non-io

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Lab. Biochimica
POLARIMETRIA
La polarimetria è una tecnica analitica strumentale che sfrutta il cambiamento di direzione del piano di vibrazione della
luce linearmente polarizzata durante il suo passaggio attraverso uno strato trasparente di una sostanza anisotropa
(caratteristiche fisiche diverse in tutte le direzioni).
Essa trova applicazione prevalentemente nello studio di strutture molecolari e nell’analisi quantitativa
delle soluzioni di sostanze otticamente attive, in quanto la direzione e l’entità della rotazione dipendono
dal potere rotatorio di queste.
La luce e sue proprietà
La luce ordinaria è una radiazione elettromagnetica con proprietà simili ad un’onda che si allontana
dalla sorgente lungo la linea di propagazione. Un raggio di luce è costituito da due componenti che
vibrano su piani perpendicolari tra loro: un campo elettrico ed un campo magnetico, oscillanti, che
variano rapidissimamente di verso ed intensità. I piani su cui avvengono le vibrazioni sinusoidali di
ciascun campo (elettrico e magnetico) oltre ad essere perpendicolari tra di loro sono perpendicolari alla
direzione di propagazione del raggio.
La distanza fra due creste successive è definita lunghezza d’onda ().
L’ampiezza della vibrazione corrisponde alla sua intensità.
L’energia luminosa consiste di più onde elettromagnetiche che vibrano su piani differenti. La luce
“ordinaria”, infatti, vibra su un numero infinito di piani perpendicolari alla direzione di
propagazione
Luce polarizzata
Se questa luce ordinaria passa attraverso un filtro
polarizzatore ottico, la luce emergente sarà un raggio il
cui vettore elettrico vibra su un singolo piano.
L’energia risultante è chiamata luce polarizzata su un piano (o
linearmente polarizzata).
In realtà la luce piano-polarizzata è la risultante di due
componenti polarizzate circolarmente opposte, dirette
verso destra e verso sinistra, in concordanza di fase e
con uguale frequenza ed ampiezza.
Quando una delle due componenti è rallentata da un
mezzo chirale i vettori destro e sinistro si troveranno
fuori fase e quindi cambierà l’orientamento del piano di
polarizzazione.
1
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luce ordinaria
luce polarizzata:
vettori campi elettrico
e magnetico
La luce può anche essere polarizzata circolarmente o ellitticamente: circolarmente, se il
piano di oscillazione ruota continuamente, con regolarità periodica, attorno la
direzione di propagazione, per cui il vettore rappresentativo del campo elettrico
descrive una spirale a proiezione circolare; ellitticamente, se la spirale descritta dal
vettore ha proiezione ellittica.
Attività ottica e composti chirali
Si definisce attività ottica la capacità di un composto di ruotare il piano di
vibrazione della luce linearmente polarizzata, in una direzione o nell’altra.
In genere, le sostanze dotate di asimmetria cristallina o molecolare possiedono
questa capacità. Le sostanze anisotrope (asimmetriche) quindi fanno ruotare il piano
di vibrazione dell’onda-luce polarizzata, per cui sono otticamente attive. Un
esempio è dato dagli zuccheri e dagli amminoacidi.
Come è noto, esistono composti organici contenenti uno o più atomi di carbonio al quale sono legati
quattro differenti gruppi funzionali. Dal momento che un atomo di carbonio con legami semplici ha
una geometria tetraedrica (ibridizzazione sp3), i quattro gruppi funzionali possono esservi legati con due
configurazioni diverse, dando origine a due molecole, una immagine speculare dell’altra, cioè una
coppia di antipodi ottici (enantiomeri).
Questa particolare geometria influenza la trasmissione della luce piano-polarizzata dando a tali molecole
la proprietà dell’attività ottica. Quindi, sostanze in grado di ruotare il piano di vibrazione della luce
polarizzata sono dette otticamente attive.
Polarizzatori
Per l’analisi polarimetrica bisogna disporre di luce polarizzata che si ottiene mediante l’uso di dispositivi
detti polarizzatori. Il polarizzatore ha sulla luce naturale una funzione filtrante, che permette di isolare
raggi luminosi i cui vettori elettrici vibrano tutti su un solo piano.
Sono polarizzatori:
- tormalina1 (la sua trasmittanza però dipende dalla lunghezza d’onda)
- prisma di Nicol (due prismi di calcite incollati con balsamo del Canadà)
- herapatiti2 (sostanze dicroiche ottenute artificialmente)
Prisma di Nicol
Un cristallo di spato d’Islanda 3viene tagliato in due secondo un
piano diagonale B. le due parti vengono poi riunite e saldate con
balsamo del Canada4. L’inclinazione del cristallo rispetto al
raggio incidente I viene studiata in modo che il raggio ordinario
O incida sulla superficie B secondo un angolo superiore
all’angolo limite5, mentre il raggio straordinario S può penetrare
nel balsamo ed emergere, polarizzato, dalla parte opposta del
cristallo. Il raggio O deviato verrà assorbito dalla faccia inferiore
annerita del cristallo C.
1
Minerale: silicato complesso di metalli diversi, di colore variabile in relazione alla composizione chimica; le varietà
trasparenti sono usate come gemme di notevole pregio
2
Sostanze microcristalline polarizzabili elettricamente di origine sintetica derivate da reazioni dello iodio con solfato di
chinino
3
Varietà limpida di calcite, in grossi cristalli utilizzabili per strumenti ottici.
4
Liquido secreto da varie piante, costituito per lo più da resine, che all’aria diviene vischioso o solido
5
Valore di angolo oltre il quale si ha riflessione e non rifrazione (quando l’angolo di rifrazione tende a 90°, l’angolo di
incidenza assume valore di angolo limite)
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Quando un raggio di luce naturale, monocromatico penetra nel prisma, esso subisce rifrazione e viene
sdoppiato in due raggi linearmente polarizzati (fenomeno della birifrangenza), uno detto ordinario e
l’altro straordinario, con piani di polarizzazione perpendicolari tra loro. Il raggio ordinario incide sulla
faccia interna del prisma con un angolo tale da farlo riflettere totalmente all’interno e da venire
assorbito da una parete appositamente annerita; il raggio straordinario incide sulla faccia interna del
prisma con un angolo tale da passare inalterato. Dal prisma di Nicol emerge pertanto un raggio pianopolarizzato parallelo al raggio naturale incidente.
Polarimetro
I polarimetri sono gli strumenti che permettono di misurare il potere rotatorio di sostanze otticamente
attive.
Il cuore di un polarimetro è costituito dal materiale anisotropo che, grazie al fenomeno della
birifrangenza, è in grado di polarizzare la luce.
Birifrangenza
Un raggio di luce ordinaria r, che attraversa un
mezzo anisotropo, si sdoppia nei raggi O
(ordinario) e S (straordinario) polarizzati
perpendicolarmente tra di loro.
Il fenomeno è detto anche doppia rifrazione perché
entrambi i raggi risultano deviati rispetto alla
direzione del raggio incidente, ma con un diverso
indice di rifrazione e risultano polarizzati
linearmente su piani ortogonali.
I componenti principali di un polarimetro sono:
1. sorgente luminosa
2. polarizzatore
3. tubo polarimetrico
4. analizzatore
5. oculare
6. scala per misurare l’angolo di rotazione
(A) Schema di un comune polarimetro ottico
S =sorgente P =polarizzatore principale Pa =polarizzatore
ausiliario, parallelo al principale T =tubo contenente il campione
An =polarizzatore analizzatore, perpendicolare al principale,
ruotabile e montato su un nonio Lc e Lf =lenti O =oculare
(B) Nella fase di azzeramento il polarizzatore An viene ruotato finché nell’oculare O non si nota una condizione di
penombra uniforme. A questo corrisponde una posizione b del nonio.
(C) Quando viene introdotto nel tubo un campione otticamente attivo, nell’oculare si notano due semicerchi di diversa
intensità.
(D) Infine si ruota An fino a ripristinare la condizione di penombra uniforme (posizione c del nonio). La differenza
fra c e b corrisponde all’angolo di rotazione della luce polarizzata dovuto al campione.
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In una prima fase il polarizzatore ausiliario e l’analizzatore vengono allineati in modo tale che, quando il
tubo è vuoto o riempito di opportuno solvente, all’oculare si possano osservare due semicerchi
illuminati di luce gialla con la medesima intensità. In seguito si ruota l’analizzatore per realizzare le
condizioni di massima oscurità ed in corrispondenza di questa posizione viene controllata la posizione
dello zero.
In un secondo momento si introduce la soluzione campione nel tubo e si fa ruotare l’analizzatore in
modo da ripristinare le condizioni di uguale intensità dei due semicerchi attraverso l’oculare. Un nonio
fornirà l’entità dell’angolo di rotazione misurato.
Valutazione del segno del potere rotatorio
Per convenzione, le sostanze che ruotano verso destra il piano della luce polarizzata sono dette
destrogire, al contrario, se lo ruotano verso sinistra sono dette levogire. E’ importante sottolineare che
non si può dedurre il segno del potere rotatorio specifico di una sostanza incognita con una sola
determinazione polarimetrica. In assenza, o con tubo polarimetrico vuoto si ha campo dell’oculare
uniforme in corrispondenza di 0° e di 180°; introducendo il mezzo otticamente attivo, si ristabilisce
l’estinzione (campo dell’oculare uniforme) facendo ruotare l’analizzatore di un angolo , ma anche
facendolo ruotare in senso opposto di  - 180°
Per evitare errori nella valutazione, quando la sostanza in esame non è nota, è indispensabile fare una
doppia misurazione utilizzando nella seconda un tubo di lunghezza metà del precedente:
- se la sostanza è destrogira si otterranno valori corrispondenti ad /2 e /2 ± 180.
- se la sostanza è levogira si otterranno valori corrispondenti ad -180/2 e -180/2 ± 180.
Dagli angoli trovati nella seconda misura è possibile ricavare il valore corretto.
Esempio
La misurazione su una sostanza attiva, in tubo da 4 dm, dà l’uniformità di campo a +78° () ed a –102°
(-180). Ripetendo la misura in tubo da 2 dm si trovano i valori –51° e +129°; la rotazione di –51°
soddisfa la relazione (-180)/2 per cui si deduce che la sostanza è levogira e poiché si è utilizzato un
tubo polarimetrico di 2 dm il suo potere rotatorio specifico sarà [] = –51°/2 = –25,5°
Rotazione ottica
Per un composto otticamente attivo l’angolo di rotazione sperimentale  (espresso in gradi) del piano
di polarizzazione dipende dalla concentrazione c del composto, dalla lunghezza del cammino l e da un
fattore k, dove k è una caratteristica del composto, detta “potere rotatorio specifico”
=c•l•k
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Potere rotatorio specifico
Il potere rotatorio specifico, o [], è una costante fisica e quindi una proprietà intrinseca dei composti
che presentano attività ottica. E’ una grandezza che rappresenta la rotazione in gradi provocata da un
grammo di sostanza sciolto in 100 ml di soluzione, posta in un tubo polarimetrico di 1 dm; esso
dipende dalla temperatura e dalla lunghezza d’onda utilizzata; si indica con:
o, standardizzando
questi parametri a 20°
e riga D dello spettro
del sodio, con:
t
[]

20
[]
D
per cui sostituendo nella formula precedente:
20
da cui:
 = c • l •[]
20

[] =
D
D
c • l
Da questa relazione, conoscendo il potere rotatorio specifico, è possibile ricavare facilmente, dalla
misura dell’angolo , la concentrazione incognita di una soluzione.
20
c =  • 100 / l • []
D
esempio di calcolo del potere rotatorio specifico:
una soluzione contenente in 10 ml 400 mg di soluto è posta in una cella di 10 cm di lunghezza; la
rotazione osservata in questo campione a 20°C usando la riga D del sodio è di +4,36°. Calcolare la
rotazione specifica del soluto.
La concentrazione è di 400 mg / 10 ml, cioè 0,4 g /10 ml, cioè ancora 4 g / 100 ml; per cui sostituendo
20
+4,36 • 100
= + 109°
[] =
D
4 • 1
5