Patologia Generale – Prof.ssa Barbara Batetta – Lezione n.7 – 16 ottobre 2012 – Giuliano Figus Le parti in corsivo tra parantesi quadre sono estratte dal Robbins. L'APOPTOSI L'apoptosi è un meccanismo molto importante. Come è stato visto in Immunologia, una risposta immunitaria prevede una proliferazione cellulare linfocitaria; una volta che la risposta è esaurita e l'agente patogeno è stato eliminato o allontanato, si prosegue con l'apoptosi dei Linfociti. Se il meccanismo apoptotico non avvenisse, si verificherebbe il rischio di Leucemia ogni qual volta vengono prodotti dei Linfociti per rispondere a degli agenti batterici o virali. Breve confronto da Apoptosi e Necrosi. Si è visto precedentemente in cosa consiste la necrosi. Brevemente: la cellula si rigonfia e degli enzimi agiscono a livello di tutti gli organuli e della membrana plasmatica. Se quest'ultima si rompe si ha l'immissione in circolo di enzimi e proteine cellulari che causano una risposta infiammatoria. Nella necrosi la cellula si gonfia a causa dell'interruzione dell'attività delle pompe ioniche, con conseguente ingresso di acqua e sodio. La cellula, che invece sta andando in apoptosi, si raggrinzisce. La membrana cellulare circonda dei piccoli organuli che prendono il nome di corpi apoptotici. I macrofagi normalmente presenti nel tessuto circostante, attraverso il meccanismo di fagocitosi, li inglobano e li degradano. Il tutto avviene molto discretamente e molto diversamente rispetto alla necrosi. Fenomeni che avvengono durante l'apoptosi sono la diminuzione delle dimensioni cellulari, la condensazione della cromatina, la formazioni di estroflessioni citoplasmatiche e dunque la formazione dei corpi apoptotici che andranno in contro a fagocitosi. Sebbene la membrana sia integra, il macrofago è in grado di riconoscere questi corpi come estranei. In essa vengono espressi del fosfolipidi come la fosfatidilserina, che solitamente si trovano posizionati sul versante interno del plasmalemma. Il macrofago riconosce questa anomalia, attiva i suoi sistemi di riconoscimento e porta avanti la fagocitosi. La differenza tra cellula normale e corpo apoptotico si può valutare anche perché quest'ultimo ha un'elevatissima affinità di legame con l'annessina V che lega questi fosfolipidi. [Permette una tecnica di colorazione che consente di individuare la presenza di cellule apoptotiche in un tessuto.] L'apoptosi non è un fenomeno veloce. Prima che la cellula muoia, prima che venga messo in atto il meccanismo di morte definitiva ci devono essere tutta una serie di motivi validi. Con ''programmata'' si intende il fatto che ogni qual volta la cellula presenta un danno eccessivo o per altri motivi che inducono l'apoptosi, vengono attivati una serie di geni e proteine che avviano il processo. Se sulla cellula incidono delle radiazioni che non la danneggiano abbastanza da provocarne la morte immediata, ma tuttavia sono sufficienti a danneggiare il DNA in maniera potenzialmente pericolosa, il processo apoptotico viene attivato. Tuttavia nella cellula sono presenti numerose molecole che favoriscono l'apoptosi e altrettante che la limitano. L'apoptosi o la sopravvivenza della cellula è dunque il risultato di un'attenta valutazione (a meno che non ci siano mutazioni o altre situazioni genetiche, la cellula non va in apoptosi senza un motivo). Questo fenomeno si può dunque definire come una cascata di eventi molecolari (cascata proteolitica) che è energia-dipendente e che viene scatenata da stimoli specifici. Nonostante lo stimolo di inizio dell'apoptosi, è possibile entro un certo tempo tornare indietro: è il cosiddetto ''Periodo del controllo''. Successivamente si presenta la ''Fase effettrice'': quando il danno cellulare è eccessivo e la sopravvivenza cellulare è pericolosa viene attivata tutta una serie di enzimi che porterà alla trasformazione fenotipica della cellula. Caspasi. Le caspasi sono degli importanti enzimi coinvolti nell'apoptosi. Essi sono presenti nel citoplasma, sebbene, come altre molecole enzimatiche potenzialmente pericolose, vi si ritrovano allo stato inattivo come zimogeni. Sono dunque pronte ad essere attivate senza che ci sia il bisogno di sintetizzarle, quando la situazione nella cellula diventa pericolosa. Le caspasi sono in grado di scindere/idrolizzare almeno un centinaio di proteine. Sono infatti delle Cistein-proteasi con due proprietà catalitiche: nel sito attivo è presente una C-Caspasi, mentre il sito di legame residuo è di Acido Aspartico ed è quello che subisce il taglio proteolitico. [La ''c'' sta per cistein-proteasi ovvero proteasi con cisteina nel loro sito attivo, mentre ''aspasi'' rimanda alla loro peculiare capacità di tagliare residui di Acido Aspartico a posteriori]. Le Caspasi sono circa 10. Le vie attraverso le quali possono agire sono due: la via estrinseca e la via intrinseca. [Le Caspasi sono divise in Caspasi iniziatrici tra cui la 8 e la 9 e le Caspasi effetrici tra cui le 3 e la 6] Via estrinseca. La via estrinseca prende il via da dei recettori di membrana. I principali sono due: il Fas e il recettore per il TNFα [Recettore per il TNF di tipo 1 o TNFR1]. Il Fas è un recettore presente in molti tipi cellulari e viene riconosciuto dal suo ligando che è presente sulla superficie di alcuni linfociti: il legame induce la morte cellulare. Il recettore per il TNFα ha come ligando il TNFα stesso, una citochina prodotta dal Sistema Immunitario la quale può indurre l'apoptosi. Molti tipi cellulari possiedono queste molecole di membrana che sono dette proteine [o recettori] di morte. Il Fas ha dei ''domini di morte'' citoplasmatici i quali oligomerizzano nel momento in cui il recettore entra in contatto con il proprio ligando. L'oligomerizzazione dei domini provoca la formazione di un sito di legame per una proteina adattatrice detta FADD dotata a sua volta di un dominio di morte. Il FADD legato al recettore di morte lega delle ProCaspasi 8 [nell'uomo anche la Caspasi 10]. Queste sono presenti in un certo numero in uno spazio ravvicinato e vanno incontro a clivaggio reciproco passando alla forma attiva: la Caspasi 8. Questa via è importante perché è stata scoperta essere responsabile di diverse patologie autoimmuni tra cui la tiroidite di Ashimoto. La stessa via mediata però dal recettore per il TNFα permette ad alcune cellule, come ad esempio agli adipociti, di rispondere al TNFα e di andare in apoptosi. [Il ligando del Fas prende il nome di Fas-ligando o FasL: è espresso dai Linfociti T in grado di riconoscere antigeni self (e ha la funzione di eliminare linfociti autoreattivi) e da alcuni Linfociti T citotossici (che uccidono cellule tumorali o cellule infettate da virus)] Via intrinseca. La via intrinseca è determinata da una situazione che si verifica a livello intracellulare. Il mitocondrio svolge un ruolo essenziale, ma a seguito di stimoli che sono molto più leggeri rispetto a quelli della necrosi. La via intrinseca può essere attivata ad esempio in mancanza di fattori di crescita, di ormoni, di stimoli meccanici, a seguito di danno al DNA dovuto a radiazioni ionizzanti, o alla formazione di radicali liberi dovuti alla presenza di agenti chimici che ne possono aumentare la produzione. Un altra situazione che provoca l'attivarsi della via intrinseca è una situazione di stress che si verifica a livello del reticolo endoplasmatico per alterazione dell'avvolgimento delle proteine, il protein-misfolding. Si tratta di situazioni che agiscono a livello della famiglia delle BCL-2, attraverso due effettori che sono il Bax e il Bak. Alcune molecole della stessa famiglia si oppongono a questa azione: sono il BCL-2 e il BCL-X. Il Bak e il Bax una volta attivati raggiungono la membrana esterna del mitocondrio e agiscono come le perforine portando alla formazione di pori da cui fuoriescono gli ioni, provocando la perdita del potenziale alla membrana mitocondriale. Il mitocondrio inoltre perde il Citocromo C che è importante per la produzione di energia. Il Citocromo C nel citoplasma attiva la Caspasi 9. La Caspasi 9 e la Caspasi 8 agiscono attivando la caspasi 3, la quale è in grado di attivare tutta una serie di proteine. Fino all'attivazione delle Caspasi 8 e 9, il processo può essere interrotto in base all'equilibrio tra molecole pro- e anti-apoptotiche. Attivata la Caspasi 3 il processo non è più reversibile. Effetti della Caspasi 3. La Caspasi 3 provoca frammantazione del DNA, formazione di estroflessioni a livello della membrana cellulare nonché taglio e danno a livello di citoscheletro. Questo enzima attiva un'endonucleasi: la Deossiribonucleasi-Caspasi-dipendente, la quale è presente normalmente a livello citoplasmatico dove si trova legata a un inibitore che le impedisce di agire. Questo inibitore viene rimosso dalla caspasi 3 per cui l'enzima può essere trasportato nel nucleo dove taglia il DNA secondo delle sequenze specifiche di 180 paia di basi [Le cellule apoptotiche esibiscono una caratteristica rottura del DNA in grossi frammenti di 50-300 kB sui quali agisce la DNasi riducendoli in frammenti di dimensioni multiple di 180-200 paia di basi]. La Caspasi 3 provoca inoltre la degradazione delle proteine della matrice nucleare e delle laminine che avvolgono il nucleo. L'azione sul citoscheletro è responsabile del raggrinizimento della cellula. Un altro enzima bersagliato dalle Caspasi è la PARP che viene inattivata: è un enzima che consente il riparo del DNA. Nell'immagine abbiamo l'applicazione di una corsa elettroforetica in gel di agarosio e colorazione in bromuro di etidio, di tre tipi cellulari diversi: Pozzetto A: se il DNA è di una cellula vitale esso si trova come delle lunghissime molecole molto pesanti le quali non vengono mosse dalla differenza di potenziale a causa del loro peso, per cui si trovano nella posizione iniziale. Pozzetto B: se il DNA è di una cellula apoptotica si trova raggruppato in diverse bande a seconda della lunghezza dei frammenti generati dall'endonucleasi. La striscia ha un'aspetto ''a scaletta'': è formata dal cosiddetto Ladder DNA. Pozzetto C: se il DNA è prelevato da una cellula necrotica il pozzetto presenta una strisciata diffusa poiché il DNA in queste cellule è scisso in frammenti di tutte le lunghezze. È un metodo di riconoscimento per i vari tipi di morte cellulare, tuttavia non è dogmatico poiché una forma avanzata di necrosi può portare a un quadro diverso che assomiglia al quadro della cellula apoptotica. Ritorniamo alla Via Intrinseca. Gli stimoli esterni provocano la produzione di proteine BCL-2 sia pro-apoptotiche che anti-apoptotiche. Quando la BCL-2 anti-apoptotica è presente, la mambrana mitocondriale è protetta e non rischia di perdere il Citocromo C. La mancanza di stimoli, di fattori di crescita o di sopravvivenza, di stimoli meccanici o la presenza di irradiazioni provocano l'attivazione di una serie di sensori che sono chiamati proteine BH3 [BH3only]: sono Bim, Bid e Bad le quali sono in grado di attivarne altre due che sono il Bax e il Bak. Una volta attivate, oligomerizzano e s'inseriscono nella membrana del mitocondrio dove agiscono similmente alle perforine provocando la formazione di pori, che portano all'interruzione del potenziale di membrana e alla perdita del Citocromo C. Questo nel citoplasma, si lega alla Apaf-1 e alla Caspasi 9 formando un complesso che è in grado di attivare la Caspasi 3. (Dunque non è sufficiente un solo stimolo: perché la cellula vada in apoptosi deve essere completamente alterato l'equilibrio.) Il BCL2 è un fattore anti-apoptotico che regola la fuoriuscita di Citocromo C. BCL-2 lega la Apaf-1 impedendo al Citocromo C di formare con esso l'apoptosoma, sebbene sia fuoriuscito dal mitocondrio. Esiste un tipo di leucemia che iperproduce BCL-2. Se è presente in così grande quantità nella cellula, anche nel caso di un danno importante al DNA, la cellula non può andare in apoptosi poiché il Citocromo C non trova Apaf-1 libere, per cui non si verifica la formazione dell'apoptosoma. Se il fenomeno apoptotico è deficitario per qualsiasi motivo, il risultato può essere un tumore. I tumori in genere non possono essere causati da mutazioni casuali, ma da mutazioni specifiche a carico di geni che controllano, attivano o limitano la proliferazione, e di geni che controllano la morte cellulare e il riparo. Un altro sistema di protezione della cellula è l'espressione di un gene e quindi di una proteina nota come p53, la quale viene prodotta ad esempio quando nella cellula sono presenti specie reattive dell'ossigeno. Questa molecola provoca un blocco del ciclo cellulare tra le fasi G1 ed S, impedendo la replicazione del DNA quando c'è a carico di questo un danno e consentendo il riparo del DNA stesso. Questo evita che la cellula si riproduca con la potenzialità di essere trasformata. Se il danno al DNA è troppo esteso perché la cellula sia in grado di correggerlo p53 induce la cellulla in apoptosi.