MATERIALI E METODI CARATTERIZZAZIONE DEL NUMERO E

MATERIALI E METODI
1)
CARATTERIZZAZIONE DEL NUMERO E DIAMETRO MEDIO DEI NEURONI
DEL GCS DI TOPI WILD-TYPE E MDX
1.1) Animali
In questa serie di esperimenti sono stati utilizzati topi C57BL/10 (di controllo) e topi
geneticamente distrofici C57BL/10 mdx/mdx (Charles River SPA, Calco, Italy) aventi un’età
di 5 giorni (P5), 10 giorni (P10), 15 giorni (P15), 21 giorni (P21) e 6-7 settimane. L’intervallo
di 6-7 settimane di età è compreso in un periodo di tempo più ampio che va dalle 4 alle 8
settimane in cui nei topi mdx si verifica l’intenso ciclo di degenerazione/rigenerazione dei
muscoli scheletrici (De La Porte et al., 1999).
Gli animali sono stati trattati in accordo con la regolamentazione stabilita dalla Comunità
Europea (n° 86/609/CEE del 24 Novembre 1986) e dal Decreto Legislativo n° 116 del 27
Gennaio 1992.
1.2) Determinazione del numero e del diametro medio dei neuroni del ganglio cervicale
superiore
Per determinare il numero dei neuroni gangliari abbiamo utilizzato GCS dissezionati da tre
topi di controllo e tre topi mdx per ogni data postnatale considerata. Topi a P5, P10 e P15
sono stati anestetizzati mediante breve inalazione di etere, decapitati e i GCS, rapidamente
dissezionati, sono stati fissati per immersione in glutaraldeide al 2,5% diluita in tampone
cacodilato 0,1 M, pH 7,4, per 2 h a 4°C e successivamente sottoposti a 3 lavaggi da 15 min in
tampone cacodilato 0,1 M per rimuovere l’eccesso di fissativo. Diversamente, i topi a P21 e
6-7 settimane post-natali sono stati anestetizzati profondamente con cloralio idrato (400
mg/Kg p.c.) e perfusi attraverso l’aorta ascendente con una soluzione di Ringer ossigenato a
pH 7,3, seguita da un fissativo composto dal 2,5% di glutaraldeide in tampone cacodilato 0,1
M, pH 7,4. Entrambe le soluzioni sono state introdotte nel sistema circolatorio alla stessa
pressione del sangue utilizzando una pressione di caduta di 60 cm. In questo caso i GCS sono
stati prelevati dopo la perfusione.
Una volta fissati sia mediante immersione che per perfusione, tutti i gangli sono stati postfissati in una soluzione di tetrossido di osmio al 2% in tampone cacodilato 0,1 M per 1 h,
lavati accuratamente in H2O bidistillata e, dopo 5 min in alcool etilico al 50%, sono stati
immersi in una soluzione di acetato di uranile al 2% sciolto in alcool etilico al 70% per 20
min. Successivamente, i campioni sono stati disidratati utilizzando una scala ascendente di
alcool etilici (10 min in etanolo 80%, 10 min in etanolo 95%, 2 x 10 min in etanolo 100%) e
ossido di propilene (2 x 10 min). Tutti i passaggi dalla post-fissazione all’etanolo 95%
compreso sono stati eseguiti ad una temperatura di 4°C, il resto a temperatura ambiente (TA).
Dopo una notte in una miscela 1:1 di ossido di propilene e resina epossidica Epon 812, e
successive 4 h in resina assoluta, i GCS sono stati inclusi in resina preparata al momento
dell’uso e lasciati polimerizzare per tre giorni a 60°C. Ciascun ganglio è stato tagliato
interamente in sezioni semifini seriate di 2 µm di spessore mediante un ultramicrotomo
Reichert-Jung Ultracut E. Le sezioni sono state raccolte su vetrini portaoggetto, colorate con
una soluzione di blu di toluidina 0,1% e borace 0,1% in H2O distillata ed infine chiuse
permanentemente con balsamo Eukitt.
Per la determinazione del numero di neuroni gangliari, da ogni serie di sezioni semifini ne è
stata selezionata una ogni 5 (per una distanza complessiva tra una sezione e l’altra di 10 µm) e
sono stati contati al microscopio ottico esclusivamente i neuroni nucleolati. I valori ottenuti da
ciascuna sezione sono stati poi sommati per otterene il numero totale di neuroni. La scelta dei
neuroni nucleolati consente di ridurre il rischio di contare due volte uno stesso neurone in
quanto le dimensioni dei nucleoli sono mediamente al di sotto dei 10 µm di spessore presi
come intervallo tra una sezione e la seguente. I valori effettivi, tuttavia, potrebbero essere
sottostimati. Le conte sono state eseguite separatamente da due sperimentatori per verificarne
la riproducibilità. Per ogni data sperimentale sono stati utilizzati tre animali, quindi i valori
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finali ottenuti rappresentano la media  e.s.m. delle conte effettuate su ciascuno dei tre gangli.
Le differenze riscontrate tra una data e l’altra, così come all’interno di una stessa data tra topi
di controllo e topi mdx sono state confrontate tramite l’analisi statistica del t di Student.
Il diametro medio dei neuroni gangliari di topi adulti è stato determinato selezionando alcune
sezioni semifini utilizzate per la conta cellulare e misurandone il diametro medio attraverso
l’uso di un oculare graduato montato su un microscopio ottico a 40X. Sono stati scelti trenta
neuroni in diverse regioni di ciascun ganglio (10 dal polo distale, 10 dall’area centrale e 10
dal polo prossimale) e misurati, per un totale di 90 neuroni per ogni ceppo murino.
2)
CARATTERIZZAZIONE DELL’ESPRESSIONE DELLA T-OH E DELLA Dp427
NEGLI ORGANI BERSAGLIO DEL GCS
2.1) Anticorpi.
L’estenzione e la distribuzione delle fibre adrenergiche negli organi periferici del GCS sono
state valute mediante immunolocalizzazione della tirosina idrossilasi (T-OH) utilizzando un
anticorpo policlonale (Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA) diluito 1:100.
L’espressione e la localizzazione della distrofina sono state analizzate utilizzando un antisiero
policlonale diretto contro la proteina distrofina ricombinante (i residui 1-246 nella porzione
N-terminale) (Knuesel et al., 1999), che riconosce la distrofina a più alto peso molecolare ed è
stato utilizzato diluito 1:3000. L’espressione della distrofina a più alto peso molecolare da
parte delle cellule muscolari lisce nell’iride e nella ghiandola sottomandibolare è stata
ottenuta mediante colocalizzazione della distrofina con l’actina del muscolo liscio usando un
anticorpo policlonale (Abcam Limited, Cambridge, UK) diluito 1:100.
2.2) Immunocitochimica
La T-OH è stata rivelata, al microscopio ottico, nel cuore, iridi e ghiandole sottomandibolari
di tre topi wild-type e di tre topi mdx a P5, P10 e 6-7 settimane di età. I topi a P5 e P10 sono
stati anestetizzati mediante breve inalazione di etere e sacrificati per decapitazione. Il cuore, le
iridi e le ghiandole sottomandibolari sono stati prelevati e fissati con una soluzione di
formalina al 4% in tampone fosfato (PB) 0,1 M per 2 h a 4°C. Gli animali adulti sono stati
anestetizzati profondamente con cloralio idrato (400 mg/Kg p.c.) e perfusi con una soluzione
di formalina al 4% in PB 0,1 M seguendo la procedura descritta nel paragrafo 1.2. Il cuore, le
iridi e le ghiandole sottomandibolari sono stati prelevati dopo la perfusione e tutti i campioni
sono stati crioprotetti in una soluzione al 30% di saccarosio, per una notte a 4°C, e
successivamente tagliati al criostato in sezioni di 12 µm di spessore raccolte su vetrini
gelatinati.
Nel cuore e nella ghiandola sottomandibolare la presenza di immunoreattività per la tirosina
idrossilasi (T-OH) è stata rivelata con il metodo della perossidasi-anti-perossidasi. Dopo
essere state scongelate, le sezioni di tessuto sono state incubate per 10 min a TA con una
soluzione contenente il 10% di metanolo, il 3% di H2O2 e tampone Tris/HCl 0,5 M, pH 7,6 ,
allo scopo di inattivare le perossidasi endogene. Dopo un lavaggio in Tris/HCl 0,5 M le
sezioni sono state incubate con una soluzione di blocco dei siti antigenici aspecifici costituita
dal 5% di latte in polvere (LP) e lo 0,5% di Triton X-100 disciolti sempre in Tris/HCl 0,5 M e
successivamente incubate per 36 h a 4°C con l’anticorpo primario policlonale anti-T-OH,
ottenuto in coniglio e purificato per affinità (Chemicon International Inc., Temecula, CA),
diluito 1:100 in LP 1% e Triton X-100 0,2% in Tris/HCl 0,5 M. Dopo un accurato lavaggio in
tampone, le sezioni sono state incubate per 1 h a TA con un anticorpo secondario (diluito
1:300) prodotto in capra e diretto contro le IgG di coniglio (Strenberger Monoclonals Inc.,
Baltimore, MD, USA), lavate con tampone e di nuovo incubate per 1 h a TA con un anticorpo
terziario (diluito 1:1000) prodotto in coniglio e diretto contro la perossidasi (Strenberger
Monoclonals Inc., Baltimore, MD, USA). Dopo un ulteriore lavaggio con tampone, il legame
degli anticorpi con i relativi antigeni è stato rivelato incubando le sezioni per 20 min a TA con
3-3’-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB) allo 0.05% e H2O2 allo 0,01% in Tris/HCl. In
questo caso si ha una reazione di ossido-riduzione che avviene ad opera della perossidasi nella
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quale l’H2O2 è l’accettore di elettroni che derivano dalla DAB, la quale ossidandosi forma un
precipitato marrone insolubile. Dopo una serie di lavaggi in Tris/HCl e un passaggio in cresyl
gel (0,1% di gelatina in etanolo 80%) i vetrini sono stati chiusi permanentemente con balsamo
Eukitt.
A causa della pigmentazione nera presente nell’iride che non consente di evidenziare il
precipitato marrone della DAB, l’immunoreattività per la T-OH in questa struttura è stata
rivelata mediante immunofluorescenza. Le sezioni di iride ottenute al criostato sono state
inizialmente incubate con una soluzione di blocco dei siti antigenici aspecifici contenente
l’1% di albumina di siero bovino (BSA), il 10% di siero normale di capra (NGS) e lo 0,2% di
Triton X-100 in PB 0,1 M pH 7,4 per 1 h a TA. Le sezioni sono state successivamente
incubate per 36 h a 4 °C con l’anticorpo primario diluito in una soluzione contenente l’1% di
BSA, l’1% di NGS e lo 0,1% di Triton X-100 in PB 0,1 M, lavate con PB e incubate di nuovo
per 1 h, a TA e al buio con un anticorpo secondario, prodotto in capra e diretto contro le IgG
di coniglio, coniugato con il fluorocromo CYTM3 (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.,
West Grove, PS, USA), diluito 1:400 nello stesso diluente utilizzato per l’anticorpo primario.
Il fluorocromo CYTM3 assorbe nello spettro della rodamina ed emette luce rossa in seguito ad
eccitazione con lunghezze d’onda comprese tra i 520 e i 560 nm. Dopo lavaggio con PB al
buio, i vetrini sono stati chiusi con una soluzione 1:3 di glicerolo e tampone fosfato salino
(PBS). I vetrini sono stati tenuti al buio e a 4°C fino al momento dell’osservazione effettuata
ad un microscopio a fluorescenza (Axiophot, Zeiss).
La distrofina a più alto peso molecolare e l’actina del muscolo liscio sono state rivelate
utilizzando due topi wild-type e due topi mdx. Gli animali sono stati anestetizzati con etere e
sacrificati mediante decapitazione. Il cuore, le iride e le ghiandole sottomandibolari sono state
dissezionati rapidamente, congelati in OCT e conservati a –80°C fino al momento dell’uso.
Sezioni di 10 m di spessore ottenute da ogni campione sono state raccolte su vetrini
elettrostatici e poi fissate per immersione con una soluzione contenente 2% di formalina in 0.1
M PB, pH 7.4. Dopo un breve lavaggio con PBS, le sezioni sono state incubate per 15 min a
temperatura ambiente con una soluzione di blocco contenente 4% NGS e 0.5% Triton X-100
in PBS, lavate con PBS e quindi incubate per 24h a 4°C con l’anticorpo policlonale diretto
contro la distrofina. Dopo tre lavaggi da 10 min con PBS le sezioni sono state incubate con
l’anticorpo secondario (Alexa Fluor 594 10g/ml) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR,
USA). Le sezioni di iride e ghiandola sottomandibolare sono state successivamente lavate e
incubate, per 24h a 4°C, con l’anticorpo primario diretto contro l’actina del muscolo liscio,
infine rivelato con l’anticorpo secondario Cy2 TM-coniugato con il frammento F(ab)2 (Jackson
Immunoresearch Laboratories, Inc., PA, USA) diluito 1:100. Le sezioni sono state coperte con
vetrinicoprioggetto e osservate sia al microscopio a fluorescenza della Zeiss Axiophot che al
confocale della Leika.
Sezioni di controllo di ogni preparato sono state ottenute omettendo l’anticorpo primario. Le
sezioni sono state quindi trattate come precedentemente descritto.
3) MARCATURA RETROGRADA DEI NEURONI DEL GANGLIO CERVICALE
SUPERIORE MEDIANTE INIEZIONE DI WGA-HRP ED ANALISI QUANTITATIVA
I neuroni che proiettano alla ghiandola sottomandibolare ed all’iride sono stati identificati
mediante marcatura retrograda con perossidasi di rafano coniugata con l’agglutinina del
germe di grano (WGA-HRP). Nella ghiandola sottomandibolare sinistra di tre topi di
controllo adulti e di tre topi mdx adulti, precedentemente anestetizzati, sono stati iniettati 5 l
di 2% WGA-HRP diluita con 2% dimetilsulfossido e soluzione salina sterile. Sono state
eseguite cinque iniezioni di 1l ciascuna in diverse aree della ghiandola sottomandibolare
utilizzando un ago di 30 1/2 gauge, collegato ad una siringa Hamilton attraverso un tubo di
polietilene (PE-20). Per marcare i neuroni che proiettano all’iride, sono stati iniettati 3l di
5% WGA-HRP nella camera anteriore dell’occhio (in prossimità dell’iride) di tre topi di
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controllo adulti e di tre topi mdx adulti. Per minimizzare l’eccessiva diluizione del tracciante e
la sua rimozione dovuta alla regolare sostituzione dell’umor aqueous, 10-15 min prima della
marcatura retrograda abbiamo iniettato nella camera anteriore dell’occhio una soluzione
contenente 2% metilcellulosa diluita in soluzione salina sterile (Pescosolido et al., 1998). La
metilcellulosa forma un polimero che riduce e/o blocca la rimozione dell’umor aqueous
ostruendo temporaneamente il canale di Schlemm’s, senza essere degradata o indurre risposta
immunitaria. Otto ore dopo l’iniezione nella ghiandola sottomandibolare o nella anteriore
dell’occhio, i topi sono stati anestetizzati e perfusi con un fissativo composto da 1%
paraformaldeide e 1.5% glutaraldeide in 0.1MPB, a pH 7.4. Una volta dissezionati, i GCS
sono stati crioprotetti per 24 h con 30% saccarosio e tagliati in sezioni semifini seriate (15 m
di spessore) raccolte flottanti in tre canestrini. Ogni canestrino contiene una serie completa di
sezioni separate tra di loro da 30 m. La reazione con la DAB ha poi permesso di visualizzare
la WGA-HRP all’interno dei corpi cellulari neuronali. Alcune sezioni di ghiandola
sottomandibolare sono state tagliate e processate come descritto per verificare l’omogeneità
delle iniezioni con WGA-HRP. Una volta eseguita la reazione con la DAB le sezioni sono
state montate su vetrini poi chiusi con balsamo Eukit.
I neuroni marcati con WGA-HRP sono stati contati al microscopio ottico. Per ogni ganglio, il
numero finale di neuroni è stato riportato come la media ± SEM delle conte eseguite su una
singola serie di sezioni raccolte nei tre canestrini. Le differenze tra le conte sono state
confrontate statisticamente utilizzando il test del t di Student.
4)
ANALISI BIOCHIMICA DELLA T-OH E DELLA Dp427 NEGLI ORGANI
BERSAGLIO DEL GCS
4.1) Preparazione degli estratti tissutali, elettroforesi e Western blotting
Topi adulti sono stati anestetizzati con etere e sacrificati mediante decapitazione. Il cuore, le
iridi e le ghiandole sottomandibolari sono state prelevate rapidamente, congelate e conservate
a –80°C. Al momento dell’uso i tessuti sono stati scongelati ed omogenati in ghiaccio con
tampone RIPA contenente 50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 1% sodio dodecil solfato (SDS),
1% Triton e una miscela di inibitori (1 mM PMSF, 10 g/ml leupeptina, 10 g/ml pepstatina,
1 mM EDTA, 0.2mM Na3VO4 e 0.1mM NaF). Dopo centrifugazione (15000 g per 15 min a
4°C), il supernatante è stato suddiviso in aliquote e la concentrazione di proteine è stata
determinata con il kit Micro BCA (Pierce, Rockford, IL, USA). Quantità note di supernatante
di ogni campione (40g per il cuore, 20g per le iridi e 60g per la ghiandola
sottomandibolare) sono state diluite 1:3 con LB 4X (200mM Tris/HCl pH 6.8, 4% SDS, 30%
glicerolo, 4% -mercaptoetanolo, 4% blue di bromofenolo), separate per elettroforesi su gel di
poliacrilamide-SDS al 6-15% (per la rivelazione Dp427) o al 7% (per la rivelazione della TOH) e trasferite su membrana di nitrocellulosa. Dopo 2 ore di blocco dei siti aspecifici in latte
in polvere al 5% in TTBS (20 mM TRIS/HCl pH 7.5, 500 mM NaCl e 0.05% Tween-20) le
membrane sono state incubate per 18 ore a 4°C con l’anticorpo primario, diluito in 3% BSA
in TTBS. Per la caratterizzazione biochimica della Dp427 è stato utilizzato l’anticorpo
monoclonale Dys1 diluito 1:15 (Novocastra, Newcastle, U.K.). Dys1 è diretto contro il mid
rod domain della distrofina e riconosce la distrofina ad alto peso molecolare (peso molecolare
427 kDa). Per lo studio dell’espressione della T-OH è stato utilizzato lo stesso anticorpo usato
per l’immunocitochimica, diluito 1:500. Dopo due lavaggi in TTBS, e tre in latte in polvere al
2.5% in TTBS, le membrane sono state incubate per 1 h a TA con l’anticorpo secondario
coniugato con la perossidasi di rafano (Promega, Madison, WI, USA), diluito 1:10000 in latte
in polvere al 2.5% in TTBS. Le bande riconosciute dall’anticorpo sono state messe in
evidenza mediante chemiluminescenza con il metodo ECL (enhanced chemiluminescence
procedure, Pierce, Rockford, IL, USA) e visualizzate tramite esposizione di lastre fotografiche
X-OMAT (Kodak, Cedex, Francia).
4
5) ANALISI ULTRASTUTTURALE DEGLI ORGANI BERSAGLIO DEL GCS
5.1) Microscopia elettronica
L’analisi ultrastrutturale del cuore e dell’iride è stata condotta su topi di controllo e mdx a P10
e a 6-7 settimane di età. Tutte le procedure di anestesia, sacrificio, fissazione ed inclusione del
materiale in resina epossidica sono state precedentemente descritte nel paragrafo 1.2. Dai
preparati ottenuti sono state tagliate sezioni ultrasottili (60-70 nm di spessore) utilizzando un
ultramicrotomo Reichert-Jung Ultracut E. Le sezioni sono state raccolte su retini di rame di 3
mm di diametro, contrastate con una soluzione di acetato di uranile al 4% e con una di citrato
di piombo al 2%, entrambi disciolti in H2O bidistillata, ed osservate ad un microscopio
elettronico (Philips EM208S) a trasmissione a 80kV.
6) COLORAZIONE CON EVANS BLUE DEGLI ORGANI BERSAGLIO DEL GCS
Il sale diazo-tetrasodico Evans blue (Evans blue dye, EBD), sciolto in PBS a una
concentrazione di 0,5 mg EBD/0,05 ml PBS, è stato iniettato (50 l/10 g p.c.) nel peritoneo di
topi a P10 e 6-7 settimane di vita. L’EBD è un colorante fluorescente che si lega all’albumina
nel sangue ed è in grado di penetrare nelle cellule la cui membrana è danneggiata (Straub et
al., 1997). La colorazione blu assunta dalle orecchie e dalle zampe degli animali è indice
dell’efficacia dell’iniezione. Gli animali sono stati sacrificati, previa anestesia in etere (P10) o
con cloralio idrato (adulto), dopo 6 h dall’iniezione. Il cuore, le iridi e i muscoli quadricipiti
femorali, utilizzati come controllo positivo, sono stati prelevati e fissati con l’8% di formalina
diluita in PB 0,1 M pH 7,4 per 2 h a 4°C. Dopo alcuni lavaggi in PBS, i tessuti sono stati
crioprotetti in saccarosio 30% per una notte e tagliati al criostato. Le sezioni, di 12 m di
spessore, sono state raccolte su vetrini gelatinati, post-fissate in acetone freddo a –20 °C per
10 min e lavate con PBS. I vetrini sono stati chiusi con una soluzione 1:3 di glicerolo e PBS
ed osservate ad un microscopio a fluorescenza (Axiphot, Zeiss) utilizzando il filtro per la
rodamina.
7) CARATTERIZZAZIONE DELLE MMPS NEL SCG DI RATTO E VARIAZIONI
INDOTTE DA ASSOTOMIA DEI NEURONI GANGLIARI
7.1) Schiacciamento dei nervi postgangliari del ganglio cervicale superiore di ratto
Animali. In questa serie di esperimenti sono stati utilizzati ratti Wistar maschi (150-200 g)
(Charles River S, p. a. Calco, Italia). Gli animali sono stati trattati in accordo con la
regolamentazione stabilita dalla Comunità Europea (n° 86/609/CEE del 24 Novembre 1986) e
dal Decreto Legislativo n° 116 del 27 Gennaio 1992.
I ratti sono stati anestetizzati mediante un’iniezione intraperitoneale di una miscela di xilazina
(20 mg/ml, 0.5 ml/kg peso corporeo; Bayer, Leverkusen, Germania) e Zoletil (tiletamina e
zolazepam, 100 mg/ml, 0.5 ml/kg peso corporeo; Virbac, Carros, Francia), che consente un
pronto recupero dell’animale dopo l’operazione.
Il ganglio cervicale superiore destro è stato esposto nel seguente modo: è stata praticata
ventralmente, nella regione cervicale, una incisione della cute; il connettivo è stato scollato e
le ghiandole sottomandibolari sono state spostate lateralmente. Mediante un retrattore è stata
scostata la trachea, esponendo la carotide comune. Quest’ultima è stata leggermente tirata
verso l’esterno, mettendo così in evidenza il ganglio, il tronco simpatico cervicale (il
principale nervo afferente) ed i nervi carotidei interno ed esterno, cioè i due rami postgangliari
più importanti. Entrambi i nervi carotidei sono stati schiacciati, per qualche secondo, con
delle pinzette a punta sottile Dumont n° 5, a circa 1 mm di distanza dalla base del ganglio
(Fig. VIII). In tal modo gli assoni dei neuroni gangliari vengono interrotti (pertanto, da ora in
poi, l’operazione di schiacciamento dei nervi verrà indicata anche col termine di assotomia),
ma la guaina connettivale che riveste il nervo resta integra, consentendo la guida delle fibre
rigeneranti verso i propri organi bersaglio. L’intervento è stato condotto senza alterare
l’irrorazione sanguigna del ganglio.
5
Al termine dell’operazione la ferita è stata suturata con filo di seta e disinfettata con citrosil
bruno. La ptosi omolaterale della palpebra è stata utilizzata come criterio per la valutazione
della buona riuscita dell’operazione.
Figura VIII Rappresentazione schematica del
ganglio cervicale superiore: le frecce indicano i
punti dove sono state schiacciati i nervi
postgangliari (CST=tronco simpatico cervicale;
ICN=nervo carotideo interno; ECN=nervo carotideo
esterno) (modificato da Dail e Barton, 1993).
7.2) Sacrificio animali e prelievo organi per il Western immunoblot e gel zimografia
Ratti di controllo ed operati (i tempi post-operatori presi in considerazione sono stati 15, 30,
60 minuti e 1, 3, 5 giorni) sono stati anestetizzati con etere e decapitati. I GCS di controllo e
operati sono stati prelevati e conservati a –70°C fino al momento dell’uso.
7.3) Anticorpi
Gli anticorpi monoclonali diretti contro MMP-2 (diluito 1:100), MT1-MMP (10g/ml) e
TIMP-2 (5g/ml) utilizzati per Western immunoblot sono stati acquistati presso la ditta
Oncogene Research (Calbiochem, La Jolla, Ca, USA). L’anticorpo policlonale diretto contro
MMP-2 (diluito 1:2000) è stato utilizzato per lo studio di immunocitochimica è stato
acquistato presso la ditta Immunological Sciences (Roma, Italy). L’anticorpo monoclonale
diretto contro il -distroglicano, clone 43 DAG 1/8D5 (diluito 1:25) utilizzato per Western
immunoblot è prodotto da Novocastra Laboratories Ltd (Newcastle, UK).
7.4) Gel zimografia
Due pools di quattro gangli ciascuno per ogni condizione sperimentale (controllo, 15, 30, 60
minuti e 1, 3, 5 giorni dopo assotomia) sono stati omogenati (in accordo con il protocollo
utilizzato da Hernandez-Barrates et al., 2000), in ghiaccio, con un tampone di estrazione non
riducente contenente 100 mM Tris/HCl pH 7.6, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM
PMSF e 1% di cocktail di inibitori (2 mM leupeptina, 1.5 mM pepstatina A, 80 M
aprotinina, 4 mM bestatina, 1.4 mM E-64, 104 mM AEBSF). Dopo centrifugazione (15000 g
per 15 min a 4°C), un volume noto di ogni supernatante è stato diluito (1:3) con il loading
buffer LB 4x non riducente (4% SDS, 200 mM Tris/HCl pH 6.8, 30% glicerolo, 0.04% blue
di bromofenolo), e congelato senza essere bollito. Volumi uguali di ogni campione sono stati
caricati e separati elettroforeticamente a 4°C su gel di poliacrilammide-SDS al 7.5%
contenente 1.5 mg/ml di gelatina porcina (Sigma-Aldrich srl, Milano, Italia). Dopo due
lavaggi, di 15 min ciascuno, in 2.5% Triton X-100 (per rimuovere l’SDS), i gel sono stati
incubati a 37°C per due notti con un tampone di reazione contenente 50mM Tris/HCl pH 7.6,
5 mM CaCl2 e 0.02% NaN3. Dopo l’incubazione i gel sono stati colorati con 0.5% blue
Comassie sciolto in 30% metanolo e 20% acido acetico per 24 h e poi decolorati con una
soluzione contente 30% metanolo e 20% acido acetico. Le proteine con attività gelatinolitica
sono state visualizzate come chiare zone di lisi sullo sfondo blue del gel di gelatina ed
identificate confrontandole con la forma latente e attiva del peptide ricombinante di MMP-2
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(Chemicon International Inc., Ca, USA) che aveva corso sullo stesso gel. L’attività
gelatinolitica è assente quando al mezzo di incubazione si aggiunge 20 mM EDTA.
7.5) Elettroforesi e Western immunoblot
Due pools di quattro gangli ciascuno per ogni tempo sperimentale (controllo, 15, 30, 60 min e
1, 3, 5 giorni dopo assotomia) sono stati omogenati in ghiaccio con un tampone contenente 50
mM Tris/HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% SDS, 1% Triton X-100, 10 mg/ml
pepstatina, 10 mg/ml leupeptina, 1 mM PMSF, 0.2 mM NaVO e 0.1 mM NaF. Dopo
centrifugazione (15000 g per 15 min a 4°C), il supernatante è stato suddiviso in aliquote e la
concentrazione di proteine è stata determinata con il kit Micro BCA (Pierce, Rockford, IL,
USA). Una uguale concentrazione di proteine per ogni campione è stata separata per
elettroforesi su gel di poliacrilamide-SDS e trasferita su membrana di nitrocellulosa. Dopo 2
ore di blocco dei siti aspecifici in latte in polvere al 5% in TTBS (20 mM TRIS/HCl pH 7.6,
500 mM NaCl e 0.05% Tween-20) la membrana è stata incubata per 18 ore a 4°C con
l’anticorpo primario diluito in 3% BSA e 0.05% NaN3 in TTBS. Dopo due lavaggi in TTBS, e
tre in latte in polvere al 2.5% in TTBS, la membrana è stata incubata con l’anticorpo
secondario coniugato con la perossidasi di rafano (Promega, Madison, WI, USA), diluito
1:10000 in latte in polvere al 2.5% in TTBS. Le bande riconosciute dall’anticorpo sono state
messe in evidenza mediante chemiluminescenza con il metodo ECL (enhanced
chemiluminescence procedure, Pierce, Rockford, IL, USA) e visualizzate tramite esposizione
di lastre fotografiche X-OMAT (Kodak, Cedex, Francia).
8) LOCALIZZAZIONE CELLULARE E SUBCELLULARE DELL’ATTIVITÀ E
DELL’ESPRESSIONE DELLA MMP-2
8.1) Zimografia in situ
Due gangli di controllo e due a 5 giorni postoperatori sono stati dissezionati, inclusi in OCT e
congelati rapidamente in ghiaccio secco. Ciascun ganglio, non fissato, è stato tagliato al
criostato in sezioni seriate di 10 m di spessore. Le sezioni sono state raccolte su vetrini e
ricoperte con un tampone di reazione (50 mM Tris/HCl pH 7.6, 5mMCaCl2 e 0.02% NaN3)
contenente 40g/ml di gelatina coniugata con fluoresceina schermata (Molecular Probes Inc.,
Eugene, Oregon) (Oh et al., 1999). Dopo 16 h di incubazione a 37°C, le sezioni sono state
lavate con PBS e fissate con 4% paraformaldeide in PBS. Il segnale fluorescente generato
dall’attività gelatinolitica, quando presente, è stato osservato e fotografato al microscopio
ottico. Sezioni di controllo sono state ottenute aggiungendo 20 mM EDTA al tampone di
reazione.
8.2) Perfusione dei ratti per la microscopia ottica ed elettronica
Due ratti di controllo e due operati (5 giorni dopo assotomia), sono stati anestetizzati
profondamente mediante iniezione intraperitoneale con una miscela di xilazina (20 mg/ml, 0.5
ml/kg peso corporeo; Bayer, Leverkusen, Germania) e Zoletil (tiletamina e zolazepam, 100
mg/ml, 0.5 ml/kg peso corporeo; Virbac, Carros, Francia).
Gli animali sono stati perfusi attraverso l’aorta con soluzione di Ringer ossigenata a pH 7.3,
seguita immediatamente da un fissativo, costituito da paraformaldeide al 4%, depolimerizzata
al momento dell’uso, in tampone fosfato (PB) 0,1 M pH 7.4; entrambe le soluzioni sono state
introdotte nel sistema circolatorio alla stessa pressione del sangue, ponendole ad una
opportuna altezza dal piano di perfusione.
8.2.1) Immunocitochimica per la microscopia ottica
Dopo la perfusione i GCS sono stati prelevati e crioprotetti in una soluzione di 30%
saccarosio in 9‰ NaCl per almeno 24 ore a 4°C. Successivamente i gangli sono stat inclusi in
OCT (Miles Tissue-Tek O.C.T. Coumpound 4583), tagliati al criostato (Leitz Kryostat 1720
Digital) ad una temperatura di -25°C in sezioni spesse 10 m, raccolte flottanti in TRIS/HCl
7
0.5 M a pH 7.6. Per l’immunolocalizzazione è stata utilizzato il metodo di rivelazione della
perossidasi-anti-perossidasi (PAP).
Le sezioni di ganglio sono state tenute per 5 minuti (min) in una soluzione costituita da 3% di
H2O2 e 10% di metanolo in TRIS/HCl 0.5 M pH 7.6, allo scopo di inattivare le perossidasi
endogene; lavate con tampone TRIS/HCl 0.5 M pH 7.6, in tre passaggi da 10 min ciascuno.
Quindi le sezioni sono state incubate per un’ora a temperatura ambiente in una soluzione di
bloccaggio dei siti antigenici aspecifici, contenente 5% di latte in polvere e 0.5% di Triton X100 in tampone TRIS/HCl. Successivamente i preparati sono stati incubati per 48 ore a 4°C
con l’anticorpo primario anti-MMP-2, diluito 1:2000 in TRIS/HCl 0.5 M pH 7.6 contenente
1% latte in polvere e 0.1% Triton X-100. Dopo 3 lavaggi da 10 min in tampone, si è
proceduto all’incubazione con anticorpo secondario ottenuto in capra (Sternberger
Monoclonal Inc., Baltimore, MD, USA), diretto contro la parte costante delle
immunoglobuline G di coniglio, diluito 1:300 (1 ora a temperatura ambiente); dopo altri 3
lavaggi da 10 min le sezioni sono state incubate con anticorpi di coniglio coniugati con
l’enzima perossidasi (Sternberger Monoclonal Inc., Baltimore, MD, USA), diluiti 1:1000 (1
ora a temperatura ambiente). Il diluente utilizzato per gli anticorpi secondario e terziario è lo
stesso utilizzato per il primario. Dopo un abbondante lavaggio in tampone, il legame degli
anticorpi con i relativi antigeni è stato rivelato incubando i preparati per 20 min a temperatura
ambiente con una soluzione di 0.05% 3.3’-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB) e 0.01%
H2O2 in TRIS/HCl, che ha lo scopo di rivelare i siti di legame degli anticorpi. La reazione, che
avviene ad opera della perossidasi, utilizza l’H2O2 come accettore degli elettroni che la DAB
cede ossidandosi e formando così un precipitato marrone. Le sezioni, in seguito a ripetuti
lavaggi in tampone e ad un passaggio in cresyl gel (0.1% gelatina in etanolo 40%), sono state
montate su un vetrino portaoggetto, poi chiuso permanentemente con balsamo EUKITT.
Le sezioni di ganglio sono state quindi osservate e fotografate con un microscopio Zeiss
Axiophot.
8.2.2) Immunocitochimica per la microscopia elettronica
Dopo la perfusione (vedi paragrafo precedente) due GCS di ratti normali e due di ratti operati
(5 giorni dopo assotomia), sono stati tagliati al vibratomo (Vibratome Series 1000) in sezioni
spesse 50 m, utilizzando come supporto per il taglio agar al 4% sciolto in acqua distillata
portata ad ebollizione e lasciato raffreddare a temperatura ambiente. Le sezioni sono state
raccolte flottanti in PB 0.1 M e tenute per 5 min in una soluzione costituita da 3% di H2O2 e
10% di metanolo in PB 0.1 M, allo scopo di inattivare le perossidasi endogene; sono poi stati
effettuati 3 risciacqui da 10 min ciascuno in PB 0.1 M. Per facilitare la penetrazione degli
anticorpi senza utilizzare detergenti che danneggerebbero eccessivamente le membrane, si è
utilizzato il procedimento del congelamento-scongelamento: le sezioni sono state crioprotette
con 10% dimetilsulfossido (DMSO) e 1% glicerolo in PB 0.1 M per 10 min a 4°C, seguito da
20% DMSO e 2% glicerolo sempre in PB due volte per 10 min a 4°C. Subito dopo sono state
sottoposte per 4 volte a congelamento rapido in 2-metilbutano (isopentano) raffreddato con
azoto liquido a –196°C, seguito da scongelamento. Dopo il completo scongelamento, le
sezioni sono state trattate come descritto nel paragrafo precedente (utilizzando il metodo di
rivelazione perossidasi-anti-perossidasi (PAP)), con la sola eccezione che è stato usato il PB
al posto del tampone Tris/HCl e che il Triton non è stato aggiunto ad alcun mezzo di
incubazione. Dopo la reazione con la DAB le sezioni sono state postfissate con 1% OsO 4 in
PB 0.1 M per un’ora, sciacquate accuratamente in acqua bidistillata, e dopo 5 min in alcool
etilico 50° sono state trattate per 20 min con acetato di uranile all’1% sciolto in alcool etilico
70°. Dopo un passaggio rapido in alcool 70°, si è continuata la disidratazione utilizzando una
scala a gradzione crescente di alcool etilici (10 min alcool 80°, 10 min alcool 95°, 2x10 min
alcool 100°) ed infine 2x10 min ossido di propilene. Tutti i passaggi dalla postfissazione
all’alcool 95° compresi sono stati eseguiti a 4°C, il resto a temperatura ambiente. Dopo una
notte in una miscela di 50% ossido di propilene e 50% resina Epon 812, e 4 ore in resina
8
assoluta, le sezioni sono state incluse con orientamento piano, e tenute per tre giorni in stufa a
60°C per permettere alla resina di polimerizzare; da questi preparati sono state
successivamente tagliate con un ultramicrotomo Reichert-Jung Ultracut E sezioni dello
spessore di 60-70 nm. Quest'ultime, raccolte su griglie di rame da 200 maglie, sono state
colorate con 0.2% di citrato di piombo, per aumentare il contrasto della marcatura, e osservate
ad un microscopio elettronico a trasmissione Philips 400T operante a 60 kV.
Dato che, con questo metodo di immunomarcatura pre-inclusione, si ha una limitata
penetrazione degli anticorpi e dei reagenti, le osservazioni di seguito riportate sono state fatte
alla superficie delle sezioni ottenute al vibratomo, nella zona di penetrazione degli anticorpi;
ciò permette di ridurre al minimo, anche se non di annullare totalmente, il rischio di risultati
falsamente negativi.
Sezioni di controllo, ottenute omettendo l’incubazione con l’anticorpo primario, erano sempre
immunonegative.
9) ANALISI DEI LIVELLI DI mRNA DI MMP-2, MT1-MMP e TIMP-2 IN SEGUITO A
SCHIACCIAMENTO DEI NERVI POSTGANGLIARI DEL DI RATTO
9.1) Schiacciamento dei nervi postgangliari del SCG di ratto, sacrificio animali e
prelievo SCG per l’estrazione del RNA e per l’analisi RT-PCR
Sono stati utilizzati ratti Wistar maschi (150-200 g). La procedura di schiacciamento dei nervi
postgangliari del SCG è stata eseguita come precedentemente descritto. I ratti di controllo ed
operati (a 15 minuti, 1 e 6 h, e 1, 3, 5 giorni post-operatori) sono stati anestetizzati con etere e
decapitati. I SCG sono stati prelevati in modo il più possibile sterile e conservati a –70°C fino
al momento dell’uso.
9.1.1) Trascrizione inversa e PCR semiquantitativa per lo studio dei livelli di mRNA per
MMP-2, MT-MMP e TIMP-2
Sono stati utilizzati due pools di GCS di controllo e due di gangli operati per ciascun tempo
sperimentale (2-3 gangli/pool). L’estrazione del RNA è stata ottenuta utilizzando il kit Rneasy
Micro (Qiagen, Milano, Italia) seguendo le istruzioni riportate. Per ogni reazione di
retrotrascrizione (1 ora a 37°C) sono stati utilizzati 2 g di RNA totale, in un totale di 25 l
di volume di reazione finale. La miscela di reazione contiene: 50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 75
mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 nM DTT, 1 g di esanucleotidi casuali, 0.5 mM dNTPs, 25 U di
RNAsin (inibitori delle RNasi), 400 U di M-MLV (trascrittasi inversa del virus della leucemia
murina di Moloney) (reagenti della Promega, Madison, WI, USA). Al termine della reazione
la miscela è stata portata ad un volume di 100 l con acqua bidistillata, e conservata a –20°C
fino al momento della PCR (polymerase chain reaction). Un ventesimo del cDNA ottenuto (5
l) è stato amplificato per PCR in 25 l di volume di reazione contenente: tampone per la Taq
DNA polimerasi (15 mM Tris-HCl, pH 8.0 e 50 mM KCl), 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs,
0.4 M ciascun primer (MWG Biotech, Firenze, Italia), 1 U AmpliTaq Gold DNA polimerasi
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) e 1 Ci di [ -32P] dCTP (NEN Life Science
Products, Milan, Italy). Le sequenze degli oligonucleotidi usati come primers sono riportate in
Tabella 1.
L’amplificazione prevede un primo passo di attivazione della Taq polimerasi a 95°C per 8
min, seguito da 26 cicli costituiti ciascuno da una fase di denaturazione (93°C per 30 sec), una
fase di appaiamento (55°C per 30 sec) ed una fase di allungamento (72°C per 1 min).
L’amplificazione si conclude con un allungamento finale di 5 min a 72°C. La scelta del
numero dei cicli è stata effettuata dopo aver costruito una curva di saturazione per la coppia di
primers di MMP-2, di MT1-MMP e di TIMP-2 (da esperimenti precedenti condotti nel nostro
laboratorio era noto che la coppia di primers per HPRT arriva a saturazione dopo 31 cicli): la
coppia di primers è stata utilizzata per amplificare il trascritto in esame ad un numero
crescente di cicli (23, 25, 27, 29, 31, 33) ed è stato individuato un numero di cicli che
permetteva di avere una sufficiente quantità di prodotto per poter poi effettuare l’analisi
9
quantitativa, ma senza arrivare alla saturazione. Per effettuare un valutazione quantitativa,
come nel nostro caso, è necessario infatti effettuare l’amplificazione ad un numero di cicli tali
da trovarsi nella fase esponenziale, poiché solo in questo modo le differenze esistenti tra i vari
campioni possono essere osservate.
Utilizzando in ciascuna reazione entrambe le coppie di primers, vengono amplificati
contemporaneamente i frammenti di cDNA di MMP-2 e di un gene di riferimento, HPRT
(oppure di MT1-MMP e di TIMP-2 e di HPRT). Questo è un gene espresso a bassi livelli nel
sistema nervoso ed è stato dimostrato che il suo livello di espressione nel sistema nervoso di
roditore non varia nel corso dello sviluppo e nella vita adulta in diverse condizioni
fisiologiche e patologiche (Steel e Buckley, 1993), pertanto può essere utilizzato come
standard interno nelle reazioni di PCR. I due frammenti ottenuti vengono separati per
elettroforesi su gel di agarosio all’1.5% con bromuro d’etidio. Per ciascun campione
l’amplificazione è stata ripetuta in duplicato o in triplicato.
Dopo l’elettroforesi il gel è stato lavato in una soluzione di acido tricloroacetico al 6% per 30
min, sciacquato con acqua corrente per 1 ora ed essiccato sotto vuoto a 80°C per 1 ora e 30
min; infine è stato esposto per 6-16 ore ad uno schermo sensibile alle radiazioni e le immagini
sono state acquisite tramite un fosforoimager (Typhoon, Amersham, Piscataway, NJ, USA).
Le immagini acquisite sono state analizzate con il programma ImageQuant (Amersham,
Piscataway, NJ, USA), ed il livello di espressione del gene di MMP-2, MT1-MMP e TIMP-2
è stato espresso come rapporto tra la quantità del suo amplificato e di quello di HPRT
coamplificato nella stessa provetta.
TABELLA DEI PRIMERS (5’-3’) USATI PER GLI ESPERIMENTI DI RT-PCR
GENE
PRIMER
LUNGHEZZA
MMP2
F: CCCCTAAAACAGACAAAGAGTT 286
R: GGGTCCAGGTCAGGTGTGTAAC
TIMP2
F: ATCTATGGCAACCCCATCAA
R: GGGTCCTCGATGTCAAGAAA
479
MT-1
F: CTTGTTTGCTGAGGGTTTCC
R: GTTCTCGGTGTCCATCCACT
268
La tabella mostra le sequenze dei primers forward (F) and reverse (R) con la lunghezza dei
frammenti amplificati (bp) usati per gli esperimenti di RT-PCR.
10
RISULTATI
Numero dei neuroni del GCS di topi di controllo e mdx
In sezioni semifini di GCS di topi di controllo e mdx non si osservano differenze
evidenti dell’organizzazione gangliare, della forma neuronale o dell’intensità di colorazione
cellulare con il blu di toluidina. Tuttavia, la conta del numero di neuroni eseguita su gangli
prelevati da topi adulti (6-7 settimane di età) ha mostrato che il GCS di topi mdx ha
significativamente (p<0.01) meno neuroni (36%) (333924) di quello dei topi wild-type
(520474) (Tabella 1). Considerando che a questa data, indicata in letteratura come quella in
cui si ha il picco dei cicli di degenerazione-rigenerazione muscolare (rassegna in De La Porte
et al., 1999), non si osservano neuroni gangliari in necrosi, abbiamo ipotizzato che la perdita
neuronale avvenisse in fasi precoci di sviluppo post-natale. Per verificare tale ipotesi
abbiamo, quindi, effettuato una conta del numero dei neuroni gangliari, sia in topi wild-type
sia mdx, a diverse date di vita post-natale: P5, P10, P15 e P21 (Tabella 1). Come si può notare
dai dati riportati in tabella, e come riportato anche da un’ampia letteratura a riguardo
(rassegna in Wright, 1995), tra P5 e P15 il GCS va incontro ad una riduzione significativa
(p<0.01) del numero di neuroni a seguito del noto fenomeno di morte neuronale naturale.
Questo processo interessa sia i gangli provenienti da animali di controllo che mdx, con la
differenza che in questi ultimi il calo è significativamente più alto rispetto ai wild-type
(p<0.01) sin da P10. Inoltre, nel GCS dei topi mdx la morte neuronale prosegue gradualmente
almeno fino a P15, quando la differenza nel numero di neuroni rispetto a quello dei gangli in
età adulta è ancora altamente significativa (p<0.01). Diversamente, nei gangli dei topi wildtype la morte neuronale si arresta prima; la differenza del numero di neuroni tra P15 e 6-7
settimane, infatti, non è più statisticamente significativa.
TAVOLA 1. Numero di neuroni del ganglio cervicale superiore di topi wild-type e mdx a
differenti date postnatali
wild-type
mdx
P5
7915 ± 393
8450 ± 67
P10
6583 ± 76
4676 ± 74**
P15
5977 ± 106
3984 ±
P21
6157 ± 301
3688 ± 138**
6-8 settimane
5204 ± 74
3339 ± 24**
3**
In ciascuna data il numero di neuroni è riportato come la media ± s.e.m. del numero di neuroni contato
in tre GCS. A P5, il GCS di topi wild-type e mdx ha lo stesso numero di neuroni. A P10, il numero dei
neuroni gangliari in entrambi i ceppi murini diminuisce significativamente rispetto a P5 (p<0.05, wildtype; p<0.01, mdx) e coincide con la morte neuronale fisiologica. Tuttavia, nei topi mdx, il numero dei
neuroni è significativamente minore rispetto a quello dei topi wild-type (**p<0.01) e rimane tale
durante tutto l’intervallo di tempo considerato. Le differenze sono state analizzate con il test del tStudent.
11
Immunolocalizzazione della tirosina idrossilasi e valutazione biochimica della sua
espressione negli organi bersaglio del GCS
Per determinare se la perdita di neuroni gangliari nei topi mdx possa influenzare in
qualche modo l’innervazione degli organi bersaglio periferici del GCS abbiamo effettuato
un’immunomarcatura per la T-OH allo scopo di evidenziare l’estensione e le caratteristiche
morfologiche della rete d’innervazione adrenergica, sia in bersagli muscolari (cuore e iride)
che in quelli non muscolari (ghiandola sottomandibolare), in animali wild-type e mdx. Nel
GCS, la T-OH è l’enzima limitante la biosintesi della noradrenalina (Levitt et al., 1965);
questo è specificamente localizzato nel corpo cellulare, negli assoni e nelle terminazioni
sinaptiche dei neuroni gangliari e la sua quantità all’interno degli organi bersaglio del GCS è
considerata un indice dell’attività neuronale gangliare (Black & Mytilineou, 1976).
Nei topi di 6-7 settimane, la distribuzione delle fibre nervose immunopositive per la TOH nel cuore è variabile e a regioni densamente innervate, come l’atrio e la parete
ventricolare interna, se ne alternano altre in cui le fibre immunopositive sono meno presenti.
Anche se questo rende più complessa la valutazione delle differenze nell’estensione della rete
d’innervazione tra gli animali wild-type e quelli mdx, confrontando aree appartenenti alle
stesse regioni cardiache si è osservato che, rispetto agli animali di controllo (Fig. 1A) nei topi
mdx la rete d’innervazione adrenergica è ridotta sia in estensione (Fig. 1B) sia in complessità
di arborizzazione terminale (Fig. 1B). Tuttavia, le differenze più drammatiche nel grado
d’innervazione adrenergica si osservano nell’iride, un tessuto molto più semplice da
analizzare rispetto al cuore per via della sua organizzazione più uniforme. L’innervazione
adrenergica nell’iride di topi mdx (Fig. 2B) è drasticamente ridotta rispetto a quella dei topi
wild-type (Fig. 2A) e le fibre non presentano arborizzazioni e varicosità assonali terminali.
Una situazione diversa si osserva, invece, nella ghiandola sottomandibolare, dove
l’estensione macroscopica della rete d’innervazione adrenergica nei topi wild-type (Fig. 3A) e
mdx (Fig. 3C) appare simile, con numerosi fasci di fibre immunopositive per la T-OH che
permeano l’intero territorio ghiandolare. Tuttavia, ad ingrandimento elevato, si può
chiaramente osservare che, rispetto ai topi wild-type (Fig. 3B), nelle ghiandole di topi mdx
(Fig. 3D) si ha una netta riduzione della defascicolazione, della fine arborizzazione terminale
e della formazione di varicosità degli assoni adrenergici.
Sulla base delle alterazioni della rete d’innervarzione adrenergica nei topi mdx,
seppure con delle differenze tra quelle riscontrate nel cuore e nell’iride e quelle osservate
nella ghiandola sottomandibolare, il passo successivo è stato quello di valutare se tali
alterazioni comparissero in seguito alla morte neuronale o se erano precedenti ad essa.
Abbiamo, quindi, effettuato un’immunomarcatura per la T-OH nel cuore, nell’iride e nella
ghiandola sottomandibolare di topi wild-type e mdx a P5, quando il numero di neuroni
gangliari è ancora uguale, e a P10, quando il numero dei neuroni nel GCS dei topi mdx è già
significativamente inferiore a quello dei topiwild-type. A queste date, comunque,
l’innervazione adrenergica periferica proveniente dal GCS è in via di maturazione, in quanto
ad una precoce sovra-innervazione fa seguito una riduzione della stessa, in accordo con
l’avvenuta morte neuronale fisiologica (rassegna in Wright, 1995). I risultati ottenuti nei topi
wild-type confermano la presenza di una rete d’innervazione adrenergica ben sviluppata sia
nel cuore (Fig. 1C, wild-type; Fig. 1D, mdx), sia nell’iride (Fig. 2C, wild-type; Fig. 2D, mdx)
e sia nella ghiandola sottomandibolare (Fig. 3E, wild-type; Fig. 3F, mdx) a partire già da P5,
con assoni che progressivamente defascicolano e ramificano correttamente (Fig. 1C, 2C e 3E).
Le stesse caratteristiche vengono mantenute a P10 (Fig. 1E, cuore; Fig. 2E, iride; Fig. 3G,
ghiandola) dove, soprattutto nella ghiandola, è chiaro l’aumento del grado di fine
arborizzazione terminale degli assoni (Fig. 3G). Nei topi mdx, al contrario, sin da P5 si
possono osservare le alterazioni descritte nell’adulto. Rispetto ai topi di controllo della stessa
età, la quantità ed il grado di arborizzazione terminale delle fibre T-OH positive nel cuore
(Fig. 1C, wild-type e 1D, mdx a P5; Fig. 1E, wild-type e 1F, mdx a P10) e nell’iride (Fig. 2C,
wild-type e 2D, mdx a P5; Fig. 2E, wild-type e 2F, mdx a P10) sono chiaramente ridotte. Nella
12
ghiandola sottomandibolare, inoltre, anche se l’estensione della rete d’innervazione non
appare ridotta, sono comunque chiari i difetti di arborizzazone terminale, con la tendenza
degli assoni a rimanere associati in fasci sia a P5 (Fig. 3E, wild-type; 3F, mdx) che a P10 (Fig.
3G, wild-type; 3H, mdx).
Le differenze morfologiche osservate nella rete di innervazione adrenergica tra gli
organi bersaglio del GCS di topi di controllo e mdx trovano conferma nei livelli di T-OH
determinati mediante Western immunoblot. Come mostrato in Fig. 3I, l’anticorpo per la TOH riconosce una singola banda di 60 kDa nel cuore, nell’iride e nella ghiandola
sottomandibolare, la cui intensità è più elevata negli estratti tissutali dei topi wild-type rispetto
ai rispettivi preparati ottenuti dai topi mdx. Questi risultati non solo dimostrano una drastica
riduzione dell’estensione della rete di innervazione adrenergica nei preparati muscolari, ma
indicano anche che la riduzione della ramificazione e defascicolazione assonale osservata
nella ghiandola sottomandibolare determina una riduzione del contenuto di T-OH.
Marcatura retrograda dei neuroni gangliari mediante iniezione di WGA-HRP nella
ghiandola sottomandibolare e nella camera anteriore dell’occhio
Diversamente dalla ghiandola sottomandibolare, nel cuore e l’iride di topi mdx la scarsa
defascicolazione e ramificazione assonale terminale sono associate ad una drastica riduzione
dell’estensione della rete di innervazione adrenergica. Ciò suggerisce che la perdita neuronale
precedentemente osservata possa essere selettiva per i neuroni che innervano organi bersaglio
di tipo muscolare. Per verificare questa ipotesi abbiamo marcato retrogradamente i neuroni
gangliari mediante l’iniezione di WGA-HRP nella ghiandola sottomandibolare (uno dei
bersagli non muscolari del GCS) e nella camera anteriore dell’occhio, in prossimità dell’iride
(uno dei bersagli muscolari del GCS).
In seguito all’iniezione unilaterale del tracciante nella ghiandola sottomandibolare non
si osservano differenze significative nel numero di neuroni marcati nel GCS di topi di
controllo (53711) e mdx (55547) né nell’intensità del tipico prodotto di reazione marrone e
granulare che colora sia il citoplasma (Fig. 4A, B, wild-type; Fig. 4C, D, mdx) che gli assoni
emergenti (Fig. 4B, wild-type; Fig. 4D, mdx). I neuroni marcati sono distribuiti in tutto il
ganglio senza particolare compartimentalizzazione (Fig. 4A, wild-type; Fig. 4C, mdx) e per lo
più associati in piccoli gruppi (Fig. 4 A, B, wild-type; Fig. 4C, D, mdx). Il numero dei neuroni
gangliari retrogradamente marcati in seguito all’iniezione di tracciante nella camera anteriore
dell’occhio di topi wild-type (54.5+1) è, invece, significativamente maggiore (p=0.01) di
quello dei topi mdx (322). Anche in questo caso i neuroni non mostrano una distribuzione
compartimentalizzata (Fig. 4E, wild-type; Fig. 4F, mdx).
Presenza e distribuzione di Dp427 negli organi bersaglio del GCS e valutazione
biochimica della sua espressione
I risultati finora ottenuti indicano che nei topi mdx si verifica una perdita selettiva di
neuroni gangliari che innervano organi bersaglio di tipo muscolare, sebbene siano state
evidenziate alterazioni neuronali intrinseche indipendenti dal tipo di bersaglio periferico
innervato. Questa perdita potrebbe essere dovuta ai danni strutturali e/o funzionali degli
organi bersaglio muscolari causati dall’assenza di distrofina. Per verificare questa ipotesi
abbiamo investigato l’espressione di Dp427 negli organi bersaglio del GCS di topi wild-type
e mdx: il cuore, utilizzato come controllo positivo dal momento che questo aspetto è già stato
ampiamente studiato (Byers et al., 1991; Peri et al., 1994; Meng et al., 1996; Rivier et al.,
1999a, b), l’iride e la ghiandola sottomandibolare, nelle quali la presenza di distrofina non è
mai stata determinata. In Western immunoblot, l’anticorpo monoclonale Dys1 riconosce una
banda a circa 427kDa, corrispondente alla distrofina ad alto peso molecolare, in tutti gli
estratti tissutali dei topi wild-type esaminati (Fig. 5A). Nell’iride e, meno chiaramente, nella
ghiandola sottomandibolare è presente anche una banda a più basso peso molecolare,
13
probabilmente corrispondente alla forma di 405kDa descritta per le cellule muscolari lisce
(Hoffman et al., 1988; Feener et al., 1989). Nei corrispondenti estratti tissutali dei topi mdx
non si osserva alcuna banda positiva (Fig. 5A). La distribuzione della Dp427 negli stessi
organi è stata successivamente studiata al microscopio ottico utilizzando un anticorpo
policlonale che riconosce specificamente la Dp427. Inoltre, nell’iride e nella ghiandola
sotttomandibolare è stata effettuata una colocalizzazione della Dp427 con l’actina del
muscolo liscio per verificare se la distrofina fosse espressa nelle celule muscolari lisce
dell’iride o in quelle muscolari-simili della ghiandola sottomandibolare (miociti). Come
atteso, la Dp427 è chiaramente localizzata intorno ai cardiomiociti nelle sezioni di cuore di
topi wil-type (Fig. 5B), ma non in quelli dei topi mdx (Fig. 5I), confermando la specificità
dell’immunoreattività. Immunopositività per la distrofina è stata inoltre osservata nell’iride
(Fig.5C) e nella ghiandola sottomandibolare (Fig. 5F) di topi wild-type, ma mai nei preparati
corrispondenti da topi mdx (Fig.5L, iride; 5M, ghiandola sottomandibolare). Nell’iride,
l’immunoreattività per la distrofina è presente in diversi tipi cellulari cellule e spesso
colocalizza con l’actina del muscolo liscio (Fig. 5C-E), indicandone la presenza anche nelle
cellule muscolari lisce. Nella ghiandola sottomandibolare sono presenti numerose cellule
immunopositive di forma diverse, distribuite profusamente all’interno del tessuto ghiandolare
(Fig. 5F). Alcune di queste sono di tipo muscolare, come ad esempio le cellule della
muscolatura liscia vascolare e i miociti che circondano i dotti secretori, come indicato dalla
colocalizzazione con l’actina del muscolo liscio (Fig.5F-H ed inserti). L’immunoreattività per
la Dp427 è inoltre presente all’interno degli acini secretori, localizzata specificamente verso il
lato luminale della membrana plasmatica (inserti di Fig. 5F e H), dove sono aggregate le
vescicole secretorie.
Analisi ultrastrutturale degli organi bersaglio del GCS
Per verifivare se la mancanza di Dp427 nei topi mdx induce possibili alterazioni
morfologiche negli organi bersaglio del GCS, abbiamo effettuato un’analisi ultrastrutturale al
microscopio elettronico del cuore e dell’iride di topi wild-type e mdx a P10 e a 6-7 settimane
di età. La data di P10 è stata scelta in quanto in questo periodo nei topi mdx è già avvenuta la
maggior parte della perdita dei neuroni gangliari, ma non sono ancora iniziati i cicli di
degenerazione-rigenerazione muscolare (De La Porte et al., 1999). Come si può osservare in
Figura 6B e F, a P10 l’organizzazione delle miofibrille contrattili nelle cellule cardiache è
identica tra gli animali wild-type (Fig. 6B) e quelli mdx (Fig. 6F). In entrambi i casi, i
cardiomiociti presentano aspetti di relativa immaturità, con le miofibrille organizzate in
piccoli fasci, ma ancora separate tra loro nel citoplasma, per la maggior parte in uno stato di
ipercontrazione riconoscibile dall’assenza della banda I dei sarcomeri. Anche a carico delle
cellule muscolari lisce dell’iride non si osserva nessuna differenza tra topi wild-type (Fig. 6A)
e mdx (Fig. 6E). In queste i filamenti contrattili non sono organizzati in sarcomeri, ma sono
distribuiti nel citoplasma in aggregati di diverse dimensioni, secondo un orientamento comune
e collegati da punti di “stress” visibili come piccole aree elettrondense.
Negli animali adulti, non sono evidenti alterazioni ultrastrutturali delle cellule
muscolari lisce dell’iride (non mostrato). Tuttavia, diversamente dal cuore dei topi wild-type,
(Fig.6C ed ingrandimento in D), quello dei topi mdx presenta numerose fibre muscolari, o
porzioni di esse, con diversi gradi di alterazione quali la scomparsa di una stria Z ben
riconoscibile (Fig. 6G), l’impoverimento del contenuto di miofibrille (Fig. 6H) e la perdita, in
alcune regini, degli elementi contrattili (Fig. 6I). I mitocondri sono spesso visibilmente
alterati e sono presenti ampi spazi contenenti detriti cellulari fagocitati (non mostrato).
Diversamente, le cellule muscolari lisce dell’iride, così come le cellule della ghiandola
sottomandibolare, non presentano evidenti alterazioni ultrastrutturali. (non mostrato).
Marcatura con Evans Blue degli organi bersaglio muscolari del GCS di topi mdx
14
La mancanza di Dp427 può influenzare i neuroni del GCS in diversi modi: a)
determinando alterazioni neuronali intrinseche che potrebbero portare ad un impoverimento
dell’arborizzazione assonale terminale in tutti tessuti bersaglio periferici esaminati (come
indicato dall’immunolocalizzazione della T-OH) e b) causando una riduzione selettiva del
numero dei neuroni del GCS che innervano bersagli muscolari, probabilmente come
conseguenza del danno indotto nelle fibre muscolari dalla mancanza di Dp427. Del resto,
come descritto precedentemente, le nostre osservazioni al microscopio elettronico del cuore e
dell’iride di topi mdx a P10, data in cui la perdita neuronale è già in corso, non hanno rivelato
alterazioni ultrastrutturali dovuta alla mancaza di distrofina sia nei cardiomiociti che nelle
cellule muscolari lisce dell’iride. Abbiamo quindi verificato se in queste cellule fossero
presenti alterazioni della membrana plasmatica, segno precoce della patologia distrofica nelle
cellule muscolari (Mokri and Engel, 1975), che, se pur non facilmente evidenziabili a livello
ultrastrutturale, sono comunque in grado di indurre alterazioni funzionali. E’ stata quindi
effettuata un’iniezione intraperitoneale del colorante vitale EBD in topi di controllo e mdx a
P10 e a 6-7 settimane di vita post-natale. L’EBD è un colorante che permea selettivamente le
membrana plasmatiche danneggiate ed è spesso utilizzato come tracciante in vivo per ottenere
informazioni sulle caratteristiche dinamiche e strutturali del tessuto muscolare normale e
patologico (Grady et al., 1997; Straub et al., 1997; Danialou et al., 2001; Matsuda et al.,
1995). In sezioni di cuore di topi mdx si osservano numerose fibre muscolari marcate con
EBD nella parete ventricolare del cuore (Fig. 7A), spesso organizzate in gruppi. Numerosi
cardiomiociti EBD-positivi sono visibili anche a P10 (Fig. 7B), quando non sono state
osservate alterazioni ultrastrutturali. Anche nell’iride di topi mdx sia adulti (Fig. 7C) che a
P10 (Fig. 7D) si osservano diverse cellule marcate, molto probabilmente corrispondenti alle
cellule muscolari lisce. Sezioni di muscolo scheletrico, utilizzati come controllo positivo e
provenienti dagli stessi topi mdx adulti (Fig. 7E) e a P10 (Fig. 7F) da cui sono stati
dissezionati il cuore e l’iride, contengono diverse fibre EBD-positive. Non sono presenti fibre
marcate nel cuore (Fig. 7G), nell’iride e nei muscoli scheletrici (non mostrato) dei topi wildtype della stessa età, né si osservano cellule marcate nelle ghiandole sottomandibolari di topi
wild-type (Fig. 7H) e mdx (Fig. 7I).
Carattezizzazione delle gelatinasi espresse nel GCS di ratti di controllo ed in seguito a
danno assonale
Tra le proteasi extracellulari in grado di degradare la gelatina, la MMP-2 e la MMP- 9
sono quelle maggiormente espresse a livello del sistema nervoso, sia in condizioni
fiosiologiche che patologiche. Allo scopo di determinare se esse possano essere coinvolte nel
rimodelllamento sinaptico indotto da assotomia dei neuroni del sistema nervoso autonomo
abbiamo inizialmente saggiato la loro presenza nel GCS di ratto utilizzando la zimografia in
gel. Come mostrato in Fig. 8A, nella zimografia di estratti di GCS di controllo e di GCS
prelevati a tempi diversi dopo schiacciamento delle fibre postgangliari (15, 30 e 60 minuti ed
1, 3 e 5 giorni) sono visibili due bande gelatinoliche, una a 72 kDa e una a 62 kDa. In base al
loro peso molecolare e alla loro co-migrazione con il pro-enzima e la foma attiva della MMP2 umana ricombinante, queste due bande rappresentano rispettivamente la pro-MMP-2 (72
kDa) e la sua forma attiva MMP-2 (62 kDa). In seguito allo schiacciamento dei nervi
postgangliari, l’attività della MMP-2 aumenta progressivamente a partire da 30 minuti dopo
danno assonale, raggiungendo un plateau tra 1 e 5 giorni post-assotomia, quando il distacco
dei terminali presinaptici dal soma dei neuroni assotomizzati è ormai completo (Del Signore
et al., 2004). Zimografie di controllo incubate con EDTA (non mostrato) sono state utilizzate
come controllo negativo e non mostrano alcuna attività gelatinolitica.
Ad ulteriore conferma che l’attività gelatinolitica presente a 72 kDa ed a 62 kDa ed il
loro aumento in seguito ad assotomia fossero dovuti alla MMP-2, abbiamo eseguito un’analisi
di Western immunoblot su estratti di GCS, prendendo in considerazione le stesse date
postoperatorie analizzate con la zimografia in gel ed utilizzando un anticorpo diretto contro la
15
MMP-2 che riconosce sia la forma enzimatica inattiva che quella attiva (Fig. 8B). Nei gangli
di controllo si evidenziano due bande, una a 72 kDa e una, molto meno intensa, a 62 kDa. Nei
gangli operati, oltre a queste due bande, ne è visibile una terza a 64 kDa, che corrisponde alla
forma intermedia di MMP-2 proteoliticamente attiva. Questa banda è visibile a partire da 30
minuti dopo assotomia e la sua intensità aumenta progressivamente nelle successive date
postoperatorie (Fig. 8B). Nell’intervallo di tempo compreso tra 1 e 5 giorni post-operatori
aumenta anche l’intensità delle bande corrispondenti alla pro-MMP-2 (72kDa) e alla MMP-2
attiva (62kDa) (Fig. 8B). Questi risultati suggeriscono che l’assotomia dei neuroni del GCS
determina un’aumento progressivo della pro-MMP-2 e delle sue due forme attive e che tale
aumento è massimo durante la fase di distacco dei bottoni presinaptici dal soma dei neuroni
assotomizzati.
Localizzazione cellulare e subcellulare della MMP-2
Per localizzare l’attività della MMP-2 ne abbiamo determinato l’attività gelatinolitica
in gangli di controllo ed in gangli prelevati 5 giorni dopo assotomia utilizzando la zimografia
in situ. Le sezioni di ganglio sono state ricoperte con un mezzo di incubazione contenente
gelatina fluoresceinata schermata: quando la gelatina viene degradata il fluorocromo viene
esposto ed emetterà un segnale fluorescente una volta eccitato che potrà essere visualizzato
utilizzando i filtri per la fluoresceina. Nei gangli di controllo si osserva solo una debole
attività gelatinolitica, per lo più associata ai capillari sanguigni (Fig. 9 A,B). Cinque giorni
dopo assotomia si osserva un aumento generalizzato del segnale fluorescente ed alcuni
neuroni gangliari mostrano una marcatura perineuronale (Fig. 9 C,D). Sezioni di controllo coincubate con EDTA sono prive di segnale fluorescente (non mostrato).
Per confermare che il segnale fluorescente osservato nei gangli mediante zimografia in
situ fosse dovuto all’attività gelatinolitica della MMP-2 e per determinarne la distribuzione
cellulare e subcellulare in gangli di controllo ed in gangli prelevati 5 giorni dopo assotomia,
abbiamo eseguito un’analisi immunocitochimica al microscopio ottico ed elettronico. Al
microscopio ottico, i gangli di controllo mostrano una debole immunoreattività per la MMP-2,
che marca in modo discontinuo il contorno di piccoli vasi sanguigni ed isolate porzioni della
matrice extracellulare (Fig. 10 A, B). Cinque giorni dopo assotomia, l’intensità della
marcatura extracellulare aumenta e diversi neuroni sono parzialmente o completamente
circondati da un’intensa immunoreattività per laMMP-2 (Fig. 10 C,D).
L’immunomarcatura al microscopio elettronico mostra che nei gangli di controllo,
oltre ad una sporadica marcatura extracellulare, è presente una debole immunoreattività per la
MMP-2 nei neuroni gangliari, maggiormente associata al contorno di vescicole che derivano
da cisterne del reticolo endoplasmatico rugoso e dell’apparato del Golgi (Fig. 11A e B). Nei
gangli operati, tuttavia, non solo si osservano più di frequente vescicole immunopositive,
spesso nell’atto di fondersi con la membrana plasmatica neuronale (Fig. 11D), ma sono anche
visibili intensi aggregati di immunoreattività all’interno dei dendriti e di piccole spine
dendritiche (Fig. 11C), spesso in corrispondenza di bottoni presinaptici (Fig.11C) o di
processi di cellule satelliti perineuronali che si interpongono tra gli elementi pre- e post
sinaptici (Fig. 11C e E).
Espressione di MT1-MMP e TIMP-2 in seguito ad assotomia dei neuroni del GCS
Per identificare il meccanismo enzimatico coinvolto nell’attivazione della MMP-2
abbiamo studiato l’espressione della MT1-MMP e di TIMP-2, due dei maggiori candidati
coinvolti nella modulazione dell’attività di MMP-2. L’analisi mediante Western immunoblot
dell’espressione di MT1-MMP e di TIMP-2 è stata eseguita in gangli di controllo e in gangli
prelevati a diverse date postoperatorie: 15, 30 e 60 minuti e 1, 3 e 5 giorni. Un’intensa banda
di circa 60 kDa, corrispondente alla MT1-MMP inattiva, è presente nei gangli di controllo
(Fig. 12 A). Dopo lesione assonale, i livelli di MT1-MMP aumentano nell’intervallo di tempo
16
compreso tra 30 minuti ed 1 giorno post-assotomia, per poi tornare a valori di controllo a
partire da 5 giorni (Fig. 12 A). Inoltre, 30 minuti dopo schiacciamento delle fibre
postgangliari compare una seconda banda immunopositiva di circa 57 kDa, che rappresenta la
forma attiva della MT1-MMP (Hernandez-Barrantes et al., 2000).
Le variazioni di espressione dell’altro componente essenziale tanto per l’attivazione
quanto per l’inibizione della MMP-2, il TIMP-2, sono state studiate mediante Western
immunoblot effettuato con gli stessi omogenati di gangli di controllo ed operati utilizzati per
l’analisi della MT1-MMP. In gangli di controllo si intravede una flebile e sottile banda di
circa 24 kDa, corrispondente al TIMP-2 (Fig. 12 B). In seguito allo schiacciamento dei nervi
postgangliari, l’espressione di TIMP-2 aumenta. Tale aumento è già evidente a 30 minuti
dall’assotomia e raggiunge un picco a 1 giorno (Fig. 12 B). E’ interessante sottolineare che
questo aumento dell’epressione per la MT1-MMP ed il TIMP-2 correla perfettamente con
quello, dimostrato precedentemente mediante immunoblot della MMP-2. Questo suggerisce
che anche in questo modello sperimentale, come in altri, la MT1-MMP ed il TIMP-2 sono
coinvolti nella modulazione dell’attività di MMP-2.
Modulazione dei livelli di mRNA della MMP-2, della MT1-MMP e del TIMP-2 in
seguito ad assotomia dei neuroni del GCS
La variazione dei livelli di mRNA della MMP-2, della MT1-MMP e del TIMP-2 sono
stati studiati mediante RT-PCR multiplex a differenti date postoperatorie: 15 e 60 minuti, 6
ore, e 1, 3 e 5 giorni. In accordo con il numero di cicli e con la lunghezza del frammento
amplificato, le coppie di primer per la MMP-2, o per il TIMP-2 e la MT1-MMP sono state
utilizzate in co-amplificazione nello stesso tubo di reazione con le coppie di primer per
l’HPRT. Come mostrato in Fig. 13, lo schiacciamento dei nervi postgangliari non influisce sul
livello di mRNA codificante per la MMP-2. Diversamente, i livelli di mRNA della MT1MMP e del TIMP-2 variano significativamente: quello per la MT1-MMP mostra un aumento
significativo a partire da 6 ore dopo assotomia, raggiungendo un picco ad un giorno. Anche i
livelli di mRNA per il TIMP-2 aumentano gradualmente, raggiungendo un picco ad un giorno
dopo assotomia per tornare successivamente a livelli di controllo. Questi risultati suggericono
che sia la MT1-MMP che il TIMP-2 sono finemente regolati a livello trascrizionale, mentre la
MMP-2 potrebbe essere controllata attraverso un meccanismo unico di attivazione enzimatica
e passando diversi possibili stadi di stabilizzazione post-trascrizionale (Sternlicht and Werb,
2001).
Variazioni dell’espressione del -distroglicano in seguito ad assotomia dei neuroni del
GCS
Studi precedenti, condotti nel nostro laboratorio, hanno dimostrato che il distacco dei
bottoni presinaptici indotto dall’assotomia dei neuroni del GCS è preceduto dalla rimozione
e/o dalla modificazione di proteine delle specializzazioni postsinaptiche coinvolte nella
stabilizzazione strutturale e funzionale delle sinapsi intragangliari, quali il -distroglicano, la
distrofina e la subunità 3 del nAChR (Zaccaria et al., 1998; Del Signore et al., 2004). Inoltre,
studi recenti hanno dimostrato che le MMPs sono in grado di degradare il -distroglicano
tramite l’escissione proteolitica del suo dominio extracellulare e la produzione di un
frammento di 30 kDa, corrispondente alla sua porzione transmembrana e citoplasmatica
(Yamada et al., 2001; Kaczmarek et al., 2002). Per determinare se anche in seguito
all’assotomia dei neuroni del GCS si verificasse un aumentata produzione del frammento di
30 kDa del -distroglicano, abbiamo condotto un’analisi di Western immunoblot su estratti di
gangli di controllo e prelevati a diverse date postoperatorie (15, 30 e 60 minuti ed a 1, 3 e 5
giorni) utilizzando un’anticorpo monoclonale diretto contro la porzione transmembrana e
citoplasmatica del -distroglicano e quindi in grado di riconoscere sia il -distroglicano
intatto di 43 kDa che il suo frammento di 30 kDa. Come mostrato in Fig. 14, i gangli di
controllo esprimono costitutivamente sia il -distroglicano di 43 kDa che il suo frammento di
17
30 kDa. A partire da 15 minuti dal danno assonale si osserva un aumento dell’espressione del
-distroglicano di 43 kDa che raggiunge un plateau a 30 minuti. Diversamente, un aumento
progressivo dell’espressione del frammento di 30 kDa si osserva solo a partire da 1 giorno
dopo danno assonale, parallelamente all’aumento di espressione ed attività della MMP-2.
18
DISCUSSIONE
In questa tesi è stata studiata la risposta dei neuroni del GCS di roditori a due tipi
diversi di alterazione: quella di tipo patologico/genetico, quali l’assenza della Dp427 in un
modello animale della distrofia muscolare di Duchenne (i topi mdx) e quella indotta
sperimentalmente mediante assotomia dei neuroni gangliari. Questo ci ha permesso di
individuare alcuni dei fattori e degli eventi molecolari coinvolti nel rimodellamento dei
circuiti neuronali e delle sinapsi in vivo del GCS di roditori.
Nei topi mdx, abbiamo studiato gli effetti indotti dalla mancanza di Dp427 sulla
sopravvivenza dei neuroni del GCS, sull’innervazione dei loro diversi organi bersaglio e sulla
comparsa di alterazioni in alcuni di questi.
Nel GCS di ratto abbiamo, invece, effettuato studi di tipo biochimico, ultrastrutturale e
molecolare al fine di caratterizzare l’espressione di MMPs in condizioni di controllo e dopo
perturbazione dei circuiti neuronali indotta sperimentalmente (assotomia). Abbiamo inoltre
preso in esame l’effetto dell’interruzione di tali circuiti sui livelli di espressione del
distroglicano, proteina coinvolta nella stabilizzazione dei contatti sinaptici intragangliari e
possibile bersaglio dell’attività delle MMPs, durante il rimodellamento sinaptico indotto da
assotomia. Nelle sezioni seguenti saranno discussi i risultati ottenuti suddividi in base ai due
modelli sperimentali adottati.
IL RUOLO DELLA DISTROFINA NELLA SOPRAVVIVENZA DEI NEURONI DEL
GCS
La mutazione nel gene della distrofina, che determina l’assenza della Dp427 sia nei
pazienti affetti da DMD che nei topi mdx, colpisce maggiormente i muscoli scheletri, cardiaco
e diaframmatico, inducendo necrosi cellulare progressiva ed perdita di funzione muscolare
(De La Porte et al., 1999; Blake et al., 2002; Boland et al., 1995). Tuttavia, diverse anomalie
morfologiche e/o funzionali neuronali sono state descritte anche in alcune aree del sistema
nervoso centrale (Mehler, 2000; Anderson et al., 2002; Sbriccoli et al., 1995; Emery, 1988;
Lenk et al., 1996) ed autonomo (De Stefano et al., 1997; Zaccaria et al., 2000; Mancinelli et
al., 1995; Mulé et al., 1999). In questa tesi abbiamo dimostrato che: 1) durante la morte
neuronale fisiologica che avviene nel GCS nelle prime date post-natali, nei topi mdx muore un
numero maggiore di neuroni gangliari rispetto a quelli wild-type. Tale perdita è selettiva per
quei neuroni che innervano organi bersaglio muscolari del GCS; 2) la mancanza di Dp427
causa difetti strutturali in tutti i neuroni del GCS di topi mdx, quali alterazione della crescita
assonale e dell’arborizzazione terminale in tutti gli organi bersaglio del GCS esaminati, già a
P5; 3) la marcatura con EBD rivela che esistono micro-rotture nella membrana plasmatica
delle cellule muscolari del cuore e dell’iride di topi mdx a partire da P10, quando i danni
ultrastrutturali sono ancora visibili. Questi risultati indicano che la mancanza di Dp427 causa
delle alterazioni intrinseche nei neuroni del GCS che, associate ai danni causati dalla
mancanza di Dp427 negli organi bersaglio di tipo muscolare, portano alla perdita selettiva del
36% dei neuroni gangliari.
Nei topi mdx la mancanza di Dp427 provoca la morte selettiva dei neuroni gangliari che
innervano bersagli di tipo muscolare e difetti della crescita e dell’arborizzazione
terminale degli assoni sopravvissuti
I risultati presentati in questa tesi dimostrano che il numero di neuroni del GCS di topi
mdx adulti è inferiore del 36% rispetto a quello degli animali wild-type. A questo stadio,
l’assenza di neuroni in degenerazione indica chiaramente che la perdita neuronale si verifica
prima delle 6-7 settimane di vita postnatale esaminate, periodo in cui si verifica una marcata
degenerazione dei muscoli scheletrici necrotici (De La Porte et al., 1999; Blake et al., 2002;
Dangain & Vrbova, 1984). A P5 i GCS di topi wild-type e mdx hanno lo stesso numero di
neuroni, dimostrando che, nei topi mdx, viene generato il numero corretto di neuroni simpatici
19
e che tutti migrano nella posizione appropriata per formare il ganglio. Questo esclude un
coinvolgimento della distrofina in questi eventi del differenziamento neuronale, a differenza
di quanto descritto per neuroni del SNC per i quali è stata ddescritta una migrazione aberrante
dei neuroblasti (Jagadha and Becker, 1988; Mehler & Kessler, 1998; Hatten et al., 1999).
Tuttavia, i neuroni del GCS di topi mdx presentano diverse alterazioni intrinseche, tra le quali
una diminuzione della defascicolazione e dell’arborizzazione terminale degli assoni nei
diversi organi bersaglio esaminati già a partire da P5, quando il numero dei neuroni del GCS
non è ancora ridotto. I cambiamenti dell’architettura degli assoni terminali potrebbero essere
conseguenza delle alterazioni nel legame dinamico tra il citoscheletro corticale e la MEC
dovute alla mancanza di Dp427. Una defascicolazione aberrante degli assoni terminali
ippocampali è stata, ad esempio, osservata in topi mancanti del recettore tirosin chinasico per
l’efrina di tipo B (Chen et al., 2004), implicata nella guida degli assoni e nella corretta
topografia dell’innervazione degli organi bersaglio mediante la corretta interazione tra assoni
ed ambiente extracellulare. E’ noto che la Dp 427 media questo legame attraverso il
complesso della distrofina e delle glicoproteine ad essa associate (Michele and Campbell,
2003) e che la sua mancanza porta ad una riduzione dell’espressione dei componenti del
complesso stesso nella membrana plasmatica (Igraghimov-Beskrovnaya et al., 1992). In nostri
studi precedenti abbiamo dimostrato che, nel GCS di topi mdx la percentuale di sinapsi
immunopositive per la Dp427 ed il distroglicano (Zaccaria et al., 2000), una proteina
associata alla distrofina che lega la MEC (Henry and Campbell,1999), è infatti drasticamente
ridotta. Comunque, non possiamo escludere che alterazioni della trasmissione rapida
intragangliare conseguente alla riduzione, nei topi mdx, del numero di sinapsi intragangliari
contenenti 3nAChR (Del Signore et al., 2002) possa giocare un ruolo. Infatti, come
recentemente dimostrato da Hanson e Landmesser (2004) il blocco a stadi di sviluppo precoci
dell’attività ritmica spontanea generata dalla trasmissione colinergica in motoneuroni di topo
e di pollo (Hanson and Landmesser, 2003) dà luogo ad errori di de-fascicolazione e
migrazione assonale, molto probabilmente mediante la de-regolazione di molecole quali
l’efrina A4 e la NCAM polisialilata, importanti per questi aspetti della crescita assonale.
Nel GCS di topi mdx la perdita neuronale è selettiva per i neuroni che innervano
organi bersaglio muscolari
Nei topi mdx, l’immunoreattività per la T-OH ha rivelato alterazioni dell’architettura
dell’innervazione simpatica sia negli organi bersaglio muscolari che non muscolari del GCS.
Tuttavia, conseguentemente alla perdita selettiva dei neuroni del GCS che proiettano ai
bersagli muscolari, dimostrata con la marcatura retrograda mediante WGA-HRP, l’estensione
dell’innervazione adrenergica all’interno di questi ultimi risulta drammaticamente ridotta. Il
segnale promotore della morte neuronale potrebbe derivare dai danni strutturali e/o funzionali
indotti negli organi bersaglio del GCS dalla mancanza di Dp427. Infatti, la marcatura con
EBD ha rivelato la presenza di danni alla membrana plasmatica dei cardiomiciti e delle cellule
muscolari lisce dell’iride già a P10, quando avviene la maggior parte della morte dei neuroni
gangliari nei topi mdx, pur in assenza di evidenti alterazioni ultrastrutturali.
Sia nelle cellule muscolari scheletriche (Petrof et al., 1993) che cardiache (Danialou et al.,
2001) il complesso proteico formato dalla Dp427 con il complesso glicoproteico (Rivier et al.,
1999 a,b; Cullen et al., 1998; Stevenson et al., 1998) fornisce integrità strutturale alla
membrana plasmatica e protegge i muscoli dallo stress meccanico che si genera durante la
contrazione. È stato ipotizzato che uno degli eventi iniziali nella necrosi muscolare in pazienti
di DMD e nei topi mdx è la distruzione focale della membrana plasmatica muscolare associata
a stress meccanico (Blake et al., 2002). Evidenze sperimentali suggeriscono che la mancanza
di Dp427 determina un aumento della permeabilità di membrana a macromolecole si in
entrata che in uscita da cellule muscolari danneggiate (Blake et al., 2002; Rosalki, 1989;
D’Amore et al., 1994; Kaye et al., 1996), influendo sulla funzione muscolare, sulle proprietà
contrattili e sulla sopravvivenza cellulare (Sapp et al., 1996; Blake et al., 2002; Iwata et al.,
20
2003). Possibili alterazioni funzionali nei cardiomiociti e nelle cellule muscolari lisce
dell’iride di topi mdx, anche se non distinguibili morfologicamente, potrebbero indurre la
rimozione delle sinapsi e la retrazione delle fibre simpatiche, come mostrato dalla riduzione
dell’estenzione dell’innervazione adrenergica osservata già a P5. Indeboliti dal fenotipo
distrofico, i neuroni del GCS potrebbero non essere più capaci di dirigere nuovamente i loro
assoni verso fibre muscolari non danneggiate e morirebbero. Questa ipotesi è avvalorata dal
fatto che la scarsa innervazione adrenergica del cuore e dell’iride rimane tale anche in topi
mdx di 10 mesi di età, quando i cicli di degenerazione muscolare sono ormai cessati. La morte
neuronale nel GCS di topi mdx potrebbe essere, inoltre, dovuta ad un ridotto
approvvigionamento di fattori trofici (Bennet et al., 2002; Wright, 1995; El Shamy et al.,
1996; Huang & Reichardt, 2001), come ad esempio NGF e NT-3. Questo potrebbe derivare da
una ridotta sintesi di fattori trofici da parte delle cellule muscolari dell’iride e del cuore,
danneggiate dalla mancanza di Dp427. Comunque, la mancanza o la riduzione di fattori trofici
nei tessuti bersaglio potrebbe influire non solo sulla sopravvivenza neuronale, ma anche sulla
densità dell’innervazione e dell’arborizzazione assonale collaterale (Purves,1988; Gloster &
Diamond, 1992; Saffran & Crutcher, 1990).
Sebbene non abbiamo evidenziato alcuna alterazione ultrastrutturale nei cardiomiociti
e nelle cellule muscolari lisce dell’iride di topi mdx a P10, la marcatura con EBD ha rivelato
rotture nella loro membrana plasmatica quale primo segno della patologia. Inoltre, abbiamo
osservato numerose cellule muscolari cardiache in diversi stadi di degenerazione in topi mdx
di 6-7 settimane di vita, come del resto riportato da altri autori (Grady et al., 1997; Megeney
et al., 1999; Straub et al., 1997; Danialou et al., 2001). Tuttavia, a questa stessa età, non
abbiamo trovato alcuna alterazione ultrastrutturale nelle cellule muscolari lisce dell’iride,
malgrado la loro membrana plasmatica sia danneggiata (marcatura con EBD). I nostri risultati
sono in accordo con quelli di Boland e colleghi (Boland et al., 1995) i quali non hanno mai
osservato cellule necrotiche, fibrosi o altre alterazioni morfologiche in diversi tipi di muscoli
lisci distrofici. Tuttavia, lo spessore dello strato muscolare liscio gastrointestinale nei topi mdx
è significativamente ridotto rispetto a quello presente in animali wild-type, suggerendo che
possa esservi una blanda necrosi cellulare ed atrofia muscolare non rilevabile al microscopio
elettronico (Boland et al., 1995), ma responsabile di molte disfunzioni gastrointestinali
osservate in pazienti DMD (Nowak et al., 1982; Leon et al., 1986; Barohn et al., 1988).
Inoltre, le cellule muscolari circolari provenienti da diverse zone del colon, ma non quelle del
duodeno, di topi mdx presentano attività elettrica (Serio et al., 2001) e motoria (Mancinelli et
al., 1995; Mulé et al., 1999) alterate, indicando che tipi diversi di muscoli lisci potrebbero
essere differentemente affetti dalla patologia distrofica, come dimostrato per i muscoli
scheletrici (Porter et al., 2004). Le cellule muscolari lisce dell’iride di topi mdx potrebbero
essere simili, sotto questo aspetto, a quelle del colon e quindi è ragionevole supporre che
possano incorrere in alterazioni molecolari e funzionali, ultrastrutturalmente non rilevabili,
ma responsabili della perdita di neuroni del GCS.
Sebbene la ghiandola sottomandibolare è considerata uno dei tessuti bersaglio del
GCS di tipo non muscolare, essa contiene cellule simili a quelle muscolari lisce che
esprimono la Dp427. La mancanza di distrofina ad alto peso molecolare nei topi mdx, tuttavia,
non induce danni strutturali evidenti in alcun tipo cellulare ghiandolare, come dimostrato
dall’assenza di marcatura con EBD, anche nei miociti, la cui modesta attività meccanica,
comunque, non può essere confrontata con quella delle cellule muscolari del cuore e
dell’iride. Ciò non esclude automaticamente la presenza di alterazioni funzionali nei miociti o
nelle cellule secretorie, che tuttavia potrebbero essere non rilevanti per la sopravvivenza
neuronale del GCS. Inoltre, è stato dimostrato che i livelli di NGF, di cui la ghiandola
sottomandibolare è la maggiore produttrice, non sono significativamente ridotti nei topi mdx
giovani (4 settimane di età), ma risultano marcatamente elevati in topi adulti (Hirota et al.,
1994), essendo quindi più che sufficienti per la sopravvivenza neuronale.
21
In conclusione, nei topi mdx, la mancanza di Dp427 altera direttamente la crescita
assonale e l’arborizzazione terminale dei neuroni del GCS. Mentre queste alterazioni non
inducono di per se morte neuronale, possono avere un effetto indiretto sulla sopravvivenza dei
neuroni del GCS danneggiando i loro bersagli muscolari. Noi ipotizziamo che le alterazioni
dei neuroni simpatici e dei loro bersagli muscolari conseguenti alla mancanza di Dp427
potrebbero giocare un ruolo fondamentale nella genesi delle disfunzioni del sistema nervoso
autonomo osservate nei pazienti di DMD.
IL RUOLO DELLE METALLOPROTEASI NEL RIMODELLAMENTO SINAPTICO
INDOTTO DA ASSOTOMIA DEI NEURONI DEL GCS
Lo schiacciamento delle fibre postgangliari del GCS è una strategia sperimentale
utilizzata per indurre il distacco temporaneo delle terninazioni presinaptiche dal corpo
cellulare dei neuroni assotomizzati, le quali verranno ripristinate una volta che l’assone
rigenerato avrà di nuovo preso contatto con gli appropriati bersagli periferici. Studi precedenti
condotti nel nostro laboratorio, hanno dimostrato che la mancanza di Dp427 nei topi mdx
interferisce con questo processo di rimodellamento sinaptico indotto da danno assonale, in
quanto la riduzione del numero di sinapsi intragangliari durante la reazione al danno assonale
avviene più lentamente rispetto ai topi wild-type. La Dp427, responsabile del legame tra il
citoscheletro di actina e la MEC tramite il distroglicano, è probabilmente uno dei primi
bersagli dei segnali che si originano al punto di lesione e portano al disassemblaggio delle
sinapsi. La sua assenza nei topi mdx renderebbe più lento tale processo (Zaccaria et al., 2000).
Partendo da queste osservazioni ci siamo chiesti quali fossero i meccanismi molecolari alla
base di tale rimodellamento sinaptico intragangliare. Studi recenti hanno dimostrato il
coinvolgimento della MMP-2 e della MMP-9 in alcuni fenomeni di plasticità neuronale e
sinaptica, sia fisiologica che patologica, nei quali l’attivazione delle MMPs nel vallo sinaptico
porta alla degradazione di proteine importanti per la stabilizzazione sinaptica, quali il distroglicano. Abbiamo quindi studiato l’andamento temporale dell’espressione e
dell’attivazione delle MMPs in seguito allo schiacciamento dei nervi postgangliari del GCS di
ratto.
Caratterizzazione delle gelatinasi in GCS di ratti di controllo ed in seguito a danno
assonale
Nel sistema nervoso, l’espressione di MMPs è stata dimostrata sia in processi
fisiologici che patologici (Dzwonek et al., 2004). In particolare, la MMP-2 e la MMP-9 sono
coinvolte nella crescita neuritica (Oh et al., 1999), nella degenerazione e rigenerazione dei
nervi periferici (Yamada et al., 1995; Ferguson and Muir, 2000; La Fleur et al., 1996; Kherif
et al., 1998; Duchossoy et al., 2001; Platt et al., 2003; Demestre et al., 2004) e nella plasticità
neuronale (Kaczmarek et al., 2002; Szklarczyk et al., 2002; Dzwonek et al., 2004). In questa
tesi, abbiamo utilizzato l’assotomia dei neuroni del GCS come procedura sperimentale per
indurre il distacco temporaneo dei bottoni presinaptici dal soma dei neuroni assotomizzati, ed
abbiamo verificato se la MMP-2 e/o la MMP-9 fossero coinvolte in questo processo. I risultati
ottenuti mediante zimografia in gel non solo dimostrano che la MMP-2 è costitutivamente
espressa nei gangli di controllo, ma anche che la sua attività aumenta progressivamente a
partire da 30 minuti dal danno assonale, raggiungendo un plateau tra 1 e 5 giorni
postoperatori. Sia nei gangli di controllo che in quelli operati sono visibili due bande
gelatinolitiche, a 72 kDa e a 62 kDa. Il peso molecolare, la comigrazione con il proenzima e
la forma attiva del peptide umano della MMP-2 ricombinante e il fatto che la loro attività
gelatinolitica venga inibita da chelanti del Ca2+, quali l’EDTA, ma non da inibitori delle serin
proteasi, dimostrano che queste due bande rappresentano rispettivamente la pro-MMP-2 e la
MMP-2 attiva. I risultati ottenuti in questa tesi, insieme a quelli derivati da esperimenti
precedenti in cui è stato dimostrato che l’intervallo di tempo compreso tra 1 e 5 giorni post22
assotomia rappresenta il periodo in cui si verifica il distacco dei bottoni presinaptici dal soma
dei neuroni gangliari (Zaccaria et al., 1998; Del Signore et al., 2004), permettono di ipotizzare
che la MMP-2 sia coinvolta, almeno in parte, in questo fenomeno. Un’ulteriore conferma
della presenza e dell’attivazione della MMP-2 nei GCS dopo schiacciamento delle fibre
postganglioari è stata fornita dall’analisi in Western immunoblot condotta su estratti di GCS
alle stesse date postoperatorie analizzate nella zimografia in gel. Mediante zimografia in situ
e, in mdo più significativo, con l’immuncitochimica per la MMP2 al microscopio ottico
abbiamo dimostrato che quella che era solo una debole marcatura extracellulare in gangli di
controllo, aumenta significativamente di intensità sia nelle regioni extracellulari sia intorno al
corpo cellulare di diversi neuroni gangliari 5 giorni dopo assotomia. Inoltre, la dimostrazione,
al microscopio elettronico, della presenza di frequenti vescicole immunopositive per la MMP2 che si fondono con la membrana plasmatica neuronale è un’ulteriore conferma che l’enzima
viene attivamente esocitato nello spazio extracellulare dove verrà attivato. La presenza di
aggregati di marcatura in corrispondenza di specializzazioni post-sinaptiche o di bottoni
pregangliari ormai separati dal proprio partner postsinaptico suggeriscono anche un rilascio
controllato nelle zone sinaptiche che potrebbe favorire la degradazione di molecole coinvolte
nella stabilizzazione delle sinapsi. Del resto, un ruolo funzionale della MMP-2 nel controllo
dell’arborizzazione assonale e nella plasticità neuronale indotta da lesione è stato proposto
anche da Reeves e colleghi, i quali hanno dimostrato che la deafferentazione, ed il
conseguente recupero funzionale, delle proiezioni della corteccia entorinale verso il giro
dentato dell’ippocampo correlano con un aumento dell’attività della MMP-2 (Reeves et al.,
2003).
Studi recenti condotti su diverse linee tumorali hanno dimostrato che, diversamente
dalle altre MMPs, l’attivazione della pro-MMP-2 non dipende, almeno inizialmente,
dall’azione di serin proteasi, e coinvolge la MT1-MMP ed il TIMP-2 attraverso un
meccanismo a più stadi (Strongin et al., 1995). In particolare, la MT1-MMP presente sulla
superficie cellulare lega ed è inibita dal dominio N-terminale del TIMP-2, mentre il dominio
C-terminale del TIMP-2 legato agisce come recettore della pro-MMP-2. Una MT1-MMP
adiacente, ma non legata al TIMP-2 (e quindi non inibita), taglia ed attiva la pro-MMP-2
legata. Al taglio iniziale della pro-MMP-2 da parte della MT1-MMP segue la rimozione di
una porzione residua del propeptide della MMP-2 eseguita da un’altra molecola di MMP-2
attiva o da una serin proteasi che produrrà una forma di MMP-2 attiva (Deryugina et al.,
2001). Per verificare se un analogo meccanismo di azione moduli l’aumento di espressione ed
di attività della MMP-2 osservata in seguito ad assotomia dei neuroni del GCS, abbiamo
studiato l’espressione di MT1-MMP e TIMP-2 in estratti di GCS di controllo ed a differenti
date postoperatorie. I risultati ottenuti dimostrano che in gangli di controllo la MT1-MMP è
presente nella sua forma inattiva di 60 kDa a livelli rilevabili, mentre il TIMP-2 è invece
molto poco espresso. A partire da 30 minuti dopo schiacciamento delle fibre postgangliari i
livelli di espressione di queste due proteine aumentano e rimangono elevati almeno fino ad 1
giorno post-assotomia. Inoltre, sempre a partire da 30 minuti, compare la forma enzimatica
attiva della MT1-MMP (57 kDa). Evidenze recenti hanno dimostrato che la concentrazione
della MT1-MMP attiva sulla superficie cellulare è regolata direttamente e positivamente dai
livelli di TIMP-2. E’ noto infatti che la pro-MT1-MMP viene convertita intracellularmente
nella sua forma attiva e, una volta traslocata sulla superficie cellulare, è in grado di legare il
TIMP-2 presente e di formare il complesso ternario che determinerà l’attivazione della proMMP-2. Se il TIMP-2 non è sufficientemente espresso, la MT1-MMP attiva sulla superficie
cellulare va incontro ad un processo di autocatalisi, trasformandosi nella forma di 44 kDa che
manca del dominio catalitico e non è più in grado di attivare la pro-MMP-2 (HernandezBarrantes et al., 2000). Sulla base di questi dati di letteratura e dei risultati da noi ottenuti,
possiamo affermare che esiste una correlazione temporale tra l’aumento dell’attività ed
dell’espressione della MMP-2 e quello della MT1-MMP attiva e del TIMP-2 in seguito a
danno assonale. Una prova ulteriore a favore dell’ipotesi che l’attivazione della MMP-2 è
23
modulata da parte della MT1-MMP e del TIMP-2 deriva dallo studio dei livelli di mRNA per
queste tre proteine in seguito a danno assonale. Infatti, i risultati ottenuti hanno dimostrato che
solo i livelli di mRNA per la MT1-MMP e il TIMP-2 aumentano significativamente in seguito
a danno assonale. Ciò suggerisce che l’espressione di questi enzimi sia finemente regolata a
livello trascrizionale, mentre la MMP-2 potrebbe essere controllata attraverso un meccanismo
unico di attivazione enzimatica che passa attraverso diversi possibili stadi di stabilizzazione
post-trascrizionale, come proposto da Sternlicht e Werb (2001).
Considerando che, al livello del sistema nervoso, lo spazio extracellulare tra i neuroni manca
della lamina basale e non contiene i componenti della MEC generalmente suscettibili di
degradazione da parte delle MMPs, uno degli obiettivi successivi era quello di identificare
quale proteina potesse essere substrato della MMP-2 nel GCS. Evidenze recenti hanno
suggerito che i substrati delle MMPs disponibili nel sistema nervoso sono proteine coinvolte
nella plasticità neuronale indotta, per esempio, da iperstimolazione da kainato (Szklarczyk et
al., 2002; Kaczmarek et al., 2002). Tra questi, un buon candidato è il -distroglicano (Yamada
et al., 2001; Kaczmarek et al., 2002; Dzwonek et al., 2004), una proteina della superficie
cellulare implicata nella stabilizzazione dei contatti sinaptici (Sugita et al., 2001) e nel
potenziamento a lungo termine, un modello di plasticità neuronale (Moore et al., 2002). E’
stato dimostrato che le MMPs sono in grado di degradare il -distroglicano tramite
l’escissione proteolitica del suo dominio extracellulare e la produzione di un frammento di 30
kDa, che comprende i domini citoplasmatico e transmembrana (Yamada et al., 2001;
Kaczmarek et al., 2002). I risultati ottenuti dall’analisi di Western immunoblot su estratti di
gangli di controllo ed a diverse date postoperatorie dimostrano che nel nostro modello
sperimentale lo schiacciamento delle fibre postgangliari induce un’aumento precoce del distroglicano e, tra 1 e 5 giorni postoperatori, del frammento di 30 kDa. Poiché tale aumento
raggiunge un plateau tra 3 e 5 giorni postoperatori, quando anche l’espressione ed l’attività di
MMP-2 è massima, si può ipotizzare che anche nel nostro modello sperimentale il distroglicano sia degradato da questa gelatinasi. In accordo con questi risultati sono quelli
ottenuti precedentemente nel nostro laboratorio che hanno dimostrato che il distacco dei
bottoni presinaptici indotto dall’assotomia dei neuroni del GCS è preceduto dalla rimozione
e/o dalla modificazione di proteine delle specializzazioni postsinaptiche, coinvolte nella
stabilizzazione strutturale e funzionale delle sinapsi intragangliari, tra le quali il distroglicano (Zaccaria et al., 1998; Del Signore et al., 2004). L’aumento precoce
dell’espressione del -distroglicano è comunque in accordo con dati precedenti ottenuti nel
nostro laboratorio i quali hanno dimostrato un’aumento repentino del mRNA che codifica per
questa proteina in seguito all’assotomia dei neuroni del GCS (Zaccaria et al., 2001).
24
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