Virus oncogeni
La trasformazione cellulare da virus si accompagna ad
una infezione persistente/latente (non controllata dal
sistema immune) con espressione solo di alcuni geni
precoci del genoma virale che rimane nella cellula
(integrato o episomiale)
Virus a DNA
Herpes virus (EBV, HHV-8)
Papovavirus (HPV, BKV, JCV, SV40)
Hepadnavirus (HBV)
Adenovirus
Poxvirus (virus mollusco contagioso –neoformazioni
benigne)
Virus a RNA
Flavivirus (HCV)
Retrovirus (HTLV-I e – II)
Caratteristiche della particella virale di HPV
(Human Papilloma Virus)
•NO envelope
•Icosaedrico
•52-55 nm di diametro
•dsDNA circolare 8Kb
•Capside a 72 capsomeri composti dalle proteine L1
(55 KDa) e L2 (70 KDa)
Papillomavirus
HPV
E6
LCR
AL
L1
P97
7904/1
7000
6000
1000
HPV-16
E1
2000
3000
5000
4000
L2
E7
AE
E5
E4
E2
HPV ha tropismo specifico per le cellule degli epiteli squamosi cheratinizzati e non
La replicazione è associata allo stadio differenziativo della cellula
Replicazione HPV
Replicazione di HPV
Fibropapilloma -Ibridazione in situ
Controllo
negativo
L1
Barksdale et al, J. Virol. 1993
HPV
E5
Principali funzioni delle proteine di HPV
Lesioni associate all’infezione da HPV
HPV causa lesioni epiteliali benigne caratterizzate da
intensa proliferazione delle cellule basali e,
conseguentemente, da un ispessimento locale dell’epitelio
(DNA episomiale)
HPV è associato con lo sviluppo di lesioni displastiche
pre-neoplastiche e carcinomi a livello ano-genitale,
ma anche nella cavità orale e vie respiratorie
(DNA integrato)
Tipo di lesioni
Genotipi di HPV
Lesioni cutanee
•Verruche volgari, piane e palmari
•Verruche in soggetti con EV
•Carcinomi cutanei in soggetti con EV
(in rari soggetti geneticamente predisposti)
1,2,3,4,7,10,27,28,29,40
5,8,9,12,14,15,17,19,20,47,49
5,8,14,17,20,47
Lesioni mucose
•Condilomi acuminati
•Papulosi Bowenoide
•Condiloma gigante
•Papillomi delle vie respiratorie
•Papillomi congiuntivali
•Lesioni della mucosa orale
iperplasia focale epiteliale
infezione con HPV del tratto genitale
lesioni sulle labbra
•Carcinoma della cervice uterina
alta associazione
moderata associazione
scarsa associazione
•Cancro vulvare
6,11, 42,43, 44, 54,55
16
6,11
6,11
6,11
13,32
6,11,16
2
16,18,45, 56
31,33,35,51,52
6,11,42,43,44
16
Verruca piana
Condilomi acuminati
Una risposta immune efficiente è importante per la risoluzione
dell’infezione da HPV (tessuto linfoide associato alla cute e
mucose)
Le malattie associate ad HPV sono frequenti e severe in
pazienti con immunodeficienze primarie e secondarie, con
disordini linfoproliferativi e AIDS
Infiltrati linfo-monocitici sono presenti nelle lesioni in
guarigione e i linfociti T infiltranti proliferano in risposta a
E7 e L1
La regressione di una lesione è generalmente seguita dalla
regressione delle altre
HPV e tumori
Nel 85-90% di tutti i tumori della cervice uterina è presente DNA
di uno dei genotipi di HPV a medio-alto rischio
e in circa il 70% è presente il genotipo 16 o 18
HPV a medio-alto rischio è presente nelle lesioni pre-cancerose
e nelle lesioni neoplastiche intraepiteliali (CIN).
mRNA di HPV è espresso nelle lesioni tumorali
Evidenze sierologiche indicano una prevalenza di anticorpi antiHPV-16 e –18 nei pazienti con tumore cervicale rispetto ai
controlli
Evidenze simili esistono per l’associazione di HPV e alcuni
tumori a cellule squamose vaginali, vulvari, penili e anali
Carcinomi della cervice uterina
Lesione intra-epiteliale squamosa della cervice (Lowgrade)
H&E
IP
HPV capsid
H&E
IP
HPV capsid
Prevalenza delle infezione genitali da HPV e di malattie
associate ad HPV in donne (USA)
Il carcinoma cervicale correla con il numero di partners
sessuali
Associazione di HPV con la progressione del carcinoma cervicale
HPV-6,11,42,43,44
HPV-31,33,35,51,52
HPV-16,18,45,56
LSIL, low-grade squamous intraepithelial lesion
HSIL, high-grade squamous intraepithelial lesion
• HPV ALTO RISCHIO:
16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/66/68
• HPV BASSO RISCHIO:
6/11/40/42/43/44/54/61/72
Oncoproteine di HPV
Nelle lesioni maligne il DNA di HPV è integrato a
livello del gene E2
L’interruzione di E2 potrebbe svolgere un ruolo nella
patogenesi neoplastica in quanto normalmente
“down-regola” espressione di E6 e E7
Le proteine E5, E6, E7 di HPV
inducono la proliferazione cellulare
(immortalizzazione)
e favoriscono la probabilità di trasformazione
neoplastica
delle cellule infettate
Funzioni di E6 (HPV alto rischio)
Immortalizzazione cellulare
Degradazione p53
Inibizione apoptosi
Destabilizzazione cromosomica
Attivazione telomerasi
Blocco funzioni interferone (?)
Bersagli cellulari di HPV E6
Radiazioni UV
HPV E6
Agenti citotossici
Mutageni
Inattiva p53
virus
Danno del DNA
+
mdm2
HPV E6
p53
-
(altorischio)
+
Apoptosi
bcl-2
+
p16
cdk 2,
4,5,6
p18
cdk 2
PCNA
DNA polymerase d
G1
p21
S
Cyclins D1,
D2, D3
PCNA
p21
p21
Cyclin E
bax
p15
p21
-
p21
Cyclin A
M
G2
cdk 2
HPV E6 induce la
degradazione di p53
Ub
AMP
ATP
E2
E1Ub
E1
E2Ub
p53
E3
p53
E6
AP
p53
E6
AP
p53
PROTEASOMA
E6
AP
E3
E6
Funzioni di E7 (HPV alto rischio)
Immortalizzazione cellulare
Inattivazione Rb
Attivazione cycline E e A
Induzione apoptosi
Inhibizione degli inibitori delle kinasi ciclinodipendenti
Degradazione di tirosin-chinasi Blk (?)
Bersagli cellulari di HPV E7
HPV E7
inattiva Rb
E7
E7
+
pRB
E2F-1
E2F-1
Repressione
trascrizionale
E2F-1
Attivazione
trascrizionale
G1
PPasi
ppRB
Complesso inattivo
pRB
cdk
M
S
inattiva
ppRB
inattiva
G2
ppRB
inattiva
HPV E7 e ciclo cellulare
Rb
Cyclin A-cdk 1
Cyclins D, D2, D3
cdks 2,4,5,6
HPV E7
high-risk
p53
PCNA
M
E2F
Rb
G1
Cyclin E-cdk 2
Cyclin B-cdk 1
Cyclin-cdk
G2
Rb
Cyclin A-cdk 1
HPV E7 ?
S
pRb
Cyclin E-cdk 2
Cyclin H-cdk 7
Cyclin A-cdk 2
HPV E7 ?
P
p21
p15, p16
p18, p27
+
E2F
Trascrizione
HPV E5
si inserisce nella membrana
cellulare
e attiva il recettore PDGF in
assenza del ligando specifico
innescando segnali di
proliferazione cellulare
The major differences between high-risk HPV E6 and E7 proteins
and their low-risk counterparts are their abilities to bind to
the tumor suppressor proteins p53 and Rb. A number of
additional interactions have been reported for the high-risk E6
and E7 proteins. The functions of E6 and E7, independent of
their abilities to inactivate p53 and Rb that are required for
stable episomal maintenance, remain to be determined. The
observation that HPV31 genomes containing E6 mutations
unable to degrade p53 and an E7 mutation with reduced Rb
binding provides a model to explore the activities of E6 and E7
necessary for genome replication that are shared among all
HPVs. Because the complete viral replication program requires
a differentiated environment, it will be interesting to conduct
future experiments using organotypic models to further analyze
the balance between E6 and E7 functions permissive for viral
DNA replication in differentiating keratinocytes.
Conclusions
The molecular pathogenesis of cancer caused by highrisk HPV infections is presently not fully understood
However, high-risk HPVs are self-sufficient to induce
malignant conversion
Induction of chromosomal instability, mutations, and
aneuploidy in noncommitted proliferating cells plays a
major role in tumorigenesis
Interruption of two independent signaling cascades, i.e.,
TP53 and RB, is responsible for cellular immortalization
and invasive phemotype
Vaccino
• Profilassi delle infezioni
• VLP ottenute a partire da VP1
• Merck (tetravalente HPV 6, 11, 16, 18):
GARDASIL
• GSK (bivalente HPV16, 18): CERVARIX
Fattori mutageni
Derivati estrogeni
HPV (alto rischio) e Patogenesi
carcinoma cervicale
Instabilità genomica
Aumentata
espressione e
replicazione DNA
virale
Infezione
Persistenza
per aumentata
espressione dei geni
virali
Modificazioni di
geni cellulari
Integrazione
Mutazioni geni
cellulari
genoma virale
DNA virale
subclinica
Lesione
intraepiteliale
squamosa
(low-grade)
Lesione
intraepiteliale
squamosa
(high grade)
Carcinoma
invasivo
metastasi
Gardasil (MERK)
•
Gardasil è un vaccino quadrivalente ricombinante non infettante
preparato da particelle simili al virus ( VLPs ) dalla proteina capsidica
maggiore L1 del papillomavirus umano ( HPV ) tipi 6, 11, 16 e 18
altamente purificate.
Le VLPs non contengono DNA virale, non possono infettare le cellule,
riprodursi o causare malattia.
L’HPV infetta soltanto l’uomo, ma gli studi sugli animali con
papillomavirus analoghi suggeriscono che l’efficacia dei vaccini L1 VLP
sia mediata dallo sviluppo di una risposta immune di tipo umorale.
•
Indicazioni terapeutiche - Gardasil è un vaccino per la prevenzione
della displasia di alto grado del collo dell’utero ( CIN 2/3 ), del
carcinoma del collo dell’utero, delle lesioni displastiche di alto grado
della vulva ( VIN 2/3 ) e delle lesioni genitali esterne ( condilomi
acuminati ) causate dal Papillomavirus Umano ( HPV ) tipi 6, 11, 16 e
18.
L’indicazione è basata sulla dimostrazione di efficacia di Gardasil in
donne adulte di età compresa tra 16 e 26 anni e sulla dimostrazione
dell’immunogenicità di Gardasil in bambini ed adolescenti di età
compresa tra 9 e 15 anni.
L’efficacia protettiva non è stata valutata nei maschi.
•
Approvato da EMEA/FDA
Cervarix (Glaxo Smith Kline)
• Cervarix è un vaccino bivalente contenente
proteine L1 purificate per due tipi del
papillomavirus umano ( HPV, tipo 16 e 18 ).
• Cervarix trova indicazione nella protezione
contro la neoplasia intraepiteliale cervicale di
alto grado ( detta CIN, una abnorme crescita
cellulare precancerosa all’interno della
cervice uterina ) ed il cancro cervicale ( detto
anche, tumore del collo dell’utero ), causati
dall’HPV, sierotipo 16 e 18.
• Approvato da EMEA, non ancora da FDA
Diagnosi di Laboratorio di “Human
Papilloma Virus” (HPV)
Campioni clinici HPV
•Frammento bioptico incluso in paraffina
•Tampone regione ano/genitale
•Tampone cervicale
•Tampone altro tipo
Diagnosi di infezione da HPV
•Esame Clinico e colposcopia
•Esame citologico ed istologico
•Immunocitochimica
•Microscopia elettronica
•Sierologia
•Ricerca acidi nucleici
Ibridazione diretta del DNA virale con sonde
specifiche
•Southern Blot
•Ibridazione in situ (ISH)
•Ibridazione in soluzione
Amplificazione di sequenze target del
genoma virale
•PCR
•Sequenziamento
Southern blot
•Tecnica laboriosa: Estrazione DNA, purificazione, taglio
con enzimi restrizione, elettroforesi, trasferimento su
filtro, denaturazione, ibridazione, rilevazione con
SONDE marcate.
•Standardizzazione
difficile: necessita
personale qualificato
e strutture idonee.
•Alta sensibiltà con
sonde radioattive.
Ibridazione in situ (ISH)
•Rivelazione di sequenze specifiche di acidi nucleici
(DNA e/o RNA) in cellule e tessuti (morfologicamente
conservati) mediante l’impiego di sonde geniche
marcate con traccianti di diversa natura.
•Tecnica efficace e di rapida esecuzione ma limitata
nell’utilizzo a causa della bassa sensibilità rispetto alle
tecniche che utilizzano metodi di amplificazione del
segnale o del DNA target.
•Kit commerciali per diagnostica routinaria di HPV.
INFORM® HPV test
Metodica di ISH che permette di discriminare HPV
ad alto/basso rischio con sonde specifiche mediante
reazione colorimetrica o lettura in fluorescenza
direttamente su vetrino di preparazione istologica o
citologica.
INFORM® HPV test
Vantaggi: sistema automatizzato, permette di associare
direttamente la rilevazione del virus con i cambiamenti
nella morfologia di cellule e tessuti, contribuendo a
fornire un’immagine chiara della patologia in atto.
Limiti: sensibilità inferiore rispetto alle metodiche di
amplificazione del target o del segnale.
Non permette una genotipizzazione virale, ma discerne
solamente tra HPV ad alto/basso rischio.
Richiede personale qualificato nella preparazione del
campione.
Ibridazione in soluzione
•Test in vitro che rileva la presenza di acidi nucleici virali
grazie al legame diretto di una sonda a singolo
filamento.
•Riconoscimento dell’ibrido genoma virale-sonda da
parte di numerosi anticorpi specifici marcati, in grado di
dare un segnale amplificato rilevabile da parte di
appositi strumenti senza che sia necessaria
un’amplificazione di sequenze.
Digene HC2 Hybrid Capture® System
2
1
Estrazione DNA virale
3
Legame DNA con sonda a
RNA specifica
4
Legame di DNA-RNA con Ac
coniugati a fosfatasi alcalina
Legame DNA-RNA sonda a
fase solida mediante Ac
5
Emissione di luce misurata con luminometro
in Unità di Luce Relativa (RLU)
Digene HC2 Hybrid Capture® System
Vantaggi: Test di elevata sensibilità (1 pg target/ml),
veloce esecuzione, minimi rischi di contaminazione
dovuti ad assenza di amplificazione del segnale,
altamente standardizzabile, unico test per rilevazione di
HPV approvato dalla Food and Drug Administration.
Limiti: Identificazione solo di HPV ad alto/basso rischio,
NO genotipizzazione, possibili falsi positivi per crossreazione, costi più elevati rispetto ad equivalenti
metodiche PCR.
Amplificazione del Target
PCR
PCR con ibridazione di sonda
PCR-RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism)
PCR Quantitativa
Sequenziamento
PCR
PCR standard: utilizzo di primer universali in grado di
amplificare sequenze conservate all’interno del genoma
di HPV (L1) oppure di oligonucleotidi specifici per la
rivelazione di un particolare tipo virale (E6/E7).
Vantaggi: rapida, economica, molto sensibile
Svantaggi: non approvata FDA, personale esperto,
possibilità di contaminazioni.
PCR nested: prima amplificazione con primer
consensus, seconda con primer complementari alla
sequenza target amplificata.
Vantaggi: altamente sensibile
Svantaggi: laboriosa, rischio contaminazioni più elevato
PCR
PCR con ibridazione di sonda
Ibridazione su filtro con sonda marcata di frammenti
amplificati mediante PCR standard con primer
consensus.
Vantaggi: Altissima sensibiltà anche in presenza di
bassa carica virale
Svantaggi: Laboriosa, necessità di strutture idonee, non
discrimina tra i diversi genotipi.
PCR-RFLP
•PCR standard seguita da digestione del prodotto
amplificato tramite enzimi di restrizione.
•Primers consensus costruiti su regioni conservate che
amplifichino un frammento contenente porzioni variabili
del genoma virale.
Vantaggi: economica, molto sensibile, permette una
tipizzazione di diversi tipi virali a rischio.
Svantaggi: più laboriosa di una PCR standard, necessita
di personale esperto nell’interpretazione dei profili
elettroforetici, possibili contaminazioni.
PCR-RFLP
PCR QUANTITATIVA (Taq Man)
Quantificazione della
carica virale mediante
analisi di fluorescenza
emessa da sonde
marcate.
Vantaggi: Altissima sensibilità (limite teorico di 1 copia di genoma
virale), alta specificità, non necessita di corsa elettroforetica,
basso rischio contaminazione, rapida esecuzione; diversi lavori
sperimentali riconoscono ruolo della carica virale nella
patogenesi.
Svantaggi: Metodica non ancora standardizzata nella routine
diagnostica di HPV, costi elevati, necessita di personale esperto
nella messa a punto e nella validazione dei risultati.
SEQUENZIAMENTO
Metodica di riferimento per il riconoscimento e la
genotipizzazione di acidi nucleici virali.
L’identificazione avviene mediante la comparazione
della sequenza ottenuta con quelle presenti in database
pubblici e/o privati.
Vantaggi: Massima specificità e sensibilità nella
diagnosi, possibilità di genotipizzazione e
riconoscimento di tipi virali a rischio particolarmente
elevato e identificazione di nuovi tipi.
Svantaggi: Costi elevati, metodica laboriosa, personale
esperto nell’interpretazione dei cromatogrammi
SEQUENZIAMENTO
HPV DNA testing
Approaches
Advantage
Disadvantage
Suthern blot
high sensitivity
time-consuming
Dot blot
high sensitivity
old fashioned
(radioactive probes)
Hybrid capture
high sensitivity
low specificity
DNA assay (HC I)
(non radioactive probes)
use of tubes
Hybrid capture
detects 18 HPV types
low specificity
DNA assay (HC II)
(microtiter plates)
(better than HC I)
In situ hybridization
practical to use
low sensitivity
(non radioactive probes)
PCR
high specificity and
high risk of
sensitivity
sample contamination
