicogenolisi
-inibisce la lipolisi.
Invece aumentano la glicemia il glucagone,l’adrenalina, il cortisolo e il GH.
METODI:
Sono due ma ancora qualcuno (definito pazzo dalla prof.)utilizza il primo gruppo di metodi.
1) metodi chimici di ossidoruzione: riduzione di ioni rameici e ferrici oppure facendo reagire il
glucosio con ammine aromatiche come ortotoulidina formando complessi colorati,
l’intensità del colore che si forma è direttamente proporzionale alla concentrazione dl
glucosio nel campione di sangue. Questo metodo però non è accurato perché nel sangue
queste reazioni sono fatte anche da altri zuccheri eventualmente presenti.
2) Metodi enzimatici (quelli consigliati): utilizzano
a) GOD (glucossossidasi) con glucosio porta alla formazione dell’acqua ossigenata che
poi viene evidenziata
b) ESOCHINASI con formazione intermedia di Glu-6-P e produzione di NADPH.
(aumento di assorbenza a 340 nm). Quest’ultimo è molto utilizzato.
Tutte le reazione enzimatiche che vengono dosate con metodo che utilizza l’enzima vanno a vedere
la differenza di densità ottica di NADH e NADPH(forme ridotte). Di questi sia la forma ossidata
sia la forma ridotta assorbono tutte e due a 340nm e hanno un bel picco. Inoltre le forme ridotte
(NADH e NADPH) hanno un secondo picco di assorbimento. Se alla data lunghezza d’onda
riaumenta il NADH vuol dire che si sta producendo in modo proporzionale all’attività dell’enzima,
in questo l’esochinasi la quale attività dell’esochinasi sarà proporzionale alla concentrazione di
glucosio iniziale che si sta cercando di misurare.
Questi metodi sono talmente standardizzati che ormai vengono fatti con 3 microlitri di campione e
hanno dei coefficienti di variazione che sono minimi. Questi coefficienti ci danno la misura della
precisione del metodo che è parte dell’errore analitico ma non identificano la deviazione standard.
(la deviazione standard di una glicemia misurata a 1000 è 10; la deviazione standard di una glicemia
misurata a 100 è 10. Il metodo misurato a 1000 è quello più preciso perché il coefficiente di
variazione che è il rapporto fra la deviazione standard e la media nel primo caso viene molto più
bassa del secondo.
CAMPIONE DI SCELTA
Per la determinazione della glicemia si possono utilizzare indifferentemente siero o plasma ma il
campione non deve essere emolizzato soprattutto se misuriamo il campione con un metodo come la
glucochinasi che si sviluppa il colore rosso perché il rosso dell’emolisi interferisce col metodo.
I comuni anticoagulanti non causano interferenze. E’ importante non lasciare la provetta con il
glucosio a temperatura ambiente in quanto il glucosio diminuisce anche del 10% l’ora perché gli
eritrociti consumano il glucosio con la glicolisi. Per tale motivo nel campione è necessario
addizionare un antiglicolitico (floruro) e in tal modo è stabile almeno per tre giorni a 4°C nel
frigorifero.
GLICEMIA A DIGIUNO
In soggetti normali dopo 10-12 ore di digiuno i livelli glicemici si mantengono tra 65110mg/100ml. Molti laboratori lo esprimono in mmol/l.
Non ci sono differenze fra maschi e femmine e tra razze sebbene i valori tendono ad aumentare con
l’età; i neonati presentano valori inferiori del 15% rispetto agli adulti (80 è già il limite, forse per
l’immaturità perché l’amilasi si matura dopo tre mesi) .La concentrazione di glucosio nel liquor è
crca il 60 % di quella del sangue. Non si può fare diagnosi di diabete solo con il valore della
glicemia perché è comunque è influenzata da altri fattori come lo stress, il fumo…ma comunque
una glicemia uguale o maggiore di 140 mg/100ml in più di un’occasione è diagnostica di diabete
mellito.
Valori elevati di glicemia però si riscontrano in una serie di patologie:diabete, acromegalia, S. di
Cushing,ipertiroidismo,cirrosi,feocromocitoma,malattia diencefalo-ipofisaria,febbre,
stress,trattamento con cortisonici.
Valori bassi si riscontrano in: epatopatie gravi,deficit di glucacorticoidi,insulinoma(tumore delle
cellule beta del pancreas, tumori extrapancreatici insulino-secernenti, nei neonati si riscontra
prematurità,diabete materno, asfissia perinatale.
Una glicemia singola non da un’idea di come l’organismo metabolizza,quindi è bene ripetere le
determinazioni di glicemia nell’arco della giornata. Due ore dopo il pranzo la glicemia sale,non
dovrebbe salire a valori superiori di 140mg,un valore di glicemia postprandiale superiore a 200mg
conferma che il paziente è diabetico. E’ necessario fare una glicemia postprandiale quando i
precedenti valori di glicemia non sono convincenti.
TEST DA CARICO ORALE DI GLUCOSIO
Se il paziente a digiuno ha una glicemia sempre di 140 e nel dopo pranzo ha sempre valori alti è
sicuramente un paziente diabetico e non si deve andarlo a studiare col test da carico.
-Procedure per la curva di carico di glucosio:
il paziente deve svolgere una normale attività fisica; deve seguire una dieta libera con un normale
contenuto di carboidrati prima del test; poi si reca in laboratorio e si controlla la glicemia a digiuno,
questa glicemia non supera i 126mg (considerando che superati i 126mg si tratta quasi sicuramente
di diabete), e gli viene somministrata una dose di Glu per bocca disciolto in acqua (75gr per adulti,
100 per gravide, per i bambini da 1,75 gr fino a un max di 75gr,quantità che dipendono dal peso
corporeo). I livelli glicemici sono controllati per 30 minuti per due-tre ore, nelle gravide fino a tre
ore perché l’assorbimento è più lento. La dose di Glu è somministrata per bocca perché così risulta
fisiologico il rilascio di insulina in seguito a questo stimolo gastrico.
-La curva da carico deve essere fatta:
per diagnosi di diabete gestazionale; per valutare gli individui con valori border line di glicemia a
digiuno; per individuare persone con familiarità diabetica ma che abbiano valori normali di
glicerina a digiuno e dopo pasto; per studiare pazienti con nefropatia, neuropatie,retinopatie non
motivate visto che possono essere delle complicanze frequenti di diabete; per studi epidemiologici.
-interferenze da tenere presente:
ansietà,sigarette,stress,caffè,ore delle giornata,nausea.
-prima dell’esecuzione del test,domande da porre:
se il paziente soffre di malassorbimento, ingestione di zuccheri, terapie con estrogeni e cortisone,
stess(interventi chirurgici e infezioni), peso, età, inattività.
-interpretazione dei risultati del test:
in un paziente normale i livelli di glucosio raggiungono il picco di 150mg dopo 30-60 minuti e
poi ritornano a quelli di partenza in poche ore. Nei pazienti diabetici i livelli di glucosio partono già
da livelli più alti, salgono ancora di più e raggiungono i 200mg e soprattutto dopo le due ore non
tornano ai livelli di partenza. In una gravida il picco si sposta,non si ha dopo un’ora ma
successivamente, lo stesso tipo di risposta si ha per pazienti con malassorbimento.
TEST DI TOLLERANZA AL GLUCOSIO ENDOVENA
Si utilizza in pazienti incapaci di tollerare un carico orale. Per farlo dobbiamo eliminare i fattori che
controllano l’assorbimento di Glu. La preparazione del paziente è la stessa, la dose che si da è
0,5 gr/Kg di peso corporeo fino a un max di 35gr infuso in soluzione in tre minuti. Il sangue viene
prelevato oltre che prima dell’infusione di Glu a 1-3-5-10 minuti dopo la fine dell’infusione.
Un altro test che si deve fare se arriva un paziente con una glicemia border line e con la glicemia
post prandiaile anch’essa border line (invece di fare una curva da carico) facciamo controllare la
GLICOSURIA. Infatti il glucosio compare nelle urine quando il carico tubulare è di 180 mg/dl.
Nelle urine la determinazione del glucosio viene eseguita con strisce reattive che si colorano.
Un altro parametro che si può studiare è la misurazione delle GLICOEMOGLOBINE HbA1c (o
emoglobina glicosilata). Non è una vera e propria glicosilazione ma soltanto un legame fra
emoglobina e glucosio, è un legame irreversibile che avviene senza l’azione enzimatica ma
semplicemente una condensazione tra il glucosio e e la valina dell’estremità N-terminale della
catena Beta. Queste glicoemoglobine si formano per vari motivi: i livelli glicemici del sangue sono
stati elevati in modo abdorne per tanto tempo quindi è direttamente proporzionale ai livelli
glicemici, è direttamente proporzionale anche al tempo di questi alti livelli glicemici e dipende dalla
vita media del globulo rosso (120gg). La misura della glicoemoglobina mi da quindi un’idea della
glicemia nei tre mesi precedenti. Possiamo avere dei valori falsamente bassi per esempio quando la
vita del globulo rosso dura di meno in caso di anemia emolitica. Essendo legata alla vita media del
globulo rosso è uno di quegli esami che possiamo perfettamente richiedere ogni dieci giorni.
Possono esserci dei fattori che interferiscono con i risultati come le varianti emoglobiniche
genetiche, varianti indotte ( es. emoglobina carbamilata in pazienti con insufficienza renale,
acetilata in pazienti trattati con aspirina), nel caso di emorragie, di tumori, di anemie emolitiche.
Oltre all’Hb glicata possiamo avere altre proteine glicate soprattutto l’albumina glicata
(fruttosamina) che viene utilizzata per valutare la glicemia in un periodo di tempo molto più breve
perché la vita media dell’albumina è 19 gg. Vado quindi a misurare un legame irreversibile non
enzimatico del glucosio con un gruppo lipidico dell’albumina.
Possiamo misurare i CORPI CHETONICI quando si ha un eccessivo catabolismo di ac. Grassi
con formazione di AcetilCoA che porta alla formazione di acetoacetato. Una parte viene
decarbosilata ed è convertita ad acetone e la maggior parte di aceto acetato è convertita in betaidrossi-butirrato. I tre corpi che tonici non sono presenti nel sangue nelle stesse proporzioni ma il
più presente (78%) è l’iddrossi-butirrato, il 20% è aceto acetato e il 2% l’acetone. Nel diabetico
grave la proporzione fra idrossibutirrato e acetoacetato da 4:1 può aumentare da 8:1.I corpi
chetonici vengono misurati nelle urine soprattutto, nelle urine lo stik utilizzato misura
essenzialmente acetoacetato che quindi si decarbosila rapidamente ad acetone che è volatile,quindi
non misuro il beta-idrossibutirrato,addirittura nel diabetico grave si può avvertire solo una debole
positività inoltre per effetto della terapia sembra che aumenti il beta-idrossibutirrato(non si capisce
bene..). Quando si devono misurare i corpi chetonici? soprattutto se si ha un diabetico che si sta
facendo delle… che potrebbero peggiorare la chetonuia.
Un altro parametro che si usa per valutare un paziente diabetico è l’ACIDO LATTICO che se ne
ha una grossa produzione dagli eritrociti,dai muscoli e dal cervello e la concentrazione dipende da
quanto viene prodotto e da quanto viene catabolizzato con il ciclo di Cori dal fegato che dopo un
po’ si satura. Si parla di ACIDOSI LATTICA quando il valore di ac. Lattico supera i 5mmol/l e il
pH scende a 7.25. Si può avere per due probemi: tipo A ipossico,è il più comune associata a
diminuita ossigenazione tissutale come nello shock, ipovolemia e nella insufficienza ventricolare
sinistra, tipo B per motivi metabolici associata a malattie (neoplasie,diabete,epatopatie) o a farmaci
e sostanze tossiche (etanolo,metanolo e salicilati) ,il meccanismo non è ancora chiarito,
probabilmente per una disfunzione mitocondriale. CURIOSITA’: normalmente è acido –L-lattico
ma la forma rara è dovuta all’acido-D-lattico. L’ac. Lattico è dosato anche nel liquor dove in genere
i valori vanno paralleli a quelli ematici a meno che non ci siano delle meningiti soprattutto
batteriche, per le meningiti virali non aumentano l’ac.lattico. Il prelievo appena fatto deve essere
portato in ghiaccio subito in laboratorio.
Lo studio di INSULINA E PEPTIDE C è indicato nello studio delle ipoglicemie,in stadi precoci
durante il test di tolleranza al Glu, nell’identificazione di pazienti diabetici con alto rischio di
complicanze degenerative, per distinguere i pazienti che richiedono insulinico da quelli che
richiedono solo trattamento dietetico. La determinazione dell’insulina può presentare interferenze
dovute a anticoagulanti,proteine, emolisi (perché nel globulo rosso c’è tanta insulinasi), anticorpi
antinsulinici.
Misuriamo il PEPTIDE C che è secreto in quantità equimolecolare rispetto all’insulina però ha
valori più alti e permette di riconoscere le ipoglicemie factitiae.
CASI CLINICI
1) Un giovane paziente diabetico insulino-dipendente si presente al controllo periodico.
Dati di laboratorio:
glicemia a digiuno 220mg/dl
(80-110)
glicosuria
2%
assente
Hb glicata
4.5%
(3.8-6.4)
L’Hb glicata suggerisce che il paziente ha mangiato troppo.
2) Una vedova di mezza età che viveva sola è stata ricoverata dopo che suo figlio l’ha ritrovata
in uno stato confusionale. All’esame obiettivo appare estremamente disidratata ma non
chetosica e il respiro era normale.
Dati di laboratorio :
sodio
149mmol/l
(135-147)
potassio
4.7mmol/l
(3.5-5)
azoto uretico 45mmg/dl
(5-23)
creatinina
2.1mg/dl
(0.6-1.2)
proteine
9g/dl
(6-8)
osmolarità
375mmol/Kg
(280-300)
Glu
iperglicemica (80-110)
L’osmolarità sierica è molto alta e riflette la grave iperglicemia che provoca una diuresi
osmotica con diminuzione della filtrazione glomerulare e ritenzione di urea e creatinina.
3) una ragazza di 18anni ha consultato un medico di famiglia per stanchezza e perdita di peso,
inoltre aveva notato poliuria, il dottore aveva riscontrato glicosuria per cui aveva consigliato
alla paziente di recarsi in un centro antidiabetico ma la paziente era rapidamente peggiorata
con vomito e sonnolenza, ricoverata all’ospedale aveva una pressione di 95/60 con 112
pulsazioni al minuto e le estremità fredde e il suo alito odorava di acetone.
Si deve richiedere un esame sull’equilibrio acido-base, la ragazza aveva acidosi metabolica.
Valentina e Nausica
