Potenzialità del grano saraceno *tartarico* quale ingrediente per la

SVILUPPO DI METODI MOLECOLARI PER UN RAPIDO E PRECOCE RILEVAMENTO DI
DIFFERENTI FUNGHI TOSSIGENI IN MATRICI ALIMENTARI VEGETALI
Patrizia De Rossi, Valentina Tolaini, Antonella Del Fiore, Chiara Nobili e Fabio Vitali
ENEA – Agenzia nazionale per le nuove tecnologie, l’energia e lo sviluppo economico sostenibile
Unità tecnica Sviluppo Sostenibile ed Innovazione del Sistema Agro-Industriale
Laboratorio Innovazione Agro-Industriale (UTAGRI-INN)
INTRODUZIONE
MATERIALI E METODI
La contaminazione fungina nelle matrici alimentari è causa di deterioramenti che
possono determinarne l’inidoneità al consumo ed alla trasformazione. Diverse specie
fungine inoltre possono sintetizzare le micotossine, metaboliti secondari, che
costituiscono un grave pericolo per la salute umana ed animale a causa della loro ampia
diffusione, elevata stabilità chimica e tossicità. L’identificazione dei funghi è ancora oggi
principalmente basata su sistemi microbiologici di coltivazione ed osservazione dei
caratteri morfologici che richiedono tempi lunghi. Le analisi molecolari basati
sull’amplificazione del DNA mediante la reazione a catena della polimerasi (PCR),
caratterizzate da elevata sensibilità, specificità, ripetibilità, rapidità e dall’assenza di
variabilità legata al ciclo di sviluppo dell’organismo da identificare, possono
rappresentare un’interessante alternativa ai metodi tradizionali. Scopo di questo studio
è lo sviluppo di metodi di tipo quantitativo (PCR real-time) basati sull’amplificazione di
specifiche sequenze target di DNA, per il rapido e precoce rilevamento dei funghi
tossigeni Aspergillus carbonarius, A. flavus, A. parasiticus, Fusarium graminearum,
Penicillium exspansum,, principali contaminanti rispettivamente di uva, mais, grano e
mele.
L’estrazione del DNA totale da ciascuna matrice è stata effettuata con il metodo TRISSDS Lysis Buffer seguendo il protocollo riportato da Farber (1997). Per ciascuna
specie fungina sono stati individuati dei geni target su cui sono state disegnate coppie
di primers specie-specifici utilizzate nelle prove di amplificazione PCR Real time
(tabella 1). La PCR real-time è stata condotta in un termociclatore Applied Biosystem
7000 collegato ad un PC con apposito software per elaborazione dei dati. Il
programma di amplificazione specifico per le singole coppie di primers è riportato
nella tabella 2.
Primer
Forward 5’-3’
frammento
GCAGCGGGAGTCAATGTAAT
GCGTCGTACAAAGCCTCTT
330 bp
AcITS
GTGAAGTCTGAGTCGATTGTT
GGAAAAAAAGGTTGGAGTT
239 bp
Pepg1
GGTAAAAACTCCCTCCAAACC
GAAACGGGAAAACTTAGTCATTA
747 bp
TTGACACGCAGTGTTGTTCTGGGA
TGCACCACTGGTTCCCGAATAGC
135 bp
ATGTCGGATAATCACCGTTTAGATGGC
CGAAAAGCGCCACCATCCACCCCAATG
895 bp
Afl M
Afl P
GGCCCGGTTCCTTGGCTCCTAAGC
CGCCCCAGTGAGACCCTTCCTCG
1254 bp
Afl R
AATACATGGTCTCCAAGCGG
GAAGACAGGGTGCTTTGCTC
360 bp
N1-2
CTTGTTAGGCTAAGCGTTTT
AACCCCTTTCCTATGTGTTA
200 bp
tri5-tri6
ATCCCTCAAAAACTGCCGCT
ACTTTCCCACCGAGTATTTC
650 bp
Tabella 1-Sequenze nucleotidiche dei primers specie-specifici e lunghezza frammento amplificato (De
Rossi et al., 2010; Del Fiore et al., 2010; Nobili et al. 2011, Tolaini et al, 2010)
Tabella 2-Protocollo di
amplificazione PCR realtime utilizzato per ciascuna
coppia di primer speciespecifici.
I risultati delle amplificazioni in PCR real-time riportati in tabella 3 mostrano la
presenza di DNA fungino in 34 dei 39 campioni analizzati. Le analisi microbiologiche
tradizionali hanno confermato i risultati molecolari a dimostrazione della sensibilità e
della capacità dei primers di diagnosticare precocemente la presenza del fungo
direttamente sulla matrice reale.
Lunghezza
Reverse 5’-3’
Acpks
PG1
RISULTATI E DISCUSSIONI
Acpks
AcITS
PG1
AflR
Denaturazione iniziale
95°C 10’
95°C 10’
94°C 1’
95°C 10’
94°C 2’
Denaturazione
95°C 15”
95°C 15”
94°C 15”
94°C 30”
94°C 1’
67.1°C 30”
67.1°C 30”
57.4°C 20”
66°C 30”
55°C 30”
35 cicli
35 cicli
32 cicli
37 cicli
35 cicli
CAMPIONI
uva
N1-2 tri5-6
mela
Appaiamento
Allungamento
72°C 20”
72°C 15”
72°C 15”
72°C 50’’
72°C 40”
CONCLUSIONI
Nel presente lavoro è stata sviluppata una metodica molecolare di rilevamento
precoce della contaminazione fungina in matrici alimentari (uve, grano, mele, mais)
basata sull’amplificazione di sequenze target di DNA fungino con primers speciespecifici. Alle condizioni testate le coppie di primers utilizzate si sono contraddistinte
per specificità ed elevata sensibilità nei confronti delle sequenze target di DNA
fungino. I risultati ottenuti hanno permesso di individuare la presenza di Aspergillus
carbonarius su uva, A. flavus e A. parasiticus su mais, Fusarium graminearum su
grano e Penicillium expansum su mela. Le quantità di DNA fungino rilevate attraverso
il protocollo di PCR real-time hanno evidenziato una sensibilità del metodo tale da
permettere la determinazione nelle fasi iniziali dell’infezione, quando il micelio fungino
non è ancora visibile ad osservazione allo stereomicroscopio. I risultati ottenuti
confermano che le tecniche molecolari possono rappresentare un contributo concreto
alla prevenzione della contaminazione fungina su scala commerciale, permettendo di
individuare la presenza del fungo quando altri metodi ispettivi non lo consentono.
mais
VARIETA'
Concentrazione
DNA fungino
(pg DNA/mg
matrice)
Bombino nero
NR
Montepulciano
0.30±0.07
Cesanese
NR
Negroamaro 1
1.41±0.09
0.79±0.02
Negroamaro 2
0.47±0.03
Nero d’avola
0,29±0.01
Dama
Malvasia
Merlot
grano
Concentrazione
DNA fungino
(pg DNA/mg
matrice)
NR
0.39±0.05
Refosco
NR
Sangiovese
NR
81±4
T - Fg 126
365±18
S - Fg 126
T - Fg 8308
702±35
S - Fg 8308
575±29
MELA 1
1,06E-01±0,07
MELA 5
9,88E-02±0,001
MELA 2
8,79E-02±0,002
MELA 6
1,66E-01±0,08
MELA 3
3,15E-01±0,04
MELA 7
1,16E-01±0,03
MELA 4
1,22E-01±0,06
MELA 8
8,70E-02±0,005
Latina
89,45±0,27
Duende
293,65±0,37
Dk 537
494,65±0,16
Dkc 5143
46,59±0,22
Dkc 6843
0,122±0,007
Siv 6450
180297±248,55
Arsano
10,95±0,20
Mitic
63900±77,78
Costanza
28,23±0,27
Farina 1
70,96±0,35
Cecilia
13,70±0,18
Farina 2
79,37±0,29
Nk-criso
175,64±0,25
Farina 3
104,08±0,68
Corniola
7,75±0,12
Farina 4
5,43±0,20
Tabella 3- Quantificazione del DNA fungino in matrici reali attraverso
amplificazione PCR Real time con primer specie-specifici: AcPKS per
A. carbonarius in uva, N1-2 e tri5-tri6 per F. graminearum in grano,
PG1 per P. expansum in mela, Afl R per A. flavus e A. parasiticus in
mais. NR=DNA non rilevato
Figura 1-Matrici alimentari sottoposte a screening PCR real time
per la rilevazione di DNA fungino.
BIBLIOGRAFIA
P. De Rossi et al. Quality Assurance and Safety of Crops & Foods. 3, 120-126, 2010
A. Del Fiore et al. Quality Assurance and Safety of Crops & Foods. 2, 22-27, 2010
C. Nobili et al. Journal of life sciences. 5(2), 2011
P. Färber at al. International Journal of Food Microbiology, 2 (36), 215-220, 1997
V. Tolaini et al. International Journal of Food Microbiology. 138(3), 243-249, 2010