MEDICINA DI LABORATORIO
Ore 10.30-12.30 16/3/06
BIOCHIMICA CLINICA
( Aula Moscati )
AVVISO : martedì prossimo ci verrà detto come saranno organizzate le esercitazioni di medicina di
laboratorio . La prossima esercitazione riguarderà la lettura del sedimento urinario che è l’esame più
antico del mondo , utilizzato ancor prima di Esculapio.
Il nostro problema è imparare a interpretare bene i risultati del laboratorio, perciò è importante
conoscere tutte le tappe che portano a questo risultato. Abbiamo detto che il prelievo deve essere
effettuato con una certa tecnica perché può essere fonte di variabilità così come lo possono essere le
provette. La volta scorsa avevamo cominciato a parlare di Eparina.
ANTICOAGULANTI: non devono interferire nelle reazioni analitiche .
Eparina: ne abbiamo parlato l’altra volta. Ricordate:a) fate attenzione sulla provetta a quali sali di
eparina siano presenti, per esempio sali di sodio, di litio(perché in genere il dosaggio di
litio si fa in caso di patologie pediatriche). b) il rapporto quantità di sangue/eparina(se la
provetta contiene eparina per 10 ml, bisogna metterne almeno 8 per evitare il problema del
passaggio di acqua .
Agenti chelanti il calcio: -utilizzati nelle indagini particolari, ad esempio l’emocromo si fa in
EDTA.
-bloccano i cationi, ad esempio magnesio, europio(che può essere
utilizzato in reazioni di immunochimica) così da rallentare
quelle reazioni che utilizzano i cationi come cofattori. Ne deriva
che il valore delle transaminasi di un campione con EDTA sarà più basso
di un campione che ne è privo.
Raccontino patetico per farvi ricordare questo
concetto: al Gemelli c’è un grosso centro trapianti con un’ottima
sopravvivenza. Ad un congresso i dati del Gemelli riguardanti i trapianti
di fegato non concordavano con gli altri a causa di un alto livello di
esochinasi dovuto al fatto che il campione di esochinasi era stato tenuto
ad una temperatura più alta rispetto ai campioni degli altri centri.
NB:la reazione dell’esochinasi è termodipendente
EDTA: utilizzato per esami ematologici, per la determinazione dell’emoglobina e non interferisce
con la determinazione dell’NH3 .
Ossalato: utilizzato per indagini di coagulazione ma è associato al fluoruro per i dosaggi di
glicemia perché il fluoruro è un antiglicolitico. E’ importante impedire la glicolisi
a livello dei globuli rossi: se un campione di sangue non trattato viene analizzato in un
tempo sufficientemente rapido i globuli rossi “affamati” usano il glucosio abbassando i
livelli di glicemia del 10%.
Citrato: utilizzato in rapporto 9:1 per lo studio della coagulazione plasmatica, della fibrinolisi e
della funzionalità piastrinica e rapporto 4:1 per determinare la velocità di
eritrosedimentazione. Le provette della VES, della coagulazione contengono tutte citrato
ma in un rapporto sangue/anticoagulante diverso, è evidente che il sangue che viene messo
deve essere usato altrimenti si altera il rapporto.
Agenti antiglicolitici: utilizzati per impedire che il glucosio nel campione diminuisca per effetto
della glicolisi nelle emazie (Es:fluoruro di cui abbiamo già parlato)
A livello del prelievo la maggiore interferenza che si può avere sui risultati del laboratorio è
l’emolisi.
EMOLISI: rottura dei globuli rossi, può essere :
Meccanica: dovuta ad eccessiva forza aspirante durante il prelievo o a pressione sullo stantuffo al
momento dell’aspirazione
Osmotica(o chimica): dovuta alla presenza di alcool (citrosil) nell’ago in siringa (nel caso in cui
si esagera nel disinfettare il paziente prima del prelievo, basta una goccia di
citrosil ad emolizzare tutto il sangue che passa) o nei contenitori(un tempo
le suore vi tenevano a bagnomaria le siringhe)
Fisica: dovuta a conservazione prolungata e scorretta(ad esempio una provetta tenuta a lungo nel
Freezer va incontro a rottura)
Cause biologiche: dovute a patologie del globulo rosso (sferocitosi, ecc)
L’emolisi interferisce perché durante la rottura del globulo rosso si liberano sostanze che
vi erano contenute: proteine, lattico deidrogenasi, GOP, insulinasi (in caso di emolisi infatti il
valore dell’ insulina è alterato, non può essere letto).
CONSERVAZIONE DI CAMPIONI DI SANGUE:
Questi, se non ben conservati, possono subire variazioni della concentrazione di uno o più
costituenti per:
Assorbimento di analiti: su pareti di provette di vetro o di plastica(ne esistono di tantissimi tipi).
Comporta che più tempo passa dal prelievo più alterazioni potranno
verificarsi nel campione.
Evaporazione costituenti volatili: ad esempio l’alcool etilico che può essere dosato per problemi
medico legali seri; corpi chetonici nelle urine(lo stick con cui
si dosano le urine misura solo l’acetoacetato, ma questo si
trasforma rapidamente in acetone che è volatile).
Cambiamento permeabilità membrana eritrocitaria
Attività metaboliche: persistenti in eritrociti e leucociti quali consumo ossigeno, produzione
CO2, variazioni pH, attività glicolitiche, autodegradazioni attività
Enzimatiche.
Colonizzazione batterica: altro raccontino patetico:il personale deputato al trasporto di
campioni di routine dal reparto di trapianto di fegato al laboratorio,
incurante del proprio compito”scorrazzava”tra i reparti, perdendo
molto tempo.
Le provette così, una volta analizzate, presentavano livelli altissimi di
(
NH3 (importante indice di funzionalità epatica) dovuti allo sviluppo di batteri.
Quindi lo stesso campione può dare risultati diversi.
Buona norma per conservare campioni di sangue: separare il prima possibile il siero (o plasma)
dalla parte corpuscolata e conservare a 4°C.
AVVISO: tutte queste interferenze vanno ricordate ma non verranno chieste all’esame.
COMPITO DEL LABORATORIO:dare risultati il più vicino possibile ai valori reali.
FASE ANALITICA
L’attendibilità di un dato analitico è determinata da: precisione, accuratezza, specificità,
sensibilità del metodo utilizzato per la sua determinazione(quando parliamo di metodo non
intendiamo solo il kit ma anche il personale e lo strumento che vengono utilizzati).
Precisione: capacità di una procedura di fornire risultati riproducibili entro un range accettabile di
variazione analitica. Corrispondenza tra i singoli replicati in una serie di misure. Non ha valore
numerico ma è quantificata dalla imprecisione espressa come derivazione standard e coefficiente di
variazione.
DS=∑(M-Xi)²/n-1
CV=DS x 100/M
CV: coefficiente di variazione
DS: derivazione standard
M: media
Xi: singola misurazione
n: numero misurazioni
Quindi calcolo la precisione e la esprimo come coefficiente di variazione. Si preferisce
l’espressione tramite il CV perché per esempio se abbiamo 1000 mg/ml di glicemia e facciamo 10
misure che variano tutte da 290 a 1010, la DS è 10. Se consideriamo, inoltre, un campione di
glicemia di 100 mg/ml le misure variano al massimo da 90 a 110, la DS è nuovamente 10. Il metodo
più preciso è il primo perché il CV è esattamente 10 volte inferiore essendo uguale al rapporto DS x
100/M (più la media è alta più CV è piccolo). Molti laboratori che danno il risultato, danno il CV.
E’ vero che bisogna avere delle misure ripetibili ma è anche vero che queste misure devono essere
reali, ecco perché introduciamo un altro parametro:
Accuratezza: capacità di una procedura(insieme delle manovre che portano ad un determinato
risultato) di fornire risultati che riflettano la vera quantità di un analita o risultato che concordi con
la condizione del paziente, è il grado di concordanza fra risultato della misurazione e il risultato
vero. Il valore vero può essere un valore astratto non misurabile in pratica ed è quindi un valore
convenzionale. E’(l’accuratezza) un valore insito al soggetto: per esempio la glicemia può esser
misurata o con un metodo enzimatico o sfruttando le capacità riducenti del glucosio. La differenza
fra questi 2 metodi è che il primo è più accurato del secondo perché legato al tipo di reazione che si
fa avvenire e perché non solo il glucosio presenta capacità riducente ma anche altri zuccheri
possiedono capacità riducente. La scelta del metodo è dunque limitata. Caratteristica del metodo è
la sensibilità analitica.
Sensibilità analitica: il più basso livello ancora misurabile di un analita. E’ espressa dalla curva di
calibrazione. Limite rilevazione è il risultato minimo che può essere distinto con buona probabilità.
Altro raccontino patetico: l’altro giorno è arrivato un professore che mi ha chiesto di misurare
l’ADH nel sangue del topo ed io gli ho detto”il mio metodo arriva a misurare 5 mg/ml. Quanto
ADH ha il topo? Se il topo ha una quantità di ADH inferiore minore non posso misurarla”. Ecco
perchè la sensibilità analitica è importante ma non basta, bisogna sempre considerare anche il
coefficiente di variazione che deve essere basso per evitare eventuali errori casuali nel metodo di
misurazione. Il metodo deve essere inoltre specifico.
Specificità analitica: capacità di una misura di misurare solo l’analita desiderato.
Ripetibilità: grado di concordanza fra risultati di successive misurazioni effettuate variando una
serie di parametri compreso l’osservatore(chi effettua la misurazione). Valutare questo parametro è
compito del laboratorista.
Calibrazione:comprende le operazioni in condizioni specifiche tra i valori indicati da uno
strumento di analisi e i corrispondenti valori noti di un analita. Come si effettua? Si prende una
soluzione standard(preparata a livello internazionale) in modo da garantire l’accuratezza, si fa una
serie di variazioni così da garantire che i valori che “escono” dallo strumento siano effettivamente i
valori esatti. Questo processo è molto difficile per i metodi immunochimici perché se è complicato
costruire uno standard per il glucosio, lo é ancor più costruire uno standard per un ormone. Questo
problema è stato in parte risolto con gli ormoni ricombinanti, in parte perché gli ormoni che
circolano presentano diverse isoforme.
Range dinamico/linearità: è il range in cui l’analita fornisce un segnale lineare senza diluizione o
trattamento del campione. Come viene calcolato? Si prende una serie di standard( per esempio un
valore a 100, a 50, a 10, a 5) si misurano le densità ottiche e si ottengono una serie di punti che
vanno a formare una retta (vedi grafico 1). Se capita un campione con una concentrazione al di
sopra del range di linearità del metodo che è stato utilizzato, bisogna ripetere l’operazione diluendo
il campione in modo da rientrare in quel range. Non bisogna dimenticare inoltre di moltiplicare per
il fattore di diluizione.
La performance analitica di un metodo è definita dai seguenti parametri:
1) precisione within-run(precisione all’interno della corsa:misura fatta 10 volte) e
between-run(CV tra le diverse corse )controllata a differenti concentrazioni
dell’analita
2) limite inferiore di misura(sensibilità analitica)
3) sensibilità funzionale (precisione between-run 20%)
4) linearità
5) recupero(se è poco vuol dire che il metodo non è lineare né preciso)
6) intervalli di riferimento
7) correlazione con metodo di riferimento
FASE POSTANALITICA:
a)refertazione
b)interpretazione risultato
Il referto deve essere posto accanto a valori di riferimento che dipendono da molti fattori:
Razza, età(un bambino di 3 giorni è diverso da uno di 7 mesi), sesso(estrogeni, concentrazione di
ferro, etc), attività(l’altra volta avevamo parlato del CK del centometrista di colore). Per conoscere
i valori normali di un metodo bisogna tener conto della popolazione di riferimento. Le variazioni tra
una popolazione ed un’altra sono sicuramente minime ma è necessario considerarle. Per esempio il
valore del γ GT(enzima di tutti gli epiteli ma soprattutto in quelli dei canalicoli biliari) in una
popolazione astemia è sicuramente diverso dal valore misurato su un campione di popolazione del
Veneto(i Veneti bevono di più). Ecco perché i valori normali per il γ GT di un laboratorio di
Padova che utilizza la stessa procedura nostra, lo stesso metodo, sono più alti.
APPROPRIATA POPOLAZIONE NORMALE:
-Pazienti con gli stessi sintomi(esempio: dolore al torace)
-Stessa età
-Normali ospedalizzati
-Stesso sesso
-Stessa patologia di base.
Una volta scelta la popolazione i risultati ottenuti sono inseribili in una gaussiana. Sono da
considerare valori normali quelli intorno alla media. Purtroppo spesso le distribuzioni non sono
gaussiane e quindi è da considerare il percentile. Dobbiamo dire anche che essendovi, ad esempio,
delle variazioni circadiane nell’ambito della stessa giornata relativamente al cortisolo, GH,
bisogna sapere come sono stati calcolati i valori di riferimento(l’ora). Una volta a conoscenza dei
valori di riferimento, si pone il problema di sapere se il paziente è malato o meno. Una situazione
ideale prevederebbe all’ interno di un sistema di assi cartesiani l’esistenza di 2 gaussiane separate,
una relativa ai soggetti sani, e un’altra relativa ai soggetti malati. Il più delle volte però queste due
gaussiane sono sovrapposte(vedi A fig.1.1 pag 5 Widmann), in tal caso il limite superiore, il range
di riferimento per il normale può essere scelto:a) in modo tale da permettere una separazione
ottimale fra le due popolazioni individui sani e individui malati(vedi A fig.1.1 pag 5): separa la
popolazione sana in veri negativi e falsi positivi(vedi B) e separa la popolazione malata in veri
positivi e falsi negativi(vedi C); b) nel punto in cui la gaussiana della salute(prima a destra)
intercetta l’ascissa, in tal caso però si ha la sicurezza che gli individui sani si trovino all’interno, ma
con essi, anche i malati(Vedi grafico2); c)nel punto in cui la gaussiana della malattia intercetta
l’ascissa, in tal caso si ha la sicurezza che gli individui malati siano all’interno, ma con essi anche i
sani(vedi grafico 3)
SENSITIVITA’: indica la probabilità di un test negativo quando la malattia è assente. E’ negatività
in salute. Per esempio la troponina nell’ infarto è un test sensibile perché negli infartuati viene
sempre positivo. Siccome
Sens %(sensitività)=TP(positives true)/FN(false negatives) + TP
La sensitività è più vicina ad uno quanto è più basso il numero dei falsi negativi(la troponina nei
normali è negativa).Sensitività=positività nel malato. In questo caso il cut off è spostato a
destra(caso c)
SPECIFICITA’:indica la probabilità di un test negativo quando la malattia è assente
Sp%(specificità)=TN(true negatives)/TP + TN
Specificità=negatività in salute. Più piccolo è il numero dei TP più alta è la specificità.
PREDITTIVITA’
Valore predittivo: probabilità che la malattia sia presente o assente quando il test è positivo o
negativo
Predittività positiva= TP/ TP + FP
Predittività negativa=TN/TN + FN
La predittività può essere positiva o negativa.
Esempio: 140 di glucosio altamente predittivo di diabete
80 di glucosio predittivo negativo del diabete
Es: la tirochinasi nel melanoma se assente è predittivo negativo di metastasi. Se è positivo non è
detto che siano presenti metastasi, quindi il valore di predittività negativo è indipendente dal
positivo.
I “perché” della Prof
1)In una donna di 35 anni che deve essere operata di appendicectomia è misurato il potassio. Il
biochimico comunica alla sala operatoria che è di 45 mg/ml(valori normali 3,5-5,00 mM/l)il
chirurgo rimane imperturbabile e telefona al laboratorio.
(Rimane imperturbabile perché quel valore è incompatibile con la vita: la virgola è stata omessa!!!)
2)Ad una festa di paese un gruppo di volontari esegue un test side-room. Un undicenne si sottopone
al test e presenta valori alti di glicemia. Ha un cugino giovane affetto di diabete. Il giorno dopo
ripete le analisi che presentano valori normali di glicemia.
(Alla festa si era abbuffato!!!Il porco….perchè era tutto gratis…)
