TERAPIA GENICA
Trasferimento di geni esogeni in
cellule somatiche di un paziente
per
correggere
un
difetto
genetico ereditato o acquisito o
per introdurre nuove funzioni o
proprietà.
TERAPIA GENICA
Speculazioni sulla possibilità di effettuare
una terapia genica sono degli anni ’60
Primo trial clinico approvato in USA nel
1989. Primo trial clinico in Italia per la
correzione del deficit di adenosina
deaminasi (14 settembre 1992)
al 2001: 596 clinical trials di terapia genica
(3464 pazienti)
al 2007: circa 650 clinical trials di terapia
genica (problemi inefficacia, tossicità)
What is required for
Gene Therapy to be possible?
1) Understanding of the disease process
2) Structure/function of gene to be introduced
3) Animal model and assessment of function
4) Efficient delivery of gene
5) Control of gene expression
6) Prevention/control of immune responses
7) Clinical trial
TERAPIA GENICA-applicazioni
Malattie ereditarie (es. distrofia
muscolare, fibrosi cistica) per far
esprimere la proteina mancante
Malattie neoplastiche in cui i geni
introdotti possono contribuire a
distruggere le cellule neoplastiche
Alterazioni del sistema immunitario per
modificare la risposta immune
Malattie infettive per potenziare i
meccanismi di difesa
Gene Transfer:
getting genes into cells
Two main routes:
In vivo:
i.v. or i.m. injectable; or
non-invasive (eg “sniffable”)
Ex vivo: hepatocytes, skin fibroblasts
haematopoietic cells
Gene delivery approaches
• Physical methods
• Non-viral vectors
• Viral vectors
Physical methods
Injection of naked DNA
Electroporation in vivo or ex vivo
Ballistic technology – the “gene gun”
Effect of Electric Field on Cell Membrane
Ex vivo electroporation
cells are
reinjected
genetically
engineered
cells are
propagated
cells obtained
from
skin biopsy
gene
introduced
into cells by
electroporation
Gene Gun
Metodi fisici
Vantaggi
• Nessuna limitazione
per numero e
dimensione del gene
Svantaggi
• Scarsamente
efficiente se non
per certi tipi
cellulari
• Reazioni
immunitarie per
DNA batterico
• Solo per tessuti
superficiali
Metodi fisici
Strategie per migliorare l’efficienza:
associazione del DNA a polimeri
cationici (pol. lineari, es. poli-lisine;
pol.ramificati, es. polietilenimine o
PEI; pol. sferoidali, es.
poliamidoamine)
Vettori non virali Liposomi
– Vescicole sferiche costituite da un doppio
strato fosfolipidico
idrofilico
idrofobico
Liposome-mediated Gene Transfer
liposome
complex
DNA
endocytosis
membrane fusion
nucleus
Liposomi
Vantaggi
• Nessuna limitazione
per numero e
dimensione del gene
• Facili da produrre
• Scarsa tossicità (?)
Svantaggi
• Efficienza
modesta
• Espressione a
breve termine
TERAPIA GENICA
Caratteristiche ideali di un vettore per
terapia genica:
produzione ad elevate concentrazioni con
metodo facile e riproducibile;
transgene regolato dai suoi elementi di
regolazione;
abilità di raggiungere specifici tipi cellulari;
mancata stimolazione di risposta
immunitaria da parte dell’ospite
TERAPIA GENICA
Integrazione del transgene
Vantaggi:
perpetuo; può consentire
un’espressione stabile ed una cura.
Svantaggi:
un’inserzione random può rendere
silente il transgene o disregolare geni
dell’ospite
effetti a lungo termine (?)
TERAPIA GENICA
Transgene episomale
Vantaggi:
assenza di mutagenesi inserzionale
o effetti a lungo termine.
Svantaggi (?):
espressione transiente;
necessità di trattamenti ripetuti
Vettori virali
Quelli utilizzati per terapia genica sono
modificati affinchè possano infettare
cellule di mammifero, ma non siano in
grado di replicarsi.
Retrovirus
Adenovirus
Lentivirus
Adeno-associated virus
Herpes simplex virus
Engineering a Virus into a Vector
Packaging
Therapeutic
gene
Vector DNA
Helper DNA
wildtype virus
essential viral genes
replication
proteins
Packaging cell
Based on Kay et al 2001
structural
proteins
Viral vector
RETROVIRUS
RNA virus di circa 10 kb
con conversione di RNA
a DNA mediante una
trascrittasi inversa
Vettori principalmente utilizzati sono derivati
dal virus Moloney della leucemia murina.
transgene si integra stabilmente in cellule in
mitosi
inattivato dal complemento
RETROVIRUS
Potenziale tossicità:
generazione di virus replicazionecompetenti (per ricombinazione in
fase di produzione o nell’ospite)
mutagenesi inserzionale (tumori?)
LENTIVIRUS
Vettori retrovirali descritti per
la prima volta nel ’96
Basati sul virus HIV-1
Possono transdurre anche cellule non in
divisione
Potenziale tossicità:
Simile a retrovirus con l’aggravante che si
tratta di un patogeno per l’uomo (studio di
lentivirus felini o equini)
ADENOVIRUS
DNA virus di circa 36 kb
causano infezioni benigne del
tratto respiratorio;
infettano cellule in divisione e non;
facili da produrre in grande quantità;
ospitano geni di grandi dimensioni;
entrano nelle cellule mediante
endocitosi;
trasgene episomale;
ADENOVIRUS
Effetti sfavorevoli:
Espressione a breve termine
Reazioni infiammatorie
Risposta immune dell’ospite:
cellulare (prod. di linfociti T contro
le cellule infettate)
umorale (prod. di anticorpi che
preclude altri trattamenti)
Tossicità acuta
ADENO-ASSOCIATED VIRUS
DNA virus non patogeni che
richiedono adenovirus o
herpesvirus per replicare
Infettano cellule in divisione e non
Può ospitare transgeni non superiori a
4.5 kb
Integrazione del transgene
Inserzione sito-specifica nel
cromosoma 19 (?)
FIBROSI CISTICA
CFTR
Malattia a carattere
autosomico recessivo
causata da mutazioni della
proteina transmembrana
CFTR coinvolta nel trasporto
degli ioni Cloro nelle cellule
epiteliali di vari organi.
Alterazione di CFTR causa accumulo di muco
denso e viscoso nei polmoni e alterazioni
funzionali in fegato, pancreas, organi riproduttori
Terapia sintomatica.
CFTR -terapia genica
Necessità di intervenire in vivo
Risultati sperimentali:
Topo KO (patologia polmonare modesta)
instillazione tracheale di liposoma-CFTR:
promettente
Tossicità vettori virali testata su diverse
specie animali risultato variabile
CFTR -terapia genica
Studi clinici (instillazioni tracheali o spray
nasale):
Liposoma -CFTR: bassa efficienza di trasfezione
e di breve durata
Adenovirus-CFTR: prima generazione problemi
infiammatori e reazioni anticorpali; scarsa
efficacia; seconda generazione meglio tollerati,
scarsa e breve espressione
AAV-CFTR: ben tollerato, ma espressione breve
PEG-poliK-DNA: nessuna tossicità, effetto per 6
giorni
Potenziali sviluppi futuri: cellule staminali
eterologhe o modificate geneticamente
ADA deficiency
Malattia a carattere autosomico recessivo
causata da deficit o alterata funzionalità
dell’enzima Adenosina deaminasi, coinvolto nel
metabolismo delle purine.
Conseguenze: accumulo di dATP, dADP, dAMP;
blocco produzione linfociti T, NK, B; difetti
scheletrici, disturbi comportamentali, alterazioni
rene-fegato.
Patologia letale per grave immunodeficienza.
ADA deficiency
Possibilità terapeutiche:
Trapianto di midollo
Terapia sostitutiva:
PEG-ADA bovino i.m. 1-2/sett.; problemi
compliance, non-responders (15-20%)
Terapia genica ex-vivo
Terapia genica - ADA deficiency
In linfociti T periferici:
risultati soddisfacenti ottenuti con sospensione di
PEG-ADA
vantaggi: fattibilità e sicurezza; linfociti T
ingegnerizzati vivono a lungo;
limiti: ripristino funzionalità confinata ai
linfociti T; necessità di infusioni ripetute.
Terapia genica - ADA deficiency
In cellule staminali del midollo osseo:
ProtocolloStudio effettuato in due bambini di 6 mesi e 30 mesi
Sospensione PEG-ADA. Cellule prelevate dal midollo
osseo e infettate con vettore retrovirale
Moderata mieloablazione con Busulfan (2mg/kg/die per
2 gg) due e tre giorni prima del reimpianto
Risultati a 360 giorni:
Ripristino linfociti B, T, NK e crollo livelli metaboliti
purinici nel paziente più giovane.
Buoni risultati solo a carico di linfociti T e NK nel
secondo paziente.
SCID-X1
(severe combined immunodeficiency disease)
Malattia ereditaria legata al cromosoma X
Grave immunodeficienza caratterizzata dalla
mancata maturazione dei linfociti T e NK
Terapia genica ex-vivo con vettori retrovirali
in cellule staminali ematopoietiche.
Dopo tre anni, sviluppo di leucemia dei
linfociti T in due bambini (mutagenesi
inserzionale al locus LMO-2, cromosoma 11)
Ad oggi 4 casi documentati
OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO
Struttura
modificata per
aumentare la
resistenza alle
nucleasi:
oligonucleotidi
fosforotioati
(stabilità in vitro,
buona emivita)
OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO
Problematiche:
Specificità
Legame a fattori di crescita e loro recettori
(es. PDGF, VEGF, EGFR)
Tossicità pre-clinica : nei roditori
immunostimolazione e degenerazione
tubulare renale e epatica (alte dosi);
nelle scimmie inibizione cascata della
coagulazione, attivazione cascata del
complemento
OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO:
applicazioni
Vitravene (Fomivirsen) - Novartis Primo oligonucleotide antisenso approvato in
terapia (FDA,1998). Distributo in USA, Europa,
Brasile
Indicazioni terapeutiche: trattamento locale di
retinite da CMV in soggetti con AIDS
Bersaglio: sequenza di mRNA della regione IE2
del CMV essenziale per infettività
Tossicità: infiammmazione, aumento di
pressione intraoculare, danni alla retina
APTAMERI
PEGAPTANIB - Macugen®
(Eyetech Pharm./Pfizer)
RNA aptamero diretto contro il
vascular endotelial growth factor
(VEGF)-165, isoforma responsabile di
neovascolarizzazione oculare
patologica e permeabilità vascolare;
Indicazione terapeutica:
degenerazione maculare associata
all’età
PEGAPTANIB
struttura e sede di legame
Purine 2’-O-metilate
Pirimidine 2’-fluorurate
Heparin-binding domain VEGF
APTAMERI
• Selettività
• Scarsa tossicità (?)
• Disponibiltà di “antidoti”
• Alternativa all’uso di anticorpi (?)
Potenziali applicazioni: infezioni,
cancro, patologie cardiovascolari
