Genetica Molecolare della
malattia di Hirschsprung
Isabella Ceccherini
UOC Genetica Medica, IGG
Roma,
23.09.2016
ENTERIC NERVOUS SYSTEM DEVELOPMENT
Le “enteric Neural Crest Derived
Cells” (ENCDCs) migrano dalle creste
neurali verso l’intestino primitivo,
proliferano estensivamente e
differenziano in neuroni e glia,
aggregandosi in gangli a formare un
network lungo tutto l’intestino.
Nei vari stadi di maturazione i diversi
tipi cellulari esprimono sets variabili
di marcatori
La Malattia di Hirschsprung
Disordine congenito della motilità intestinale dovuto a mancanza di gangli in
segmenti variabili del tratto gastro-intestinale distale
Segmento corto
(80%: S-HSCR)
Segmento lungo
(15%: L-HSCR)
Aganglia colica totale (5%: TCA)
Incidenza
da 15/100.000 a 28/100.000
a seconda della popolazione
Rapporto sessi (M:F)
S-HSCR
L-HSCR/TCA
~ 4:1
~ 1.5:1
Familiarità
simplex (80%)
multiplex (20%)
Adapted from Heanue & Pachnis, Nat. Rev. Neurosci. 2007
EZIOLOGIA GENETICA ?
10q11.2-q21.2del
0.0
10p
12.3
12.2
12.1
D10S199
D10S208
11.2
11.1
11.1
11.2
21.1
10q
0.0
0.0
21.2
21.3
22.1
22.2
22.3
0.0
D10S196
D10S225
D10S220
D10S207
AFM234wh6
23.1
23.2
23.3
1993
chromosomi 10 deleti e “smallest region of overlap”
PATIENT 1
PATIENT 2
PATIENT 3
PATIENT 4
( without HSCR )
RET
Malattia monogenica/semplice :
F
e
n
o
t
i
p
o
*
E768D
S767R
A884F E921K
C609W/Y
L790F
L1061P
F393L
P20L
R77C
R180P
E289Q
D584G
A654T
E884D P921L
C611F
T791P
N394K
S32L
G93S
C197Y
R313Q
S690P
F893L R972G
C618R/S
S795R
R330Q
P399L
L40P
C142S
R231H
T729A
R897Q
P973L
V804L/M
C620R/S/W
E762Q
R57W
C157W
E251K
V331M
R475Q
K907E
M980T
R813Q
C634R/T/G
S765P
P1039L
P64L
F174S
R287Q
R360W
C570W
M918T
Q626K
R873Q
SP
CAD
CYS rich
TM
TK
IVS5+9G>A
c.1483ins6CAGGCC
IVS10as+68G>A
c.2379delC
W942X
N1059del
S365X
IVS7-2A>G
IVS10as+62C>T IVS12-2A>G
c.2793delAA
c.1120delG
C541X
IVS10+5G>C
IVS12+19C>T
E921X
c.3118del4CTGG
c.1204delC
c.1677dup21ins16; IVS10+2T>A
IVS12+13C>T
c.2675delA IVS17+5G>A
IVS6-5C>T
IVS14+5G>A c.2864insT
1699del15 IVS10+1G>A IVS11+5C>T
c.1836-1842del7CCCTGAG
H
S
C
HSCR
Class I
Class IIin <20% Class
Class IV
Mutazioni
germinali
di RETReduced
si trovano
degli
sporadici
R IIIHSCRCompromised
Reduced RET to
transport to cell
Abrogated
mutations
E136X
R180X
cell membrane
/ constitutive
/reduced kinase
e circa nel membrane
50%dimerization
degli
HSCR familiari
activity
adaptor protein
interaction
Malattia monogenica/semplice :
*
Eterogeneità genetica :
*
opp * opp
*
opp
*
F
e
n
o
t
i
p
o
H
S
C
R
Geni causativi della malattia di Hirschsprung
Combinazioni di varianti comuni, rare o private causano la malattia
di Hirschsprung
RET pathway
• Migrazione
• Proliferazione
• Differenziazione
EDNRB pathway
• Migrazione
• Differenziazione
prematura
•KBP pathway
• Differenziazione
Malattia monogenica/semplice :
*
Eterogeneità genetica :
*
opp * opp
*
opp
*
Malattia multigenica/complessa :
* +
*
+
* +
*
F
e
n
o
t
i
p
o
H
S
C
R
Ereditarietà complessa in HSCR
lR =
Rischio per i parenti del probando
Prevalenza nella popolazione generale
Ipertensione essenziale
Diabete di tipo 1
Malattia di Hirschsprung
Fibrosi cistica
2-3
15
200
500
il rischio di ricorrenza per i fratelli di un
probando è più grande di quello della
popolazione generale
Ereditarietà complessa in HSCR
Segmento
affetto
No. di
casi
Sesso
(m/f)
No. di Rischio per i
fratelli fratelli (%)
SHORT
LONG
424
49
4.4
1.9
847
97
3
17
150
850
Tutti i casi
487
3.9
979
4
200
l S*
* Assumendo una incidenza nella popolazione di 0.02%
Rapporto sessi e rischio di ricorrenza per fratelli di
pazienti HSCR : le forme lunghe hanno una maggiore
componente genetica (Badner et al., 1990)
Ereditarietà complessa in HSCR
Espressività variabile e penetranza ridotta
Il gene RET e malattie correlate
Il gene RET: interazioni e vie di trasduzione del segnale
Il gene RET: espressione durante lo sviluppo e nell’adulto
Progenitori delle creste neurali
Neuroni sistema nervoso periferico
Melanociti
Gangli enterici
Cellule C della tiroide
Rene
Testicoli
Placche del Peyer
variabilità fenotipica associata a mutazioni di RET
*
*
*
*
*
stesso fenotipo
E768D
S767R
A884F E921K
C609W/Y
L790F
L1061P
F393L
P20L
R77C
R180P
E289Q
D584G
A654T
E884D P921L
C611F
T791P
N394K
S32L
G93S
C197Y
R313Q
S690P
F893L R972G
C618R/S
S795R
R330Q
P399L
L40P
C142S
R231H
T729A
R897Q
P973L
V804L/M
C620R/S/W
E762Q
R57W
C157W
E251K
V331M
R475Q
K907E
M980T
R813Q
C634R/T/G
S765P
P1039L
P64L
F174S
R287Q
R360W
C570W
M918T
Q626K
R873Q
SP
CAD
E136X
R180X
CYS rich
TM
TK
IVS5+9G>A
c.1483ins6CAGGCC
IVS10as+68G>A
c.2379delC
W942X
N1059del
S365X
IVS7-2A>G
IVS10as+62C>T IVS12-2A>G
c.2793delAA
c.1120delG
C541X
IVS10+5G>C
IVS12+19C>T
E921X
c.3118del4CTGG
c.1204delC
c.1677dup21ins16; IVS10+2T>A
IVS12+13C>T
c.2675delA IVS17+5G>A
IVS6-5C>T
IVS14+5G>A c.2864insT
1699del15 IVS10+1G>A IVS11+5C>T
c.1836-1842del7CCCTGAG
HSCR
Class I
Class IIin <20% Class
IIIHSCR sporadici
Class IV
Mutazioni
germinali
di
RET
si
trovano
degli
Reduced
RET
to
Reduced
transport
to
cell
Abrogated
Compromised
mutations
cell membrane
/ constitutive
/reduced kinase
adaptor protein
e circa nel membrane
50%dimerization
degli
HSCR familiari
activity
interaction
variabilità fenotipica associata a mutazioni di RET
diversi fenotipi
*
*
*
*
*
stesso fenotipo
Malattia di Hirschsprung
(HSCR)
Neoplasia endocrina multipla di
tipo 2 (MEN2)
Disordine congenito della
motilità intestinale
Mutazioni : perdita di funzione
del gene RET
Sindrome neoplastica ereditaria
Mutazioni: acquisto di funzione
del gene RET
variabilità fenotipica associata a mutazioni di RET
diversi fenotipi
*
*
*
*
stesso fenotipo
Mutazioni germinali di RET si
possono osservare nel
98% MEN 2A
95% MEN 2B
88% FMTC
6-9% MTC sporadici
*
variabilità fenotipica associata a mutazioni di RET
diversi fenotipi
*
*
*
*
stesso fenotipo
*
Valutazione del rischio HSCR
Sui tre miliardi di
posizioni nucleotidiche
di ogni genoma, diversi
milioni mostrano
contenuto variabile
(polimorfico) tra gli
individui della
popolazione (SNPs)
Ereditarietà complessa in HSCR
L’ereditarietà complessa o non-Mendeliana deriva dall’accumulo di
difetti genetici comuni a geni multipli, ciascuno caratterizzato
dall’avere un piccolo effetto sul fenotipo
Genotipi
predisponenti
Genotipi
protettivi
rischio
Diversi genotipi al locus RET determinano gradi variabili di suscettibilità allo
sviluppo di HSCR in ciascun individuo della popolazione, membro di una
famiglia, etc
Identificazione di due aplotipi “funzionali” di RET
14
2
3’UTR
13
-5
15
19
-1
aplotipo predisponente
definito dagli SNPs –5, -1 e 2
ACA
aplotipo protettivo
definito dagli SNP 14 e 3’UTR
TC
Frequenze alleliche nella recente casistica HSCR / IGG
SNP2
mutazioni del gene RET e fattori di rischio HSCR
Mutazioni della sequenza codificante (CDS) << 1%
R897Q
C609Y
L40P
P20L
P399L
R231H R330
R475Q
C618R
S765P
Q
C142S
E251K F393L
C609W
S609P E762Q
cad
-27 C/G
S767R
G93S
S32L P64L
Il rischio verso HSCR
varia a seconda di:
Genere
Familiarità
Lunghezza aganglia
C620R
E136X R180X
cys rich
1063+9G/A1453ins6
C541X
1120delG
S365X
TM
TK1
F893L
P1039Q
R972G M1064T
K907E
P973L
R873Q E921K
M980T
TK2
2013del7
2397delC
E921X 2864insT
2285+19C/T
2675delA
167dup21ins16;
1699del15
W942X
2939+5G/A
Allele variante dell’enhancer
dell’introne 1 (NCDS) ~ 24%
Come si distribuiscono le mutazioni/varianti di RET in rapporti
ai diversi fattori di rischio?
International HSCR Consortium
diversi effetti fenotipici di mutazioni CDS e
NCDS del gene RET in HSCR
Genere
I
N
C
I
D
E
N
Z
A
Simplex
Segmento corto
Maschi
Mutazioni comuni
regione non codificante
Lunghezza
segmento
Mutazioni rare
regione codificante
Multiplex
Segmento lungo
Femmine
Familiarità
R
I
C
O
R
R
E
N
Z
A
Altri geni di
suscettibilità
ad HSCR
Approccio GWAS … neuregulina
Garcia-Barcelo et al., PNAS 2009
Approccio GWAS …
RET + semaforine
Identificati:
- variante NCD
prossimale a RET
- alleli NCDs sul
cromosoma 7, entro il
cluster genico delle
semaforine di classe 3
Rischio HSCR dovuto all’effetto dose di
alleli di suscettibilità
Osservate tre classi di individui:
La penetranza (probabilità di
essere affetti dato un certo
genotipo) varia tra
∼1/20000 nati vivi per la più
bassa classe di rischio (allele
count 0) e
∼1/800 nati vivi per la più alta
classe di rischio (allele count 5
or 6)
UNO, il rischio HSCR è altamente
significativo in individui con tre o
piu’ alleli di rischio
DUE, possedere uno solo o nessun
allele di rischio protegge
significativamente dalla malattia
TRE, individui con due alleli di
rischio non sono nè protetti nè
suscettibili verso lo sviluppo di HSCR
DUE nuovi approcci per
ricerca nuovi geni HSCR
diagnostica molecolare
Whole Exome Sequencing: ricerca di mutazioni de novo
17
• Hirschsprung segmento lungo
• Prevalentemente femmine
• Casi sporadici
7
12
14
10
12
# de novo mutations
# patients
28 mutazioni de novo in 24 pazienti (1.17 / paziente)
8
6
4
2
0
0
1
2
3
4
5
# de novo mutations
6
7
10
8
6
4
2
0
All
RET
28 mutazioni de novo in 21 diversi geni
Gene
Type
Burden test pvalue
Gene
Type
Burden test pvalue
AFF3
missense
0.796
RBM25
synonymous
0.280
CCR2
missense
0.459
RET
frameshift
0.0001
CKAP2L
frameshift
0.049
RET
frameshift
0.0001
COL6A3
synonymous
0.655
RET
frameshift
0.0001
DAB2IP
missense
0.435
RET
missense
0.0001
DENND3
frameshift
0.971
RET
missense
0.0001
HMCN1
missense
0.163
RET
non-frameshift
0.0001
ISG20L2
missense
0.313
RET
nonsense
0.0001
KDM4A
missense
0.236
RET
splicing
0.0001
MAP4
synonymous
0.852
SCUBE3
Missense
0.559
MED26
synonymous
0.455
TBATA
Missense
0.898
NCLN
nonsense
NA
TUBG1
Synonymous
NA
NUP98
missense
0.874
VEZF1
Missense
0.871
PLEKHG5
synonymous
0.465
ZNF57
Synonymous
0.548
Analisi funzionale in vivo dei geni risultati
portatori di mutazioni de novo
• Pesce-zebra (zebrafish) transgenico per Phox2b-GFP
• Trattamento con agenti bloccanti (morpholinos) ciascun
gene sotto esame
5 dpf
7 geni su 18
mostrano un
fenotipo HSCR
una volta
“knocked-down”
% fishes showing ENS phenotype
(number of fishes analyzed)
* anus
7 nuovi geni risultati rilevanti per lo sviluppo del
sistema nervoso enterico
Gene
Gene name
Function
Mutation type
CKAP2L
Cytoskeleton-Associated Protein
2-Like
Mitotic spindle assembly in Neural
Progenitor cells
Frameshift
DENND3
DENN/MADD domain containing
3
Guanine nucleotide exchange factor
Frameshift
MAP4
Microtubule-Associated Protein
4
Non-neuronal MAP, with neural transcript
Synonymous
MED26
Mediator complex subunit 26
Might be involved in spatiotemporal
regulation of neuronal gene expression
Synonymous
NCLN
Nicalin
May be required for neural patterning
Nonsense
NUP98
Nucleoporin 98 kDa
Binds to neuronal development genes in
Neural Precursor cells
Missense
TBATA
Thymus, brain and testes
associated
Neurite outgrowth and dendrite patterning
in hippocampal neurons
Missense
I 7 nuovi geni non sono parte dei principali
network genici già noti implicati in Hirschsprung
NODAL
DENND3
GDP
GTP
CKAP2L
MAP4
TBATA
NCLN
Ectoderm
RAB12
Mesoderm
Endosomes
ON
Neuronal
genes
MED26
NUP98
Approccio Next
Generation
Sequencing (NGS) al
sequenziamento
massivo del gene RET
Pannello RET per sequenziamento massivo tramite PGM:
CDS, NCDS and genomic RET regions
189 amplimeri
2 pools (145+144)
Mean amplicon size=177
≈ 30Kb -> 100x coverage
≈ 3 Mb/pt
700
600
Coverage
500
400
300
200
Mean Coverage = 163.45X
100
0
Amplimer
HDC
601
(filtro
maf)
HDC
609
(no
filtri)
MTC 55
HSCR 14
CTRL 24
MTC vs CTRL
11 41 67 79 87
151 180 181 189 192
201 212 217 219
240 260
59 125
216 236
233 256
15 58 63 80 96
106 113 137 139 145
146 170 194 197 206
225 254
53 69 159
210 252
70 187
190 193
218 185
27 32 40
235 243
248
4 17 20 33 34
35 38 44 48 50 52
114 130 164 197 232
241
HDC vs CTRL
MTC vs HDC
La natura complessa della genetica dell’HSCR isolato rende
difficile individuare tutti i fattori che contribuiscono alla sua
insorgenza
Mutazioni rare di RET sono causative (con penetranza
incompleta) mentre varianti comuni possono giocare un ruolo
predisponente
Altri geni sono coinvolti, specialmente con varianti di
predisposizione o di dosaggio
La consulenza genetica è da raccomandarsi in ogni caso
Le nuove tecnologie di sequenziamento stanno contribuendo
alla ricomposizione del puzzle di geni coinvolti in HSCR
Chirurgia Pediatrica,
Istituto G Gaslini
Tutte le chirurgie
pediatriche che
hanno segnalato
pazienti affetti da
HSCR e inviato
campioni biologici
Pazienti e le loro
famiglie
A
c
k
n
o
w
l
e
d
g
e
m
e
n
t
s
Tiziana Bachetti
Alice Grossi
Ivana Matera
Marta Rusmini
Francesco Caroli
Marco Di Duca
Andrea Santamaria
Prof Roberto Ravazzolo
UOC Genetica Medica
