CELLULE MESENCHIMALI STAMINALI

CELLULE MESENCHIMALI
STAMINALI
CELLULE STAMINALI
• Indifferenziate
• Capaci di autorigenerarsi ( self-renewal)
• Capaci di differenziarsi in tipi cellulari
specifici
• Capaci di ripopolare un dato tessuto in
vivo
CLASSIFICAZIONE SULLA BASE
DELLE FONTI DELLE CELLULE
STAMINALI
CELLULE STAMINALI
EMBRIONALI
ADULTE
• TOTIPOTENTI: capaci di dar luogo a tipi cellulari
embrionali e non.
• PLURIPOTENTI: capaci di dar luogo a tutti i tipi cellulari
derivati dai tre foglietti embrionali (cellule isolate da un
embrione a sei settimane, le ES, cellule isolate da feto a
termine, da placenta, da sangue cordonale e da tessuti
adulti).
• MULTIPOTENTI: capaci di dar luogo a cellule
appartenenti a diversi lineages (cellule staminali dei
tessuti adulti, hematopoietic stem cells).
• OLIGOPOTENTI: capaci di dar luogo a un ristretto
subset di lineage cellulari (neural stem cells, hair bulge
stem cells).
• UNIPOTENTI: capaci di differenziarsi in un unico tipo
cellulare (spermatogonial stem cells).
CELLULE STAMINALI
ADULTE
Cellule NON DIFFERENZIATE di organi o
tessuti adulti, capaci di
AUTORIGENERARSI e di
DIFFERENZIARSI nei tipi cellulari del
tessuto o organo preso in considerazione.
CELLULE MESENCHIMALI
STAMINALI
Sono conosciute anche come:
•colony forming fibroblastic cells
•stromal fibroblasts
•marrow stromal stem cells
•mesenchymal progenitor cells
Costituiscono una popolazione residente nel midollo osseo
capace di differenziare in cellule del tessuto adiposo,
del tessuto cartilagineo, del tessuto osseo e nello
stroma che supporta l’ematopoiesi.
MSCs e midollo osseo
Le prime evidenze validanti l’esistenza di una popolazione staminale mesenchimale nel midollo
risalgono al 1970. Friedstein mise in coltura campioni di midollo osseo umano e dopo 4 ore
allontanò le cellule non aderenti. Si erano formati piccoli foci di cellule aderenti composti da
3-4 cellule; queste cellule erano dormienti per circa 4 giorni e poi cominciavano a proliferare.
Dopo alcuni passaggi in coltura queste cellule tendevano a diventare più omogenee e dalla
forma affusolata.
1/10000-100000 cellule
nucleate umane
ISOLAMENTO DELLE MSC
DA MIDOLLO OSSEO
UMANO
1. Centrifugazione su gradiente di Ficoll
2. Coltura su piastre di polistirene non rivestite alla densità
di 10000 cell/cm2
3. Rimozione cellule non aderenti
1. Centrifugazione su ficoll
4-5 ml di midollo
in una siringa
eparinata
Cellule nucleate
Piastrine, globuli rossi,
granulociti polimorfonucleati
Cellule nucleate: monocita,
macrofago, cellula endotelilale
adipocita
Globuli rossi
2. Coltura su piastre di polistirene non rivestite alla
densità di 10000 cell/cm2
Dopo 24-48 ore
3. Rimozione cellule non aderenti
Dopo 10-14 giorni
Cellule subconfluenti
Le cellule possono duplicarsi ed essere
espanse per circa 20 passaggi mantenendo
le caratteristiche di multipotenza senza
ridurre il tasso di crescita. Le cellule così
ottenute non hanno proprietà di cellule
immortalizzate e hanno un tempo di
crescita definita.
COME MIGLIORARE
L’ISOLAMENTO DI MSC DA
MIDOLLO OSSEO
Abbinare alla centrifugazione su
gradiente di Ficoll:
• l’isolamento tramite separatore
cellulare attivato a fluorescenza
(fluorescence-activated cell sorter
FACS)
• immunoseparazione tramite colonnina
1
2
3
4
ISOLAMENTO
TRAMITE
SEPARATORE
CELLULARE
ATTIVATO A
FLUORESCENZA
(FACS)
ISOLAMENTO TRAMITE SEPARATORE
CELLULARE ATTIVATO A
FLUORESCENZA (FACS)
1.
Una miscela di cellule viene marcata con
un anticorpo fluorescente
2. Il tubo fotomoltiplicatore rileva la
presenza di una cellula a cui è legato un
anticorpo marcato e il computer la
registra
3. Segnali provenienti dal computer caricano
la gocciolina contenente una singola cellula
marcata in modo da deviarla in un campo
elettrico
4. Le cellule marcate con l’anticorpo possono
essere separate da quelle non marcate
Svantaggi del FACS
Sebbene il FACS sia un potente
strumento di analisi:
• esso esamina solo una cellula per
volta
• non può separare rapidamente ed
economicamente il grande numero di
cellule presente in un campione di
midollo osseo.
IMMUNOSEPARAZIONE
TRAMITE COLONNINA
1.
2.
3.
•
•
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Le cellule di interesse sono incubate con le
biglie marcate con anticorpi contro specifici
antigeni.
Il campione è caricato in una colonnina
posizionata in un separatore magnetico.
Le cellule attaccate alle sfere (marcate)
vengono trattenute mentre le cellule
mancanti dell’antigene di membrana
riconosciuto dall’anticorpo monoclonale
vengono rimosse.
Le cellule legate vengono così selezionate
positivamente per l’espressione dell’antigene,
e possono essere recuperate tramite
trattamenti in grado di spezzare il legame
antigene-anticorpo, come ad esempio il calore
o la forza meccanica.
Le cellule non legate vengono selezionate
negativamente per la sua assenza e vengono
lasciate decantare.
Selezione Negativa
Specifiche popolazioni possono
essere selezionate a partire da
una sospensione cellulare,
eliminando le cellule non
desiderate. Questa strategia è
utile quando
• le cellule di interesse sono molto
rare e a bassa frequenza nel
campione in esame
• le cellule di interesse condividono
l’espressione di alcuni antigeni con
le altre nel campione in esame.
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Esempi di Selezione Negativa
• CD45. Antigene panleucocitario espresso su tutte
le cellule della linea leucocitaria (granulociti,
linfociti, monociti e loro precursori).
• CD235a. Glicoforina espressa su eritrociti e loro
precursori
• Lineage cell depletion. Le cellule sono
magneticamente marcate con un cocktail di
anticorpi contro i cosiddetti antigeni “lineage”,
CD2 (cellule T e NK), CD3 (cellule T), CD11b
(cellule mieloidi), CD14 (monociti e macrofagi),
CD15, CD16 (granulociti) , CD19 (cellule B e
follicolari dendritiche), CD56 (cellule NK), CD123
(granulociti basofili) e CD235a (eritrociti) .
Svantaggi della selezione negativa
A seguito della immunodeplezione le
cellule si espandono molto poco
probabilmente perchè i contatti
cellula- cellula e le citochine rilasciate
dalle popolazioni del midollo sono
essenziali per l’espansione delle MSC.
Selezione Positiva
Specifiche popolazioni possono
essere selezionate a partire da
una sospensione cellulare,
marcandole magneticamente.
Questa strategia è utile quando le
cellule di interesse sono molto rare
e a bassa frequenza nel campione in
esame
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Esempi di Selezione Positiva
• Stro-1. è un antigene espresso sulle MSC primarie, appena isolate
da midollo; la sua espressione si mantiene in vitro in cellule non
indotte a differenziamento. Le cellule positive a Stro-1 si espandono
molto di più rispetto alle cellule isolate con il classico metodo di
aderenza su plastica e rispondono bene ai differenziamenti.
- In questi 14 anni dalla scoperta di STRO1 non c’è stato un grosso
consenso da parte della comunità scientifica poiché molti gruppi non
hanno confermato l’espressione di questo antigene sulle MSC.
- è espresso su cellule positive per glicoforina e CD19
• CD105. Endoglina, funge da recettore per i fattori di crescita e
differenziamento TGF-β1 e TGF-β3. Un epitopo di CD105 è
riconosciuto dall’anticorpo SH2 molto utilizzato per identificare
MSCs che mostrano capacità di differenziamento lungo il lineage
mesodermico.
- E’ espresso anche su cellule endoteliali.
• CD117. c-kit, recettore di SCF (stem cell factor) è una
glicoproteina di superficie con attività tirosin chinasi.
- Circa il 25% delle cellule del midollo osseo CD117+ esprimono i
marcatori ematopoietici CD34 e CD133.
- Questo antigene è espresso su basofili, cellule dendritiche mieloidi,
precursori T, precursori B, precursori K e blasti leucemici.
Esempi di Selezione Positiva II
• CD271 è il recettore a bassa affinità di NGF, nerve growth factor.
Esso è coinvolto nella morfogenesi di alcuni organi (rene) e nelle
risposte apoptotiche in seguito a stimolazione con NGF. LNGFR è
espresso sulle MSC primarie, appena isolate da midollo e la sua
espressione si mantiene in vitro in cellule non indotte a
differenziamento. Le cellule positive a LNGFR si espandono molto di
più rispetto alle cellule isolate con il classico metodo di aderenza su
plastica (differenze di 20-30 volte) e rispondono bene ai
differenziamenti.
- A seguito della selezione molte cellule del midollo osseo CD271+
esprimono i marcatori ematopoietici CD34 e CD133.
• SSEA-4. Stage specific antigen-4 è una glicoproteina
caratterizzata dalla presenza di residui carboidratici tipici dei
glicolipidi. L’espressione di questa proteina è limitata alle cellule del
teratocarcinoma umano e alle cellule embrionali prima dell’impianto
in utero. Sebbene non sia ancora chiaro il ruolo di questa proteina
nelle MSCs e se essa possa essere un marker di staminalità, è
interessante osservare che oltre alle cellule pluripotenti ES e EC
questi antigeni sono espressi anche sulle MSCs. Circa il 2-4% delle
cellule del midollo osseo sono positive a SSEA-4.
SAGGIO DELLE UNITA’ FORMANTI
COLONIE FIBROBLASTICHE (CFU-F)
Un saggio utilizzato per determinare la frequenza di
cellule mesenchimali staminali nel campione di midollo.
Le cellule ottenute dal midollo osseo
vengono piastrate a bassa densità
(3500-8000 cell/cm2) dopo
centrifugazione su gradiente di
Ficoll, espanse come popolazione
aderente e quantizzate contando le
colonie derivate da una singola cellula
aderente.
Le colonie vengono poi espanse
singolarmente, indotte a
differenziamento e soggette ad analisi
citometrica allo scopo di
caratterizzarne la progenie.
CARATTERIZZAZIONE
IMMUNOFENOTIPICA DELLE MSC
Non esistono antigeni specifici per MSC o che associano lo stato della
cellula a uno specifico tratto fenotipico; dunque è impossibile
determinare in una certa coltura cellulare la proporzione tra cellule
staminali, progenitori multipotenti e precursori.
HSC
Hematopoietic stem cells
CD34
MSC
Mesenchymal stem cells
Piuttosto dibattuta è l’espressione di CD34 che viene considerato
un marker ematopoietico. Sebbene non sia espresso sulle hMSC
espanse in coltura è espresso sulle cellule del midollo osseo fresco.
CARATTERIZZAZIONE
IMMUNOFENOTIPICA DELLE MSC
Nome marcatore
Tipo cellulare
Funzione
CD45
Leucociti
Non espresso sulle MSC.
Proteina di superficie dei
progenitori dei leucociti.
Glicoforina
Eritrociti
Non espresso sulle MSC.
CD14
Monociti e macrofagi
Non espresso sulle MSC.
Recettore del lipopolisaccaride
CD50
Cellule staminali
ematopoietiche (HSC)
Non espresso sulle MSC.
ICAM 3
CD34
HSC, cellule satelliti,
progenitori endoteliali
Non espresso sulle MSC.
Sialomucina
CD44
Cellule mesenchimali
Molecola di adesione e recettore
dell’acido ialuronico e
dell’osteopontina
ScaI
HSC, MSC
Stem cell antigen
CD29
MSC
VLA-β chain
CARATTERIZZAZIONE
IMMUNOFENOTIPICA DELLE MSC
Nome marcatore
Tipo cellulare
Funzione
CD49 α1-6
MSC
VLA –α chain
CD106
MSC
VCAM1
CD117
HSC, MSC
cKit, stem cell factor receptor
CD90
HSC, MSC
Thy1, proteina di superficie
CD71
MSC
Recettore transferrina
CD271
MSC
Recettore NGF (nerve growth
factor)
CD140a
MSC
Recettore PDGF (Platelet derived
growth factor)
CD105
MSC, cellule endoteliali
Endoglina
IL SISTEMA MESENCHIMALE
Adattato da Falconi Stem Cells 2007
IL SISTEMA MESENCHIMALE
Dennis J.E. Origin and differentiation of human and murine stroma. (2002) Stem
Cells; 20:205-214
Differenziamento osteogenico
Il differenziamento delle MSCs in osteoblasti non è sorprendente; il
midollo osseo è contenuto all’interno del canale diafisario delle ossa lunghe
dove la struttura dell’osso è estremamente simile a quella dell’osso
spugnoso che si rimodella continuamente, perciò non sorprende che
campioni di midollo prelevati dall’osso possano contenere precursori di
osteoblasti.
Acido ascorbico
Desametasone
Β Glicerofosfato
MSCs
Osteoblasti
Differenziamento osteogenico
• Acido ascorbico (vitamina C): funziona come cofattore nella
idrossilazione dei residui di prolina e lisina nelle molecule di
collageno, promuovendo la formazione della matrice extracellulare, la
maturazione e la deposizione di tutti i tipi di collagene; induce
l’attività della fosfatasi alcalina della membrana plasmatica degli
osteoprogenitori.
• Β glicerofosfato: I fosfati organici promuovono la mineralizzazione
dal momento che il fosfato viene incorporato nei cristalli di
idrossiapatite della matrice.
• Desametasone: promuove il differenziamento poichè è un agonista
dei glucocorticoidi; esso agisce sui promotori responsivi dei fattori di
trascrizione necessari per il committment delle MSCs nel lineage
osteogenico; promuove la calcificazione in vitro.
Differenziamento adipogenico
La capacità delle MSCs di differenziare in adipociti può essere
associata all’osservazione che il midollo viene in parte sostituito con
l’adipe durante la vecchiaia.
Insulina
Desametasone
3-isobutil metilxantina
MSCs
Adipociti
Differenziamento adipogenico
• Insulina: Promuove il differenziamento poichè attiva
l’espressione di fattori di trascrizione necessari per il
committment delle MSCs nel lineage adipogenico;
aumenta la percentuale di cellule che si differenziano e
l’accumulo di lipidi nelle cellule.
• Desametasone: promuove il differenziamento poiché è un
agonista dei glucocorticoidi capace di agire su promotori
responsivi dei fattori di trascrizione necessari per il
committment delle MSCs nel lineage adipogenico.
• IBMX: è un inibitore non specifico delle fosfodiesterasi
del cAMP e del cGMP. Il cAMP attiva la fosfochinasi PKA
coinvolta in fenomeni di proliferazione, differenziamento
e apoptosi.
Differenziamento condrogenico
La capacità delle MSC di differenziare in condrociti può
essere associata al processo di riparo di una frattura,
poiché la cartilagine appare nei siti di frattura prima che il
callo venga sostituito da osso.
Acido ascorbico
Insulina
hTGFβ1
Poli- lisina
MSCs
Condrociti
Differenziamento condrogenico
Affinché le cellule possano differenziarsi in condrociti esse devono
essere messe in condizioni colturali che mimino la condensazione
cellulare che avviene in vivo.
- Piastrare le cellule ad alta densità come micro-goccia su piastra
- Far sedimentare le cellule nel fondo conico di una provetta.
• TGF-b1 è un fattore di crescita coinvolto nella regolazione della
proliferazione cellulare e nel differenziamento ed è importante per
la formazione di osso e cartilagine.
• Acido ascorbico (vitamina C): funziona come cofattore nella
idrossilazione dei residui di prolina e lisina nelle molecule di
collageno, promuovendo la formazione della matrice extracellulare, la
maturazione e la deposizione di tutti i tipi di collagene.
• Insulina: Promuove il differenziamento poichè attiva l’espressione di
fattori di trascrizione necessari per il committment delle MSCs nel
lineage condrogenico.
• Poli lisina è una molecola poli-cationica che promuove l’interazione tra
le cellule.
Differenziamento
• Differenziamento
Adipogenico (colorazione
citochimica Oil Red O)
• Differenziamento
Condrogenico
(immunocitochimica
Collagene II)
• Differenziamento
osteogenico (colorazione
citochimica fosfatasi
alcalina)
Pittenger M.F. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells.
1999 Science 284:143-147
LA POPOLAZIONE ISOLATA IN QUESTO
MODO E’ FORMATA DA UN PRECURSORE
UNICO O SOLTANTO DAI PROGENITORI
COMMITTED?
Su 6 colonie ottenute da Pittenger et al. nel 1999
- 6/6 si differenziano in senso osteogenico
- 5/6 subiscono il differenziamento adipogenico
- 2/6 quello condrogenico.
• la popolazione isolata è mista cioé
composta da una popolazione clonale
staminale multipotente e da progenitori
committed che perdono la potenzialità di
seguire un certo lineage e mantengono
esclusivamente una potenzialità
• il protocollo di isolamento utilizzato o il
numero di espansioni ha causato la perdita
di quella capacità multipotenziale
originariamente presente nelle cellule
La popolazione
isolata in questo
modo è una
popolazione
clonale e
multipotente
FUNZIONI DELLE MSC
• supportare l’ematopoiesi
• attrarre le HSC (hematopoietic stem
cells) circolanti nel midollo (homing)
• immunosoppressione
FUNZIONI DELLE MSC:
supportare l’ematopoiesi
Le MSC supportano l’ematopoiesi
• attraverso interazioni cellulacellula. Le HSC esprimono
diversi recettori coinvolti
nell’adesione delle cellule alla
matrice extracellulare (i
recettori della famiglia delle
integrine, CD40, CD34 e CD43)
• attraverso la produzione di
fattori di crescita (IL-6, IL7,
IL8, IL11, IL12, IL-14, IL15,
LIF, M-CSF, SCF)
Eckfeldt C.E. 2005.
“The molecular repertoire of almighty stem cells”. Nature review Mol cell biol 6:
726-737
FUNZIONI DELLE MSC:
attrarre le HSC nel midollo (homing)
L’homing è il reclutamento delle HSCs circolanti nel midollo osseo.
Questo processo si verifica
• attraverso l’interazione cellula –cellula. Le HSC esprimono diversi
recettori coinvolti nell’extravasazione (i recettori della famiglia delle
integrine).
• attraverso la produzione di fattori di crescita tra cui CXCL12, anche
noto come SDF, stromal derived factor 1.
FUNZIONI DELLE MSC:
effetto immunosoppressivo
Le MSC hanno un ruolo importante nella
maturazione dei linfociti T, B e NK e
delle cellule dendritiche. Esse infatti
inducono
• l’arresto della divisione mitotica in
Go-G1 e inibiscono l’espressione della
ciclica D2.
• Alterano la secrezione delle
citochine nelle cellule T e il loro
effetto citotossico.
L’effetto immunosoppressivo delle
MSCs sui linfociti T è ottenuto tramite
• interazione cellula-cellula.
L’interazione tra cellule T e MSC
avverrebbe tramite alcune molecole
espresse dalle MSC tra cui CD44 e
CD117.
• fattori solubili. TGFb1, HGF, NO,
PGE2.
FUNZIONI DELLE MSC:
santuario immunologico?
• Le MSC esprimono MHC I a bassi livelli ma non esprimono le
molecole MHC II né CD80 o CD86 che sono indispensabili per la
stimolazione delle cellule T.
• Le MSCs hanno un effetto immunosoppressivo sulle cellule T
tramite interazione cellula-cellula (CD 44 e CD117, espressi
anche sulle cellule epiteliali del timo) e tramite la produzione di
specifiche citochine (TGFb1 e HGF).
Le MSCs sono cellule immuno-privilegiate?
TERAPIE CLINICHE BASATE
SU MSCs
• Strategie di ingegneria tissutale
• Terapia cellulare di “sostituzione”
• Pompe di citochine e fattori di
crescita
STRATEGIE DI INGEGNERIA
TISSUTALE
Un esempio di ingegneria
tissutale è costituito dall’uso
delle MSC nella riparazione di
difetti ossei.
La procedura prevede il
caricamento delle MSCs su
scaffold opportuni, cioè in grado
di fornire uno stimolo osteogenico
alle MSCs e un ambiente
favorevole al differenziamento di
queste cellule in osteoblasti.
Bianco P. (2001) Stem cells in tissue engineering. Nature 414: 118-121
TERAPIA CELLULARE DI
SOSTITUZIONE
Esempio: terapia dell’
OSTEOGENESI
IMPERFETTA
Caplan A.I. “Mesenchymal stem cells: cell- based reconstructive therapy in
orthopedics.” 2005. Tissue Engineering 11:1198-1211
POMPE DI CITOCHINE E
FATTORI DI CRESCITA
• Le MSC secernono molecole
che stimolano l’angiogenesi
e riducono i processi di
fibrosi e cicatrizzazione.
Questi effetti sono
responsabili del ruolo
terapeutico di queste
cellule nell’infarto del
miocardio o nell’ictus
celebrale
FONTI DI CELLULE MESENCHIMALI
STAMINALI
Agoaspirato midollare
Sangue cordonale
placenta
Tessuto adiposo
Sangue periferico
ISOLAMENTO DELLE MSC
Le MSC del tessuto adiposo (ADMSC) hanno lo stesso
potenziale differenziativo delle MSC del midollo osseo,
vale a dire che possono differenziarsi in adipociti,
osteoblasti e condrociti.
Non stupisce che questo tessuto offra le stesse
possibilità del midollo osseo dal momento che il midollo
osseo e l tessuto adiposo hanno la stessa origine
ontogenica, il mesoderma.
Tessuto adiposo
Sangue periferico
La possibilità di isolare MSC dal sangue periferico
(PB-MSC) è ancora molto dibattuta.
La frequenza delle MSCs nel sangue è molto bassa,
tuttavia, sotto la stimolazione di citochine, ormoni e
fattori di crescita, che vengono secreti nel sangue in
diverse condizioni patologiche, il numero di queste
cellule aumenta.
Non è chiaro la loro origine né la loro funzione in vivo;
è noto che le MSC possono ritornare dagli organi
periferici al midollo ma non è chiaro se possano
persistere nel sangue e costituire una popolazione
staminale residente.
ISOLAMENTO DELLE MSC
Sangue cordonale
placenta
Queste cellule (UCB-MSC) sono una fonte molto
vantaggiosa di cellule staminali per diversi motivi:
•
sono piuttosto abbondanti
•
mancando degli antigeni MHC II non
producono risposta immunitaria e rigetto
•
Possono essere congelate in banche cellulari
Tuttavia la presenza di MSC nel sangue cordonale
è inversamente proporzionale allo stadio
fetale e ciò significa che il numero di MSC nel
cordone di un feto a termine è piuttosto
esiguo.
Sono numerosi i tentativi di isolare cellule staminali
dalla placenta al fine di
•
ottenere una fonte più accessibile di MSC
rispetto a midollo osseo e tessuto adiposo
•
ottenere una fonte in cui la frequenza delle
MSCs non sia esigua come nel sangue periferico o
cordonale.
BIBLIOGRAFIA
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potential clinical uses” 2000. Experimenal hematology 28:
875-844
• Caplan A.I. “Mesenchymal stem cells: cell- based
reconstructive therapy in orthopedics.” 2005. Tissue
Engineering 11:1198-1211
• Pittenger M.F. Multilineage Potential of Adult Human
Mesenchymal Stem Cells. 1999 Science 284:143-147
• Eckfeldt C.E. 2005. “The molecular repertoire of almighty
stem cells”. Nature review Mol cell biol 6: 726-737
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niches”. 2006 Nature Reviews Immunology 6: 93-106
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precursors in Human Bone Marrow by a Novel Monoclonal
Antibody, Stro-1. Blood 78: 55-62
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cells from bone marrow. Blood 109: 1743-1751
• Dennis J.E. Origin and differentiation of human and
murine stroma. (2002) Stem Cells; 20:205-214
• Uccelli A. (2007) Mesenchymal stem cells: a new strategy
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• Bianco P. (2001) Stem cells in tissue engineering. Nature
414: 118-121
• Schaffler A., (2007). Concise review: Adipose tissue
derived stromal cells. Basic and clinical implications for
novel cell based therapies. Stem Cells 25:818-827
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mesenchymal stromal cells in blood. Stem Cells
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