Proteine e trasduzione del segnale PROTEINE Struttura Intelaiatura citoscheletrica, strutture cellulari, impalcatura di sostegno extracellulare Funzione Catalisi enzimatica, riconoscimento, trasporto, deposito, movimento, difesa La struttura delle proteine ne determina la funzione. Strutture primaria, secondaria, terziaria, quaternaria. Presenza di DOMINI -> motivi particolari L’omologia delle sequenze suggerisce relazioni funzionali ed evolutive tra le proteine Chaperonine -> catturano alcune proteine appena formate e le isolano dall’ambiente esterno; gli permettono di raggiungere la configurazione finale e le rilasciano nel distretto idoneo. Proteine denaturate al calore, con acidi o basi perdono la loro struttura terziaria e secondaria e quindi la funzione biologica --> è un cambiamento reversibile perché sono implicati solo legami deboli che si riformano spontaneamente. Modificazione degli aa post sintesi --> maggiore varietà delle proteine - metilazione - aggiunta di gruppi –OH PROTEINE CONIUGATE Glicoproteine: enzimi, Ab, molecole di riconoscimento e recettori, supporti extracellulari Il gruppo glucidico permette di formare legami idrogeno che stabilizzano le proteine, ne aumentano la solubilità e conferiscono resistenza all’attacco enzimatico; forniscono gruppi specifici, riconoscibili dai ligandi. Lipoproteine: nelle membrane cellulari, soprattutto nella membrana plasmatica, dove il gruppo lipidico funge da ancora per la proteina. Metallo proteine: la loro presenza è necessaria per l’attività degli enzimi. La degradazione delle proteine può avvenire, ad esempio, attraverso la via mediata dall’ubiquitina (Ub) che riconosce delle proteine target che devono essere degradate, le marchia spendendo energia in modo che vengano riconosciute da un secondo sistema enzimatico in grado di degradarle. Degradazione = rottura dei legami peptidici, irreversibile Proteine conformate in modo aberrante sono implicate nello sviluppo di patologie: una placca amiloide nella malattia di Alzheimer è un agglomerato di filamenti proteici che non riesce ad assumere una conformazione funzionale -> diventa insolubile e ostruisce la cellula. Funzioni proteiche: la funzione proteica generalmente richiede dei cambiamenti conformazionali le proteine sono destinate a legare un range di molecole (ligandi) - il legame è caratterizzato da due proprietà: affinità e specificità gli Ab posseggono precise specificità di legame gli enzimi sono catalizzatori molto efficienti e specifici - il sito attivo di un enzima si lega al substrato Modello chiave-serratura: l’enzima ha già una forma complementare al substrato Modello ad adattamento indotto: enzima e substrato non sono perfettamente complementari ma quando si incontrano si adattano a vicenda Sito attivo aperto o chiudo per regolazione dell’attività Cinetica della reazione enzimatica -> Curva di saturazione dell’enzima -> V max -> Km Regolazione della funzione proteica (enzimi sempre presenti nella cellula) Transizioni allosteriche - Rilascio di subunità catalitiche, stato attivo <-> stato inattivo - Legame cooperativo del ligando Fosforilazione <-> defosforilazione Attivazione proteolitica -> zimogeni (attivazione per taglio proteolitico) Compartimentalizzazione Regolazione allosterica -> Inibizione a feed-back da prodotto finale -> Attivazione o inibizione allosterica (con sito allosterico sull’enzima) -> Rilascio allosterico di subunità catalitiche in presenza di cAMP Proteine di membrana Ciascuna membrana cellulare ha un set specifico di proteine che permette alla membrana stessa di svolgere le proprie specifiche attività Le proteine di membrana sono sia integrali sia periferiche Le proteine integrali di transmembrana contengono una o più -eliche transmembrana Altre proteine integrali sono ancorate alla membrana attraverso catene idrocarburiche legate covalentemente Le proteine periferiche rimangono legate alla membrana grazie all’associazione con le proteine di membrana Funzioni: trasporto, linkers, recettori, enzimi Membrana plasmatica Funzioni: o Assicurare la corretta composizione intracellulare o Ricezione dei segnali extracellulari o Adesione alla matrice extracellulare e alle cellule adiacenti -> doppio strato fosfolipidico -> proteine immerse -> attraversano completamente la membrana (transmembrana) o ne hanno immersa un’ancora molto profonda (integrali); sono glicoproteine -> non sono direttamente ancorate alla membrana (periferiche) La componente proteica delle membrane varia a seconda della funzione della cellula: maggiori sono le funzioni che deve svolgere e maggiore è la concentrazione di proteine presenti. Fosfolipidi Coda idrofobica glicerolo che fa da ponte Testa idrofilia -> gruppo fosfato + alcol - Struttura micellare - A doppio strato molecolare I due strati della membrana hanno una diversa disposizione dei tipi di fosfolipidi ---> rafts ---> zone specifiche ---> specifici fosfolipidi e specifiche proteine -> trasmettono i segnali all’interno della cellula -> microdomini del foglietto esoplasmatico costituiti da colesterolo e sfingolipidi Colesterolo: si intercala tra le code dei fosfolipidi e contribuisce a stabilizzare le membrane; se è presente in quantità eccessive irrigidisce la struttura e quindi deve essere altamente regolato. Proteine di transmembrana In ogni porzione gli aa che le costituiscono devono essere in grado di interagire con l’ambiente in cui si trovano (polare o non polare); in caso di mutazioni anche piccole la proteina potrebbe risultare per questo completamente alterata. Proteine integrali Posseggono una cosa capace di inserirsi nel doppio strato che la ancora alla membrana. Spostamenti di fosfolipidi nel doppio strato: - diffusione laterale -> rapida, avviene spesso e facilmente - diffusione da un foglietto all’altro -> molto lenta, avviene difficilmente e con grande dispendio di energia Passaggio attraverso la membrana Passano liberamente i gas, le piccole molecole non cariche, l’acqua (in tempi molto lunghi). Tutto ciò che è carico o di grosse dimensioni da solo non passa. Trasporto Passivo senza consumo di energia secondo gradiente di concentrazione o elettrochimico - diffusione semplice -> la molecola è in grado di passare il doppio strato fosfolipidico - diffusione facilitata -> avviene secondo gradiente ma richiede un carrier Attivo Fornita da ATP (pompe) richiede energia Fornita da gradiente ----> trasportano + di una proteina, quella secondo gradiente rilascia E utilizzata per trasporto contro gradiente avviene contro gradiente Proteine di trasporto Pompe: usano l’E ricavata dall’idrolisi dell’ATP per spostare ioni contro il gradiente di concentrazione Canali: trasportano H2O o specifici tipi di ioni secondo il gradiente di concentrazione. Le proteine che li compongono formano canali che attraversano la membrana. Sono di solito regolati da stimoli specifici. Trasportatori: legano ioni o molecole specifiche. Il legame con la molecola trasportata provoca un cambiamento conformazionale -> passaggio Uniporter -> diffusione facilitata Symporter + Antiporter -> trasporto attivo symporter antiporter Pompe ATPasi -> P almeno due subunità (o quattro) -> attiva, trasporto -> regolazione es. Na+/K+ -> F, V molte subunità trasportano protoni (H+) F localizzate nei mitocondri: fanno entrare secondo gradiente gli H + e usano l’energia così ricavata per generare ATP V localizzate nelle vescicole (lisosomi ed endosomi): abbassano il pH pompando H + all’interno delle vescicole -> ABC trasportano molte sostanze buttano fuori una serie di sostanze dannose alle cellule (compresi i chemioterapici) Pompa Na+/K+ Mantiene la ddp a cavallo della membrana Nel citoplasma ci deve essere un’elevata concentrazione di K+ e una bassa concentrazione di Na+ Necessita di ATP -> ad ogni trasporto butta all’esterno 3 Na+ e all’interno 2 K+ per ogni ATP Meccanismo: sito per l’ATP più tre siti ad alta affinità per Na+ e due siti con bassa affinità per K+ in condizioni di riposo. L’ATP fosforica la proteina e ne modifica la struttura. Essa si capovolge (o apre canali) e si ritrova con i siti di legame all’esterno della cellula. L’affinità dei siti cambia permettendo di rilasciare Na+ e catturare K+. Il gruppo fosfato viene staccato, la proteina si ribalta nuovamente, il K+ viene liberato e si ritorna alla situazione di partenza. Pompa Ca++ Mantiene bassa la concentrazione di calcio nel citoplasma perché questi ioni sono dei secondi messaggeri e si trovano racchiusi all’interno del REL La proteina ha due siti ad alta affinità per il Ca++ rivolti verso il citoplasma, gli ioni si legano, l’ATP fosforica, la pompa si ribalta, si libera Ca++, si stacca il gruppo fosfato, la proteina si rigira. Pompa F Trasporta 3 H+ attraverso un canale (secondo gradiente) -> sviluppa energia che viene recuperata sottoforma di ATP. Pompa ABC Presenta due regioni idrofobiche transmembrana e due regioni idrofiliche citoplasmatiche che legano l’ATP. Sono localizzate: - nei batteri -> nella membrana plasmatici dove trasportano aa, zuccheri e peptici - negli eucarioti nel reticolo endoplasmatico dove trasportano peptici per la presentazione antigenica nella membrana plasmatici dove trasportano piccole molecole, fosfolipidi e farmaci con struttura simile ai lipidi Meccanismi possibili: prende la sostanza presente sul versante citoplasmatico, la lega, si rovescia e libera la sostanza apre un canale che permette il passaggio della sostanza senza il ribaltamento Sono presenti in grande quantità nel fegato -> la sostanza tossica arriva al fegato, viene detossificata ed escreta con la bile MDR Canali -> fori nella membrana All’esterno del canale c’è la presenza di aa non polari ma nel centro del canale aa polari per permettere il passaggio di sostanze polari (grazie a ripiegamenti della catena). Normalmente il canale è chiuso -> ripiegamento della catena a formare un tappo che chiude il canale; per aprirlo avvengono delle modificazioni della catena -> regolazione tramite il voltaggio: fila di aa carichi + che tendono a stare verso la parte della proteina che guarda verso il citoplasma -> tengono chiuso il canale. Depolarizzazione -> si spostano verso l’esterno e aprono il canale -> regolazione con neurotrasmettitore che, legandosi al sito di legame, apre il canale Aquaporine -> canali selettivi che permettono solo il passaggio dell’acqua; sono presenti nelle zone dove c’è necessità di un grosso riassorbimento (rene, polmone, ghiandole salivari e lacrimali, SNC) Il glucosio passa dalle cellule epiteliali al sangue grazie a degli uniporter, all’apertura di questi canali. Saturazione Diffusione semplice Diffusione facilitata Nell’assorbimento intestinale, invece, il glucosio passa attraverso symporter Sangue Cellule epiteliali GLU Lume intestinale GLU uniporter Na+ GLU Na+ ATP 2 Na+ 2 Na+ ADP + Pi K+ K+ Na+/K+ ATPasi Symporter CITOSCHELETRO E FORME DI GIUNZIONE INTERCELLULARE Proteine coinvolte Actina - una delle proteine più abbondanti della cellula - monomero G-actina, polimero F-actina - ogni monomero contiene uno ione Mg2+ complessato con ATP o ADP - la G-actina polimerizza a formare F-actina in presenza di ioni divalenti, ma questo fenomeno è reversibile - durante la polimerizzazione l’ATP viene idrolizzato, ma questo influenza solo la velocità di reazione La G-actina viene assemblata in lunghi polimeri elicoidali di F-actina. Le subunità di G-actina sono orientate tutte allo stesso modo. Si definisce estremità - quella in cui il sito per l’ATP è a contatto con il citosol. Costituisce filamenti. Le proteine cross- linking si mettono a ponte tra i filamenti di actina -> struttura stabile ma reversibile adatta a costituire il citoscheletro. Il network di actina può essere in connessione con le proteine plasmatiche. Miosina Hanno testa, collo e coda. La testa aiuta nel movimento interagendo con i filamenti di actina; la cosa ancora la miosina. L’ATP si associa alla testa e provoca il distaccamento dal filamento di actina -> la testa si sposta e si aggancia in un altro punto -> l’ATP viene idrolizzato -> il distaccamento del gruppo fosfato provoca un movimento nella testa -> l’ADP viene rilasciato e si torna alla situazione di partenza Microtubuli - polimeri di subunità globulari (tubulina) con forma tubulare - eterodimero di e tubulina; ognuna delle due subunità lega una molecola di GTP - lega GTP in maniera irreversibile, idrolizza GTP in GDP - GTP si trova all’interno del dimero, GTP si trova in superficie per consentire lo scambio tra GDP e GTP Costituiscono ciglia e flagelli (due) e cetrioli (tre). Quest’ultimi vanno a costituire il centro di controllo dei microtubuli -> organizzano la gestione dei microtubuli all’interno della cellula. Sono importanti anche nella formazione del fuso mitotico. Assemblaggio e disassemblaggio avvengono preferenzialmente all’estremità +. Prima viene assemblato il protofilamento I microtubuli servono anche per i movimenti di vescicole ed organelli. Chinesine e dineine - fanno da ponte tra il microtubuli e la vescicola che viene trasportata - le chinesine muovono verso l’estremità + dei microtubuli (trasposto anterogrado), le dineine verso l’estremità ogni tipo di vescicola è trasportata da una chinesina specifica, specificità determinata dalla coda della chinesina - le dineine si legano ai loro carichi mediante proteine adattatrici chinesine -> meccanismo attacco-stacco Microtubuli e mitosi -> ottenere una corretta separazione dei cromosomi: i microtubuli si attaccano al cinetocore del cromosoma Cinetocore = proteine specifiche con piastra interna (DNA) e piastra esterna (microtubuli) Adesione fra cellule e fra cellule e matrice I filamenti intermedi intervengono nella giunzione cellula-cellula; sono importanti per la formazione dei vari organi -> sono diversi a seconda dell’organo e sono coinvolte nel processo di riconoscimento tra cellule di diversi organi. Proteine di transmembrana -> all’interno della cellula sono legate ai microtubuli Tight junctions Giunzioni strette con necessità di Ca2+; E. coli è in grado di aprirle Presenti in serie Zona aderente -> caderine costituiscono i desmosomi -> filamenti di cheratina (citoscheletro) Gap junction -> canali tra una cellula e l’altra -> connessine - caderine -> legano solo tra di loro -> coda citoplasmatica, nella membrana strutturale esterna -> presenza di Ca2+ -> mediano l’adesione omofilica Ca2+ dipendente - cam (neural - cell adhesion molecules) -> molecole di adesione cellulare -> IgG -> mucina -> molecole per l’adesione cellulare Ca2+ indipendente Il loro ruolo nel determinare l’adesione è meno importante delle caderine. Possono non avere l’ancoraggio al di sotto del citoscheletro ma essere ancorate con code lipidiche - selectine Possono intervenire nella migrazione dei leucociti - integrine -> giunzione tra cellule e matrice extracellulare -> si attaccano sia dentro sia fuori la cellula con filamenti adesioni focali esmodesmosomi interno actina cheratina esterno fibronectina laminino Gap junction Canali selettivi per le dimensioni fino a 1000 Dalton Importanti per la risposta sincrona da più cellule Connessori costituiti da sei connessine -> ogni cellula forma metà canale Regolazione: possono essere chiuse per evitare di trasferire sostanze tossiche -> >>Ca2+ <<pH -> segno di morte imminente della cellula Mutazioni delle connessine: responsabili della sordità -> dominante o recessiva Malattia di Charcot-Marie-Tooth, neuropatia demielinizzante del sistema nervoso centrale e periferico Membrana cellulare “Signaling” cellula-cellula Sintesi e rilascio del segnale dalla cellula produttrice Trasporto alla cellula “target” Ricezione del segnale da parte della cellula “target” (recettori) Traduzione del segnale all’interno della cellula “target” (da recettori ad altre proteine) Risposta cellulare 1) Segnale endocrino: secrezione di un ormone che fa avvenire una risposta da cellule distanti 2) Segnale paracrino: secrezione e rilascio dell’ormone nello spazio extracellulare; risposta delle cellule vicine 3) Segnale autocrino: la cellula produttrice è la cellula target -> feed-back 4) Segnale della membrana plasmatica: attraverso le giunzioni Recettori intracellulari situati a livello del citoplasma -> la molecola che li colpisce attraversa liberamente la membrana -> ormoni steroidei Azione a livello del nucleo della cellula -> sintesi di proteine -> agisce sul nucleo facendo copiare in mRNA una determinata sequenza genica -> sintesi (o inattivazione della sintesi) Caratteristiche della risposta recettoriale 1) Interazione del ligando (ormone, fattore di crescita, neurotrasmettitore) con un recettore posto sulla superficie cellulare 2) Vie di risposta interna simili con diverse caratteristiche in comune (protein-chinasi -> fosforila) 3) Svariate proteine bersaglio dell’attività protein-chinasica (enzimi del metabolismo, proteine trasportatrici, proteine regolatrici) A inattiva B attiva -----> A attiva -----> B inattiva Protein-fosfatasi -> defosforilano Recettori situati sulla superficie a) Accoppiati a proteine G Ligando -> si lega al recettore -> attiva la proteina G -> agisce su altre proteine che generano un secondo messaggero ed, essendo molto piccole, diffondono -> i secondi messaggeri trasferiscono l’informazione all’interno della cellula (Ca2+) b) Ioni canale Ligando -> si lega al recettore -> permette l’apertura del canale -> passaggio di ioni c) Recettori legati a tirosin-kinasi (fosforilano dove c’è la tirosina) Recettore costituito da due subunità poste in vicinanza ma inattive e tirosin-kinasi inattive -> il ligando si mette a ponte tra le due subunità -> il recettore dimerizza -> attivazione della kinasi -> fosforilazione delle proteine -> attivazione o inibizione d) Recettori con attività enzimatica intrinseca Ligando -> si lega al recettore -> la parte intracitoplasmatica: 1) funge da enzima -> trasforma GTP in cGMP (secondo messaggero) 2) ha funzione chinasica -> fosforila a) G-proteins Proteine costituite da tre subunità: -> lega ed idrolizza il GTP -> sito attivo -> attiva le proteine a valle -> adenilato ciclasi (trasforma l’ATP in cAMP) , -> ancorano la proteina G alla membrana (tramite ) e mantengono inattiva la catena Esistono anche proteine G inibitorie 1 -> lega ed idrolizza il GTP, inibisce l’adenilato ciclasi G-protein attivante la fosforilasi C- che trasforma dei fosfolipidi di membrana in secondi messaggeri Il recettore che attiva la proteina G è costituito da: -> una parte esterna che lega il ligando -> dei domini transmembrana -> una zona interna che va ad interagire con la proteina G Avviene un cambiamento conformazionale del recettore ad opera del ligando che modifica la struttura della zona intercellulare -> attivazione della proteina G si sostituisce GDP con GTP -> distacco delle subunità e -> attivazione dell’adenilato ciclasi -> ATP -> cAMP + ppi Tutte queste molecole sono presenti in un raft lipidico Successivamente la subunità idrolizza il GTP -> si riforma la struttura trimerica -> viene bloccata l’attività della subunità L’adenilato ciclasi ha prodotto l’AMP ciclico che attiva l’A-kinasi (presente nel citoplasma o legata alla membrana) -> protein-kinasi dipendente dal cAMP presente in forma inattiva grazie a subunità regolatorie alle quali si lega l’cAMP -> le subunità si staccano -> si attiva la proteinkinasi A -> va nel nucleo a fosforilare proteine che regolano la trascrizione dei geni Può attivare un ligando che attiva un recettore che, a sua volta, attiva una proteina G inibitoria sullo stesso adenilato ciclasi. Ligandi di questa cascata -> glucagone, ACHT, eparina -> ad es. rilascio glucosio Secondi messaggeri: cAMP, cGMP, 1,2-diacilglicerolo (DAG), inositolo 1,4,5-trifosfato (IP3), Ca2+ DAG (idrofobica) e IP3 (idrofilica) sono costituenti dei fosfolipidi La fosfolipasi C agisce su un fosfolipide di membrana spaccandolo in due: la fostatidilinositolo kinasi fosforila in posizione 4, poi 5 (1 a ponte con glicerolo) la fosfolipasi può funzionare -> diacilglicerolo che resta nella membrana -> IP3 che va nel citoplasma IP3, nel citoplasma, agisce su canali specifici a livello del REL, aprendoli, il Ca2+ immagazzinato nel REL passa nel citoplasma secondo gradiente di concentrazione -> fuoriuscita di Ca2+ nel citoplasma Attiva la Pkc e provoca un suo spostamento verso la membrana plasmatica dove interagisce con il DAG L’attivazione di Pkc avviene attraverso La liberazione di ioni calcio (C2) Il suo movimento verso la membrana L’interazione con DAG (C1A – C1B) DAG va ad interagire sulla cascata delle MAP kinasi va ad agire a livello nucleare provocando la trascrizione di determinati geni Fosfolipasi A2 -> interviene nel ciclo dell’ac. arachidonico che è un precursore dei mediatori dell’infiammazione (convertito tramite lipo ossigenasi o ciclo ossigenasi in mediatori dell’infiammazione gli antinfiammatori non steroidei agiscono su questi due enzimi) -> agisce sulla Pkc, sulla fosfolipasi C e sulla liberazione di ioni calcio. Le citochinine hanno un ruolo essenziale nei processi infiammatori e nella risposta immunitaria. Il calcio liberato va ad interagire con la calmodulina -> può legare al massimo 4 ioni calcio -> il legame provoca un cambiamento conformazionale della proteina, attivandola -> in grado di legare (e quindi attivare) la cAMP fosfodiesterasi, un enzima che degrada il cAMP -> “spegne” il segnale -> meccanismo di controllo -> azione contraria rispetto all’adenilato ciclasi -> INSERZIONE TRA LE DUE VIE Ossido nitrico (NO) -> prodotto secondario derivato dalla conversione dell’L-arginina in Lcitrullina da parte di enzimi chiamati nitric oxide sinthase (NOS) Arginina + O2 -NOS-> citrullina + NO - n NOS neuronale produzione di - e NOS endoteliale (tono dei vasi) NO costante - i NOS inducibile (infiammazione) poco espresso, dopo stimolo Azione intracellulare di NO attivazione di fattori trascrizionali (proteine che agiscono sul DNA) interazione con proteine contenenti Fe -> emoglobina, proteine della catena di trasporto degli e legame con radicali liberi La calmodulina si va a legare anche al NOS -> produzione di NO -> nelle cellule endoteliali -> diffonde nelle cellule muscolari lisce che regolano il tono dei vasi -> agisce sulla guanilato ciclasi (che contiene Fe) -> da GTP a cGMP Recettori che si legano a proteine che hanno attività kinasica Recettore costituito da due subunità -> il ligando lo dimerizza -> attivazione Pk che vanno a fosforilare lo stesso recettore a cui sono state legate (l’altra subunità del recettore) -> nella sua porzione intracitoplasmatica. Alla zona fosforilata si vanno ad attaccare degli adattatori -> ponte tra recettore e proteine che attiveranno la cascata a valle. Domini degli adattatori - SH2 -> consente il legame alle tirosine fosforilate - SH3 -> interagisce con altre proteine per la trasduzione del segnale Gli adattatori vanno ad interagire con RAS che, se è legato con GTP è attivo, con GDP è inattivo; esso agisce attraverso le MAP kinasi ed è stato il primo oncogene scoperto (se mutato). GAP -> GTPase activactina protein -> stimola l’idrolisi di GTP GNRP (GEF) -> Guanine nucleotide releasing protein -> fa rilasciare GDP da RAS In condizioni patologiche RAS non è in grado di idrolizzare GTP -> la cascata successiva porta alla duplicazione cellulare -> se patologica -> tumori Differenti recettori possono concorrere attraverso vie diverse per arrivare allo stesso scopo. I fattori di trascrizione possono anche essere presenti nel citoplasma -> in forma inattiva che una volta attivati da una kinasi migrano nel nucleo.