DIPARTIMENTO DI FARMACIA-SCIENZE DEL FARMACO
Sezione di Farmacologia
RESEARCH DAY
RICERCA PRE-CLINICA DELLE DISTROFIE MUSCOLARI
E DELLE MIOPATIE INFIAMMATORIE: CROSS-TALK
TRA INFIAMMAZIONE ED ALTERAZIONI
METABOLICHE E IDENTIFICAZIONE DI NUOVI
TARGETS FARMACOLOGICI
Bari 28-02-2014
Capogrosso Roberta Francesca
Assegnista di ricerca
DISTROFIE MUSCOLARI
Distrofia muscolare di Duchenne
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Miopatia ereditaria legata al cromosoma X
1/3500 bambini nati maschi vivi
Progressiva degenerazione muscolare con severa debolezza e fatica
Esordio tra 3-5 anni e perdita di deambulazione autonoma
Morte intorno ai 20-30 anni (compromissione cardio-respiratoria)
MECCANISMI PATOGENETICI
Alterazione del complesso DGC
(difetto genetico)
Delocalizzazione dell’ nNOS
Instabilità meccanica del
sarcolemma
Danno sarcolemmale indotto
dall’attività contrattile
Ischemia funzionale indotta da
contrazione
Infiammazione
cronica
Perossidazione della membrana
indotta da ROS
Citochine pro-infiammatorie
(TNF-α, IL-1...)
Citochine pro-fibrotiche
(TGF-β, miostatina)
Morte della miofibra,
mancata rigenerazione e fibrosi
La cronicizzazione dell’infiammazione dipende dall’alterata meccano-trasduzione
delle miofibre mancanti di distrofina/DGC che innesca meccanismi di auto-rinforzo per i
suoi effetti sul metabolismo e sul rimodellamento muscolare.
Ipotesi:
Michele & Campbell, JBC 2003
Complesso cross-talk tra attività fisica ed infiammazione
Handschin, 2009
Suscettibilità del topo mdx ed altri animali distrofici all’esercizio
Standard protocol:
4-18 week-old male mdx and wt mice
30 min running on horizontal treadmill at 12 m/min twice a
week for 4-12 weeks
(http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/)
Handschin, PAPS 2009
• Il muscolo distrofico risponde
all’esercizio con un alterato
adattamento metabolico?
• Questa alterazione metabolica è
correlata all’infiammazione cronica?
Obiettivo
Identificazione di nuovi bersagli farmacologici al fine di individuare
nuove strategie terapeutiche
Batteria di test e approccio multidisciplinare
Tempo di raccolta degli end-points:
Tempo 0 (4-5 settimane di età, solo in vivo)
Tempo 4 (8-9 settimane di età)
Tempo 12 (16-17 settimane di età)
In vivo –metodiche comportamentali e fisiologia sistematicaFunzioni vitali, peso corporeo, forza degli arti anteriori, test di resistenza alla fatica.
Ex vivo -diversi muscoli scheletrici e altri tessutiStudi funzionali
Contrazione isometrica ed eccentrica di singoli muscoli
Microspettrofluorimetria con fura-2 per omeostasi del calcio
Accoppiamento eccito-contrattile (elettrofisiologia mediante microelettrodi)
Biochimica e Biologia Molecolare
Spettrofotometria, ELISA, real-time PCR
Istologia e Immunoistochimica
RISULTATI IN VIVO
L’esercizio riduce significativamente la forza delle zampe anteriori nel
topo distrofico mdx , riduzione mantenuta fino alle 12 settimane
RISULTATI IN VIVO
Test acuto di exhaustion:
5 min at 5 m/min e incrementi
di 1m/min fino ad exhaustion
Resistenza alla fatica
Burdi et al., 2009
L’esercizio peggiora significativamente la performance
peggioramento mantenuto fino alle 12 settimane
dei
topi
mdx,
RISULTATI EX VIVO
Extensor digitorum longus
Fatica in vitro
• L’esercizio peggiora la fatica del muscolo EDL dei topi mdx
• L’esercizio riduce l’affaticamento del muscolo EDL dei topi wt
RISULTATI EX VIVO
EDL contrazione eccentrica
La mancanza di adattamento, più che di un danno strutturale,
può sottolineare la maggior suscettibilità delle fibre distrofiche
allo stretch meccanico
Attualmente è in fase di valutazione l’attività contrattile in vivo
ESERCIZIO FISICO
ESPRESSIONE di GENI TARGET
MUSCOLO SCHELETRICO
RIGENERAZIONE
METABOLISMO
INFIAMMAZIONE
Espressione del PGC-1α e di altri geni sensibili all’esercizio
12 settimane di esercizio
PGC-1α
Sirtuina 1
BNIP3
Viene ridotta significativamente nei topi mdx esercitati
l’espressione di geni di fattori protettivi
Effetto dell’esercizio sull’espressione di geni markers di danno
NOX2 (gp91phox)
TGF-β
Viene aumentata significativamente nei topi mdx
l’espressione di geni di fattori protettivi
TNF-α
Nella Distrofia muscolare di Duchenne
allo
stress
meccanico
alterato
metabolico
suscettibilità Fattori
adattamento di danno
Effetto dell’esercizio sui ROS muscolari
Burdi et al, J Appl Physiol 2009
Fattori
protettivi
Targets ROS-sensibili
I ROS possono modulare il signalling di infiammazione ed accelerare la degradazione del
complesso DGC mediante attivazione di proteine red-ox sensibili
Src-tirosin chinasi
Okutani et al 2006
E’ aumentata significativamente nei topi mdx l’espressione
dell’src-tirosin chinasi
Effetto del Prednisolone sull’espressione dell’ SrcTK e PGC-1a
PDN: 1 mg/kg i.p. per 4 settimane in parallelo con l’esercizio
PGC-1α
+
PDN ha indotto un’ up-regulazione dell’utrofina
Effetto del Prednisolone sui distroglicani e altre proteine
Laminin
PDN: 1 mg/kg i.p. per 4settimane in parallelo con l’ esercizio
Tamma et al., Laboratory Invest 2013
Conclusioni
• Alterato accoppiamento meccano-metabolico in miofibre mancanti
di distrofina/DGC
•Difetto primario (alterata meccano-trasduzione) aumento di fattori
di danno e diminuzione dei fattori protettivi l’infiammazione cronica
• ROS possono giocare un ruolo attivo nel cross talk tra
infiammazione e alterato metabolismo nelle miofibre distrofiche
• Interesse di farmaci con azione anti-infiammatoria e che potenziano
i pathways dei fattori protettivi
In fase di valutazione sperimentale:
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Farmaci che stimolano la via PGC-1α/SIRT-1
Farmaci che contrastano NADPHox
Farmaci che contrastano SrcKinasi
Farmaci che aumentano l’espressione delle proteine del DGC (utrofina)
Farmaci che migliorano l’omeostasi del calcio (coinvolta nei difetti
contrattili e nei processi infiammatori)
Nelle distrofie muscolari
Difetto primario
suscettibilità meccanica
infiammazione
Polimiosite (miopatia idiopatica infiammatoria) Modello HT
Infiammazione
metabolica
suscettibilità meccanica
alterazione
…GRAZIE PER L’ATTENZIONE
Coordinatore Scientifico:
Prof.ssa Annamaria De Luca
Sez. di Farmacologia
Collaborazioni esterne
Anna Cozzoli
Arcangela Giustino
Antonella Liantonio
Giulia Camerino
Elena Conte
Maria Cannone
Ada Massari
Paola Mantuano
Prof. Kannebojina Nagaraju
Research Center for Genetic Medicine, Children's National Medical Center and
Washington, USA.
Prof. Miranda Grounds and Prof . Peter Arthur
The University of Western Australia, Perth, Australia
Prof. Kay Davies,
MRC Functional Genomics Unit, Department of Physiology Anatomy and Genetics,
University of Oxford, UK
Prof. Robert Grange
Department of Human Nutrition, Foods and Exercise, Virginia Polytechnic, USA
Claudia Capozzi
Massimiliano Guidetti
Milena Mariani
Collaborazioni altri Dipartimenti Università di Bari
Prof. Monica Montagnani
Dip. Di Farmacologia e Fisiologia Umana, Sez. Di Farmacologia, Facoltà di Medicina, Università
di Bari
Prof.ssa Diana Conte Camerino Prof. Beatrice Nico
Dip. Di Anatomia Umana e Istologia, Facoltà di Medicina, Università di Bari
