Comunicazioni. Enzimi. Un metodo

COM U NICAZIO N I
14
ENZIMI
Un metodo cromatografico rapido per la valutazione
degli isoenzimi mitocondriali e citoplasma tici della
glutammico-ossalacetico transaminasi nel siero umano
G. IDÉO, R. DE FRANCHIS, E. DEL N I N~O. P. SALVADf: e G. FIORELLI
Centro «Antonio ;)i[igliavacca », Istituto di Patolu~ia Speciale lU Pdica I T
<lell'Unit•ersillì di Milono
~ello
studio comparativo dci livelli sierici di enzimi citoplasmatici e
mitocondriali in corso d.i epatopatie, utile n el definir e l'entità ed il tipo di
le!'lione cellulare è particolarmente interessante la valutazione <h·llc component i mitocondriale e citoplasmat ica degli enzimi a doppia localizzazione,
come la malato deidrogenasi (~IDH) e la glutaromico-ossa lacetico transaminasi (GOT) (1·2).
Tali componenti, o isocnzimi, infatti , hanno peso molecolare e velocit;t
tli diffusione nel plasma molto simili, ma difl'criscono p er altr e propriet<ì,
come la car ica elettrica, che permettono ùi caratterizzarli separat amente.
Gli isoenzimi della GOT sono stati caratte rizzati nel siero con vari
metodi (3· 7) che, tuttavia, sop rattutto per l e difficoltà tecniche ch e gcncralmt nte presentano, sono di difficile attuazione nella routine del laboratorio
clinico. Inoltr e, quando l'attività enzimatica del campione in esame è bassa,
11uesti metodi danno r isultati poco attendibili sia p er la loro scar sa sensibilità, sia per la !abilità dcll'isoenzima mitocondriale della GOT (8 • 9).
Abbiamo cercato perciò ùi mettere a punto un m etodo che unisse ad
una sensibilità elevata la maggior e rapidità c scmplicitit di esecuzione po::sibile. Come mezzo di separazione abbiamo scelto la cromatografia su
colonna di resi na a scambio anionico (6) ed abbiamo stabilito le condizioni
per una procedura completa di separazione c r ccupcro delle due attività
GOT. I risultati ottenuti, sottoposti ad opportune verifiche, hanno con·
sentit o di adottar e per analisi di routine nn m etodo semplificato.
1 campioni venivano sottoposti a dialisi continua per .t. ore a -1° C contro
:!5 litri di tampone sodio fo sfato 0,008 M, pii 7; nel frattempo \'Cnivano
allestite, a t cmpcratura ambiente, le colonnine di resina DEAE Scphadcx
A 50 Mcdium (0,9 cm <.li <liarndro e 7,5 cm di altezza); la resina veniva atti A nn. I st. Suver. Sanità (1971) 7, 363-366
3M
f.O)!UNICAZIOXI
vata seguendo le is truzioni della ditta fornitri ce (Pharmacia, U ppsa la). Terminata la dialisi. l mi di campione veniva posto in colonnin a a tempt•ratura
ambiente c lasciato ad sorbin· complctamrnte rlalla r r)lina. S i r:;cl-'ui,·a quindi
una prim a eluzionr ron 13 m i di tamporw :;odio fo:o;fatn O.OOU \L p ii 7.
rd u na flccomla duziont• con 1.~ mi eli t a mpon e sotlio fo~fato 0.~ \1. c·nnl•·n<'ntc l\aCI 0,2 1\1. p H i . Entrumlti gli cluati n·nivano c·on;wnat i in frit-:o·
rifcro. 11 pri11111 eJnaiO COillt ' lll'\ a J'i ..;oenzima UlilOI'Oildrialc• dtl'. ,..,.l' lido eli
tipo cationil·o. 11011 ' eni,·a fissato dalla resina. nwnl r•• ,.,.] ;o.c·eo••dn •·Inalo
era pre,.,t·nte f'i ,.,ucnzima l'itoplas mntit·o c · l ~t• . c:-;st·rHlo di tipn an inn i• .. _ .,-,·ni' ,,
liberato ò nlla r.·-;ina ,.vJIJ t'UII il passuggio Ji un tampout• a ntn~I!ÌIJrt' forz.a
ionica. L' intt·ra t•roct·clurn rroJnatogralica dnra\'a dai ~O ai -J.) miuut i. Jl
dv~ aggio della GOT sugli cbtati ' 'cni,•a c:;egui tu •·o11 l' U\'-T e,.;t Biorhemia (lll)
o, in cal)o di ba:.,•· atlÌ\ itù. cun il Mono-Test. st'iogli!'ndo i reag•·nti dirc ltam cntt: ncU'elua to.
~cl m cttcn ! a punto q uesto metoùo abbiamo prc~o in t•onsiùcrazimw
l'inA.uenz.a d t:i vari fattori chl· possono alterare l'attendibilità dci ris ultati.
Utilizzando campioni di fegato di ratto abbiamo vc.rificatu cht• i tamponi
ad a lta concentrazione eser citano una certa inibiziom• ~-~ ulratti,; tà GOT
~>im ilmcn tc a quanto osservato da altri AA. su campioni umani ( 11• 12) . P er
qua nto riguarùa il tipo di tampone, il pitt sod disfa cente tH'r i campioni rlializz.ati s i è rivelato il tampone soclio fosfato.
La dialisi c·om portn un'inatti,·azionc dj a mbedue gli isoeuzimi , pa rticolarmente marcata per la GOT rnitoeondrialc, che gi.J dopo 8 o r e di
dialisi seend<· a m eno d <'l 50 °{, del valore inizia le (Fig. l ). E ra quindi importante ridurre al minimo qu e!'ta inattivazione c cicì era r Pali:r.:~;abil c con lo
----- --
.... ....
---- - ...... . . -- ...
•
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2
4
6
8
Tompotort l
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Fig. l. -
2
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8
ltmpo (oro l
ISOENZIMA CI TOPLASMATICO
ISOCNZIMA MIIOCONORIALE
Inattivazione percentuale degli isoenzimi della GOT. A ~ni~tra : campioni
conservati n 4oC. A de&tra: campioni sottoposti a dialisi continua R 4°C.
.l nll. I st . S upcr. Sanità (1971) 7, 363- 86&
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365
IDID, DE FliANCHIS, DEL NINNO, SALVADg E FIORELLI
impiego di un apparecchio che, consentendo il ricambio continuo del liquido
di dialisi, permetteva di ottenere una buona dialisi in sole 4 ore, contro le
8-12 necessarie con altri metodi.
Abbiamo anche valutato l' influenza della t emperatura della colonna
cromatografica sulla attendibilit à dei risultati: nelle condizioni sperimentali
adottate non abbiamo riscontrato alcuna perdita di attività nei campioni
cromatografati a t emperatura ambiente, rispetto agli stessi campioni cromatografati su colonnine refrigerate.
Su diverse centinaia di cromatografie di campioni umani c animali
contenenti . da un minimo di 5 ad un massimo di 2000 mU/ml di attività
GOT, il r ccupero globale medio di attività negli eluati è s tato del 95 %,
con un errore s tandard di ± 1,25% , rispetto al campione originale sottoposto a dialisi e diluito come gli eluati (è noto infatti che la diluizione può
causare variazioni deJle attività enzimatiche nei campioni).
Avendo ottenuto recuperi globali molto soddisfacenti, abbiamo in
:;cguito vr rifirato l' cffrttiva ripartizione dei due isoenzimi n ei rispettivi
eluenti. A tale scopo abbiamo cromatografato su DEAE-Sephadex un campione di isocnzima mitocoodriale ottenuto da fegato di ratto parzialmente
purifi cato. La T ab. l most ra i risultati della cromatografia c successiva
t·luzionr tli qur sto r ampionr. sottoposto a diverse diluizioni. Come si vede,
T j\Q ELL A
l
Prova di recupero dcii 'isoenzima mitocondriule e dell ' it!oenzima citoplasmatico
parzialmente purificati, sottoposti a cromatografia su DEAE-Sephadex e
a successiva eluzione con tampone di bassa forza ionica.
Att ivili COT j;,i~oì•le
mUf ml
Atth itM GOT neU'elua tu
Pe·rcentual f" di rf"("uperh
mUfml
I soen;ima mitocondriale:
95, 0
~7
,o
27,6
-l , 2
2 ,6
93, 6
98, 5
·l6,0
26,1
4,3
2,7
97,8
94, 6
l
l
/ soen11im a citoplasmatico:
18 ,6
5 1. 7
103
225
l SU
-,
l
102
103
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l)
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l
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Jli(l
COMUNICAZIONI
anche con campioni rontl'nenti solo 2.6 m U; ml di isoenzima mitocondriale,
esso si t· ri trovato prr- ~sorhè totalmente nd primo cluato. Abbiam o s uceess i·
vamentr ~o llopo s to a li " lettroforcsi (7) il primo eluato. l tracciati elettro·
fort>tit·i ottenuti per la GOT de l campionr da noi usato, confrontati cnn
quelli di un omogenalo totale di fegato di ratto, hanno most rato eh(· il
nos tro campion <· cont r-n .. ,·a soltanto l'isol'm:ima a migrazion t• ratodiea. c.:inì·
mitoconclriak.
P er Ycrilicarr in\ t'l' t' chi' ne anche una minim a quant itit di iscwnzim a
citoplasmatico si s t aeca ~:>~c· dalla u >:ina durante la prima cluziorw. abbiamo
cromatografat() tut ca mpione di isoenzima cit()plasmatico di fegato di ratto
ottenuto per par zial1• purifìcazione su CM cellulosa (Whatman). l .a Tab. J
mostra i ri suhati uegati\'i ottenut i dopo cromatografia cd r luzionP cii
questo campioni' sottoposti> a d iver se diluizioni. Anche con campioni c·out enenti fino a 450 mU,Iml di isoenzùna citoplasmatico, n esstm a attività ì·
stata ritrovata nel primv duato. I tracciati clettroforctici hanno dimostr at o che il campione da noi impiegato conteneva in qt~l'f' to caso soltanlll
l'isoenzima a migrazione anodica, cior eitoplasmatiro .
In base a questi risultati abbiamo potuto semplificar e la nòs tra m etodica.
ed ora eseguiamo solo la prima cluzione. con tamponi' fosfato 0.008 l\l:
sull'eluato ottenuto vicn(• dolc'ato l ' i s o~· nzima mitocondria iP, m l'ntu l'attivitit
della componl'ntl' ('Ìtopla,:malica è calcolata p ~'r ,.;otlrmr.ioue dall'atti,·it;•
totale.
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Un nuovo metodo cromogenico per la determinazione
dell'~ ·amilasi. Parziale caratterizzazione dei prodotti
di degradazione enzimatica e impiego del metodo
a scopo clinico
~I.
CESKA
Dipartimento di Biochimica , Pharmacia AB, Upp.fala , Svez ia
Negli ultiwi a nni Cl s1amo occupati della messa a punto di un metodo
per la det erminazione dell'a-amilasi basato sull' impiego di subs trati di nuovo
tipo (1•3) . L a sintesi di questi substrati comprende due passaggi p rincipali:
il primo consis te nel determinare la conratenazione di macromoleeole dello
a mido soluhile m ediante aggiunta di etere l-4 buta ndiolglicicfico c il secondo
nella colorazione delle particelle insolubili così formate meùian te Cibacron
B lau F 3G-A in ambiente alcalino. Le particelle insolubili, costituite da
una r ete tridimensionale di macromolecole, si rigonfìano in acqua c il loro
grado di rigonfiamento dipende dalla quantità del composto organico ag·
giunto. Attualmente stiamo preparando il polimero sotto forma di perle.
L' idrolisi enzimatica del polimero insolubil e d ell'amido dà luogo alla
formazione di prodotti di degradazione solubili in acqua, cos tituiti da polisaccaridi di diverse dimensioni contenenti l'indicatore colorato. L'assorbi'll<'nto ottico ùella soluzione contenente i prodotti eolorati di degrad azione
•'- proporzionale all'attività a-amilasica.
Le condizioni adottate per l 'idrolisi enzimatica del polimer o colorato
dell'amido mediante a-amilasi sono s tate descritte altrove (2 ) . Il metodo
può essere riassunto come segue.
Le particelle del polimero vengono 5ospese, alla concent.ra..:ione di lO
mg (o più) per mi, in soluzione tampone di fosfato 0,02 M, pH 7,0 conte·
nente NaCI 0,05 M e Na N0 3 0,02 %- l ml della sos pensione vien e aggi1111to
a r iasruna prHvctta r.ontrn~ntP 2 ~ ,ul rli mater iale biologico (c:icro o urina)
preincuba to per 5 min alla t emperatura desiderata. L 'urina viene prediluita
m ~·~co l and on e un volume con 5 volumi di soluzione d orosodica isotonica.
Le provette sono quindi agitate e lasciate in incubazione p er 30 min a 370C.
P r r bloccare la r eazione r nzimatica si aggiungono 0,25 ml di NaOH 0,5 N,
.41w. l• t. Suoer. Sunità (1971) 7,
30~-S71
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OOMUNICA2.IONI
368
:-;i agit a e s i centrifuga per 5 m in a 7 J 5 g. Si misura infmc con uno sp <'ttro·
fotom etro rassorbimento ottico del s urnatante a 620 nm .
Il mt' Lodo descri tt o è s tato m esso a punto u ti]jzza ndo com e sorgen te
l
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di a-amilas i i sieri s t andard d <•lla Ditta H ylaud. La Fig. l m ostra la correla-
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Fig. l. -
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sub!'trato di a-nmiln-i a
una conccntrnziouc tl i 91 7c>
1.:.1.." 1. Le n·aziuni sun"
stat e effrltu:~tr a 370C pt•r
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~atnrnzi unt•
Curva di
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un p crinùo di 3tl min .
- .·''
...r........
( llipr. du ChiuL l l w .
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2 •L
-IIU, 196'!)
zionc tra assorbim ento oli icu e conccnlraziouc del s uh,tralu per lUI s iero
contenente 9176 U .I.fl. Com l' si vede, la sat ura zione dell' cuzirna da parli'
del su.bs trato a\' iene con 25 mg del polimero colorato per mi di miscela ùi
r eazione. Nella routinr a bbiam o i m p i e~ato l O m~ di Htbs trato per ml, u na
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:Fig. 2. -
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4
o-o- 388
· -·
- 31 08
.Effetto del tempo di incubazione sulla liberazione rli
prodotti idro~olubili di degradt\zione del polirnero colorato dell'amido a d iversi'
concentrazioni di a-amilasi,
in U.l.fl a 37oC.
D D - 171
· -· =
'il 'il -
• • -9324
4662
1534
(Ripr. da Chim. Clin . Acta, 24,
«O, 1969)
l
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o
30
60
l
mi n
concentrazione capace di satura r e tm 'attività di circa 4500 U .I./l nelle
condizioni di dosaggio prima descritte.
La Fig. 2 illustra l'idrolisi en~imatica di l O m g del p olimero colora to
da parte di diversi sieri H yland in funzion e del t empo d'incubazione.
A nn. lat. Sul)cr. Sanitc\ (1971) 7, S67-37l
l
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CESKA
369
La liberazione dei prodotti di degradazione dell'amido solubili in acqua è
lineare fino a circa 4600 U.l./1 per un periodo d'incubazione di 30 min.
Si possono anche utilizzare altre condizioni di idrolisi ; se s i desidera,
ad es., effettuare determinazioni dell'a-amilasi dopo un p eriodo di incubazione più breve, ovver o a temperatura più bassa. Occorre, in t al caso, allestire la curva standard n elle condizioni che si vogliono adottar e p er la valutazion e dell' attività enzimatica n ei campioni sconosciuti (2 ).
La curva standard può esser e preparata impiegando diversi campioni
di riferimento di a-amilas i. In un lavoro precedente (2) è stato discusso l'im·
piego di s ieri di controllo pr ovenient i da tre diverse fonti commer ciali: H ylan d, Versa t o] E ed E nzatrol. È st ato osservato ch e il Versa to! E idrolizzav a il polim er o color ato ad una velocità più a lta ch e non gli altri due cam·
pioni. Si è a nche osser vato che i sieri Versa to! E pot evano esser e quasi com·
pletamentc inibiti m edian t e a nticorpi con t ro l'a-a milasi di origine batterica
(B. subtilis) , m ent r e i s ieri H yland ed E nzat rol venivano in vece inibiti solo
in scarsa m isura dai pretlctti ant isieri. Viceversa gli a ntisier i preparati con·
tro l 'a-am1lasi di mammifero n on inibivan o il Ve rsa t o! E, m entre inibivano
in misura apprezzabile i sieri di controllo H yland ed E nzatr ol. Ciò indica
che l'a-amilasi dei sieri di controUo disponibili in commer cio appar tengono
a diverse varie tà m olecolari, e che alcune di esse posson o esser e facilmente
distinguibili m ediante .il nostro metodo di analisi. V arie diluizi oni di siero
e di urin a umani normali id rolizzava no il polimero color a t o dell' amido
in m odo simile a quello dei s ieri st an dar d della H yland. T utt avia con l'urina
si è riscont r at a qualche d eviazione nei confronti della curva st andard p er
valori alti df"ll' attività enzimatica (3 ). Quest o fen om eno può essere dovuto
a una certa instabilità dell'a-amilasi urinaria in seguito a diluizione.
L a pr ecisione del nostro metodo è illustrata dalla Tab. l , n ella quale
~ ono riporta ti i limiti fiduciari a l 95 % per tre diverse attività della a-amilasi .
TAB ELLA
--
l
Valutazione della preciSIOne del m etodo proposto per il dosaggio
dell'a-amilasi con amido colorato
--
Numuo
dei cam pioni
analitici.
Concentroaione
tn;~i.mat~ a
U. l .f l
77
71H>
1572
o•
l
- -
30
ao
30
30
v.tore medio
(ou orbim eo to)
l
-- -
o, 133
1,297
3, 186
0,021
Deviao&ione
ata.oda.rd
l
-
--
0, 003
0, 029
0,055
0, 003
loterv aJJo
fiduciario
l
-
0, 133 ± o, 001
l , 297 ±O, 011
3, 186 ± O, 020
o, 021 ± o, 001
Li mite
di
p robahiUt•
0, 95
0, 95
0,95
l
l
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• \" alo rt dtl bianco.
A nn. I st. Su v e r. Sanità (1971) 7.
::1;; a;-1
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:<OR:L,-~- ~IEJtl
30, li
89, ll3
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Coefficiente di correlazione
O, 93
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314 , O
600 , 8
Cuefficiente
qi
correlazione
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l
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J , 63__ r._= J..:
-
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+ O, 13 1 y = J • 23x -
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~A10L oc•<.n•
113. 2
159
~-- - - -- .
• . .,
----- - - - --1
21 . :l
l , 39x
y = 1,46x --83.06 y = l, l 4x 1- 2.13
1
Valore m edio d i x
3 U. O
Metodo saccarogenico ri- Valore medio di y
542 . l)
spetto al m etodo di Street
------e Close
D eviazione staodard ri spr t121\, i
t o alla r etta di r egre•sionc
R etta di r egrt ssione
O, 96
. 1y = l , 87x - 13~
25 y =
Valore medio di x
. . .
Metodo dell'amido colorato V a 1or e m e d 10
" d"1 y . . .
rispetto al m etndo di
Street e Close
Deviazion e standar_d rispett o alla retta d• r egr essione
R etta di regressione
=
Coefficiente d i correlazioni'
O, 93
131, 0
159,3
542 . 6
600 . 8
+ 65. 84
Ua'"'
-----------------------------------------------------
ì'
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...
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c:
~
:0
Uotmz
y = l,l8x - 36,98 y = O, 7lx
l
--~---------------- 1---------------1 ·
Metodo d ell'amido colorato Valore med io di y
rispetto al m etodo saccarogenic n
Deviazione standard rispetto alla retta di r egressione
Valore m edio di x
Retta di regressione .
M E T O D l
Correlazione statistica fra i vari metodi di determinazione deU'attività amilasi ca
TABELLA 2
w
_,
8
N
-----------------
c:..-:
~
~
c
~
o
371
Cf.$KA
Si è fatto un confronto fra il metodo dell'amido colorato e il metodo
saccarogenico, e fra il metodo dell'amido colorato e il metodo amiloclastico
di Street e Close, per valori normali e per valori elevati dell'a-amilasi nelle
urine e nel siero. I dati sono raccolti n ella Tab. 2 che mostra un alto grado
òi correlazione fra il nostro met odo e gli altri due m etodi.
I dati da noi ottenuti mostrano che il metodo dell'amido colorato è app licabile a ricerche di routine, in quanto fornisce una buona stima della attività enzimatica ed è utilizzabile per un'ampia gamma di atthità enzimati·
ch e. Sulla base dei confronti con gli altri due metodi dell'a-amilasi spt'rimentati, l'intervallo dei valori normali per l'uomo sarebbe compreso tra
86 e 280 U.l.fl per il siero, e tra 125 e 1590 U.I./1 p er l'urina.
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Una variante lecni<"a upera ti va
nella determinazione della fosfatasi alcalina
Y. )JAI.:\CHlOA c \l. \. Sli. ·\ NOS
f,abnrntorio .Ii Anali,si Clinich •. O.•pC'dal•· (;,.,..,,/,• l'ror·inriuf,. d i Busto Arsi: iu
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Gli AA. de:;;crÌ\ ono una vari an 1e di'l In L'lodo di l\ ing· \\' ootlo:t al fenilfosfato disodit·o pl·r la d et ermi nazioHt' d ella fo.:::fatal-i al<'alina del sicru .
La variante d escritta richicclc du t· :-;oli r ea t t i' i. ùi <· tu un o contit•nt·
il suhstrato c raltro il eromogeno. Tali r eattiYi t·on..,e ntono non ~olu di sem ·
plificar e il metodo originale, ma anch e di eliminar•· alrun t' p us• ibili cnust·
di error e <· di ridurre la 'ariahilit;: ti ri risultati.
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Ann. lat. Super. Sanità (1971) 7, 372
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Contributo allo studio di due metodi di dosaggio
dell'attività creatin-fosfocbinasica del siero
A. ALBERTINI e L. SPANDRIO
Istituto di Biologia e Biochimica, Spedali Civili di Brescia
RIASSUNTO
L'attività creatin-fosfochinasica di un vasto gruppo di s ieri normali
c patologici è stata determinata uttlizzando in parallelo il metodo colorimetrico da noi descritto precedentemente ed un metodo spcttrofotometrico
disponibile in commercio come « monotes t» con reattivi allo s tato liofilo.
Le reazioni utilizzate per il metodo colorimetrico sono le s eguenti :
ATP
+ creatina .,....
creatin-fosfochinasi
~ ADP
piruvato-chinasi
+ creatin-fosfato
ADP + fosfo-enol-piruvato .,....
~ piruvato + ATP
piruvato + 2,4 dinitro-fenil-idrazina
• idrazone (colorato)
Il metodo spettrofotometrico è basato sulle reazioni :
cr eatin-fosfochinasi
creatin-fosfato + ADP
~ creatina + ATP
csochinasi
ATP + glucosio .,.... _ _ ___ _ _, glucosio-6-fosfato + ADP
G -6-P -deidrogenasi
glucosio-6-fosfato + NADP .,....
--' fi -fosfo- gluconato +
+ NADPH + H+
I risultati ottc.nnti indicano r hc esist e una buona correlazion e fra il
metodo colorimetrico cd il s is t ema spettrofotometrico c ch e entrambi sono
dotati di notevole prN:i,.: ione. I valori ottenuti dimostrano r he il sccon1lo t\
più sensibile di q uello da noi propos to in precedenza.
I due t est permettono l' uso di sieri conservati a + 4 0C c a - 200C c pn:;;sono trovare entrambi una buona utilizzazione pratica n el laboratorio di routine, sembrandoci il metodo spettrofotometrico piit indicato per un numero
giornaliero di dosaggi limitato ed il metodo colorimetrico piit adatto per le
estese indagini di « scrccning ».
A nn. lat. Suver. Sanità (1971) 7, 373
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Attività enzimatiche collaterali
m una prepat'aziont: di isocitrico deidl'ogenasi purificata
H. ~fOHATTI. \ . \fO~TA 'il
Istituto d i Chimirn
Biulo~ica
t'
A. RUFFU
cl..Il' Univcrsittì di l'u via
La uostra ind agine riguar<la un' i~>o eitril·O deiùrogena;;i (treo-D.-isocitrato: NADP +("") ossidorr duttasi (decarhossilante): EC 1.1.1.42) com une·
mente impiegata p <"r det ermin azioni quantitativc J cll 'acido isoeitrico o d el
NADP... . Si tratta di un enzima, preparato dal cuore di maiale, conservato
in glicerolo al soc}'o . J,a sospensione ha un contenuto di lO mg di proteine/mi
e possied<• un'attiyjt?l specifica di circa ~ Ujmg nell•· seguenti condizioni di
saggio: lunghezza d 'onda 340/366 nm, temperatura 25oC, s pessor e delle
cuvette l cm , volume finale di 3 ml cont enente: tampone imidazolo 88,33 m M
pH 8; MgCl 2 3,33 mM; NADP .,. sale disodieo 0.381 ml\I ; isocitrato, sale
trisodico, 0,516 mM.
N ella prt·parazione enzima tica sono presenti, secondo i dati illustrativi
del prodotto, aconitasi ed isocitrico deidrogenasi NAD+ dipendente in
ragione di meno dello 0,2 % ris pf'tto all'isocitrico deidrogcnasi-~ADP + .
I ristùtati riferiti nel prcsrnte l:woro ci permetlono di segnalare la pre·
senza di altre attivit;\ enzimatich e tra l e quali una particolarmente eleYata,
que1la malico deidrogenasica.
Materiali e m etodi
NAD+, acido libero, ull' 87 % ; NADP+, sal e disodico, all'85% ; glucosio6-fosfato, sale disodico, al 7 7% ; glucosio-6-fosfato deid rogenasi (ca. 140
U /mg) ed isocitrico deidrogenas i ci sono s tati forniti dalla C.F. Boehringer
e Soehne GmbH (l\iannhcim, Germania). DL-isocitrato, sale trisodico, al
(•) Nel t est o sono state impiegate le seguenti abbr eviazioni: ADP: adenosin-5'-difosfato;
AMP: adenosin-5'-monofosfato; NAD+: nicotinammide-adenìn dinucleotide; NADP+: nìco·
tinnmmide-ndenin dinucleotide fo sfnt o.
A nn. I st. Su per. Sani te\ (1971) 7, 374- 380
375
MORATrl, MONTANI E RUFFO
99%; ADP, sale disodico grado I puro al 96% ; acido ossalacetico grado I;
AMP, sale sodico, al 99% erano prodotti della Sigma Chemical Co. (St. Louie
Mo., U.S.A.). Tutti gli altri reattivi erano della E. Mer ck A.G. (Darmstadt,
Germania).
I saggi delle attività enzimatiche sono s tati effettuati con lo spettrofo·
tometro Cary mod. 14 alla lunghezza d'onda di 340 nm, alla temperatura
di 25°C in un volume finale di l ml con cuvette di quarzo dello spessore
di l cm. Per la prova riguardante l' isocitrico deidrogenasi :NAD+ dipen·
dente la miscela di incubazione era costituita da tampone di fosfati mono·
e bipotassico 0,1 M, pH 7,6; l\IgC1 2 0,008 }f; NAD 0,002 M e DL-isocitrato
variabile da 0,016 mM a 1,6 mM (miscela A) ( 1). Una miscela analoga
(miscela B) è stata impiegata per determinare !'attività malico deidrogena·
iìÌca; il ~AD ~ era sostituito da :'llADH + H + 0,2 rnM e l' isocitrato da
acido ossalacetico 0,2 mM.
In un secondo gruppo d i rict•r che la mi cela d'incubazione{' s tata variata
in modo da ~o ostituire il tampone fosfato c gli ioni l\'lg++ con tampone
Tris-HCl 0,025 l\1 r '\lnC11 0,0001> M (miscela C) ('); in quc:>to ca o l'iso·
citrato r d il N ADP t erano presenti in concentrazioni rispettivamente 0,8
•• 0,1 tu~f. Tutte le r eazioni venivano iniziate con l'aggiunta del :.ubstrato
•lopo prrincubazionc in cuvctta degli altri rcatth·i pl'r un periodo di 3 minuti.
J.n tptantitù di proteina enzimatica impiegata nt•i vari gruppi di csv uri·
ru•·nti 'i1·11c preci:-:na di ' olta in Yolta.
Risulwti
lsocitriro deidro,t;masi .V. LV f dipendmte (Fig. l). Con l'irnpit•go
della mi"('t•la trincubazionu \. rontenentc 100 ,ug di prote ina enzimatica,
i· rileY,IIJill' una mode ta riduzione del :\fAD-r (la a ssenza di impurezze di
Fig. l . -
Effett o di concentrazioni
di DL-isocitrnLo ,ull' ntlÌ\ i t r. dridrogc•
nasica ' •\ O + dipt>n·
cr~sccnti
dente.
"
"
\ \DP ndla :-oluzionr di tale cncnzima ,·.... l a t a rontrullata •·cm il -.i,;tcmn
gluco, io-G-fm.. J'ato (0,072 HL,l) 1g hu·osio-6· fo:-.fato d citi rogcna;,i (0. ~ ;tg ml) in
tnmponl' fos fato) .
.{ Rll,
r.t.
SUDfT. SuRitd (197 1) 1 , J;(-3110
376
Ctnl UNICAZIO:>;t
Soltanto con roncentrazioni inferiori a 0,8 mM di D L-isoeitrato si osserva
un decremento di uttivitù, m entre l'aument o a l di sopra di questo valor e non
è accompagnato da Yariazioni della velodtù di reazione: Ycr osimilrnent c ciò
è cla imputare alla scars ità di isocitriro tl•·idrogcnasi NAO+ rupcndentc,
chr p ertanto a i 8UddPtti Yalori ùi cnnccn lrazimw di i:-;ocitrato 'ieur rompi•··
tnmente saturata dal substrato.
Con l'ag~iunta di ADP o di A.MP in conrenl razioni rnmprf'~f' trn <',~
e 2 mM non s i ossf'rvano apprez7.abili incr ementi ddl'attivitù della isoritrico
cl<'idrogrna8i ~AD + dipenclc;ntc, comt· era invcer eia attendersi in ha ~w ali•·
hr n noi c propric tÌl allosterich<' d<·li' enzima (3-8).
Aggiungendo a lla miscela di reazione arido ossalacetiro neutralizzato
a pH 7 con KOJI si osservu una sensibile riduzione della vdocitit di r razione; con una concentraziouc di acido ossalacctico 0,0 lO ru.M si cictermina
un blocco prcssoch& total~ dclJ'nttivit à enzimatica. Riduccmlo la conc·cntrazione dell'acido ossalaceti(·o a 0,005 mM l' inibizione Ì' dd 40 ~l! ' Analogn
risultato s i ottiene ripetendo l'esperimento con una isocitrito deidrogt' na;:i
NAD + dipendente estratta da mitocondri di fegato di ratto c parzialmcntr
purificata. Aument ando il grado di purificazionc della ·preparazione enzimatica m itocon driale secondo il procedimento di Plaut c Aogaichi (9), l'inibizione da ossalacetato subisce notevoli diminuzioni. Con la prepara7.iont·
parzialmente purificata abbiamo dimostrato che l'ini.bizion~ da ossalacrtatn
può esser e di tipo competitivo poiehè tende ad rssere rimossa aumentando
progressivaml•nte la con(·enlraziom• drll'acido iso<'Ìtrico: <'alcolamlo infatti
i valori di l / v c di l !>econdo il proreùimento di Lincwca,·er c Burk (10), si
ottiene, con ossalacetato 0,015 mM, la tipica rappresentazione g rafica della
inibizione competitiva con il substrato.
Siccome il processo di purificazionc er a accompagnato da una sensi bil•·
perdita deiJ'atti,·it à malico dcidrogenasica, l'effetto deH'ossalacetato è tatu
messo in rapporto con l'interferenza di questa proteina enzimatica nel m eccanismo dell'isocit rico dcidrogrnasi. Infatti è possibile che il :'{AD .H -l H~,
prodotto daU'ossidazione dcll' isocitrato, sia riossidato a spese dcll'ossalacetato
che in tal modo simula un effetto inibente. Di tale ipotesi viene data conferma
documentando la presenza anche n ella preparazione enzimatica commerciale, di una cospicua a tti,-ità n;.alico dcidrogcnasica .
's
Mnlico deidrogenasi (Fig. 2). -Utilizzando la miscela d'incubazione B,
analoga a quella impiegata p er i saggi dell'attività isocitrico deidrogenasica,
l'attività malieo deidrogenasica appare m olto elevata, corrispondente a 114
U.I.fmg. Come si vede, si tratta di una presenza quantitativamcnte notevole
ch e permette di supporre una possibile interferenza con l'attività isocitrico
deidrogenasica NAD+ dipendente, quando nella miscela di reazione ven·
gano aggiunte piccole quantità di acido ossalacetico. D'altra parte i risultati
A nn. lat. Super.
Sanit~
(1971) 7, 37•-380
MORA1TI, MONTANI E RUFFO
377
relativi all'azione isocitrico deidrogenasica-NADP+- in presenza di malico
deidrogenasi, permettono di prospettare la presenza nella preparazione di
un'ulteriore attività enzimatica.
~
u
lff
...
..
l- 0. 0 1 , 8 4ò
/l
LI
...
fig. 2. -
Attività mali co deidrogenasica in
presen za di XADH + H + e di ossalacetato 0,2 m)f.
u
...
.
..,
"
v
l
AHMTit MALICO OEIIRJC(~SICA
LI
Transidrogenasi (Fig. 3). -
lncubando 200 pg di proteina enzimatica
nella miscela di reazione C si ottiene una rapida e completa riduzione del
coenzima piridinico e quindi un arresto dcUa r eazione. Se dopo circa 2 min
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1
Effetto dell'acido ossalacetico sull'isocitrico deidrogenasi NA DP+ dipendente.
d nn. I et. SuveT.
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Sanit~
(1971) 7,
37~-380
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378
CO~I l!NIOZIO:-il
dall'esaurimento del NADP + si aggiungono nella cuvetta 0.4 ftmoli di o:;,a lacetato {in un volume di 0,05 m l) si nota una serie eli m oclifieazioni della
densità ottira (D.O.) preced entC'mr ntc raggitwta: s i ha immC'diatamenlt>
una rapida caduta cui segue un decremento piìt lento ma progressi,·o. Dopu
un intervallo di tempo chr è inversamente dipendente daUa quantitù tli
proteina enzimatica impiegata. inizia una rapida a1·cd erazione aiJa qual t·
fa seguito iJ ritorno ad UJJ valore di D.O. vicino n rptPIIo iniziale do\ ulu aJla
rico uv~::r::;ione pressochè totale del NADP ridotlo allo stato ossidato. L ' ultcritll't·
aggiunta ùi i"ocitrato (0.8 ,amoli) produce infatti lllt uno,·o inen·mt· nto tlella
D.O. analogo a quello preceden t e; anche in que.;;to l~a.;; o il vall)rt' Ùt·lla U.O.
r.-gn·discc a ::.ua volta in prcsrnza di O..t. ,umoli ùi os:;aJacctato. Il pro t·c"~u.
come si vede dalla Fig. 3, è ciclicamrntr ripc tibilt·.
L'unira possibile Rpiegazionc di tale comportamento è quella di am·
m etter e la presenza nella preparazion<· enzimatica Ji tma tran~ iùrogt · ·
nasi (EC 1.6.1.1.) che catalizzi la trasform azione del NADPH + H + i11
~ADH t- H + (1 1•1z); in pres enza di ossalacetato c maJit·o deidrogena:; i qucs l o
ultimo verrebbe poi complrtam.entc riosc;idato. V crosimilmentc per tale pro·
cesso sono sufficienti tracce di NAD+ presenti ne i r ealtivi impiegati. La
contaminuziont• con NADH + II+ prcformato (· da escludere poichè i rclati,·i
dosaggi preliminari hanno dato t•sito nt'gati' o.
Discussione
l'
conclusion i .
La presenza di attività contaminanti in una preparazione enzimnlil'a
può dar luogo a valutazioni erronee. sia nel caso di studi cinetici sia quand o
si verificano particolari condizioni, nella determinazione quantitati vn tli
substrati o di coenzimi. Di queste possibilito'L di error e abbiamo dato qualche esempio con l' impiego dell'isocitrieo deidrogenasi N ADP+ dipcndcntt·.
Infatti la preparazione emr.imatica e aminata risponde ottimamente
non soltant o all'impiego per dosare l'isocitrato c iJ NADP+ , ma anche a
qucUo p er studiare i m eccanismi di r egolazione m e tabolica del ciclo dell'ac ido
citrico, di cui ;Jcuni di noi si sono precedentemente occupati 13) , purchù
neUe miscele di r eazione non siano presenti metaboliti capaci di interferire cou
le attività enzimatiche collaterali di cui essa è dotata. Ci riferiamo alJ'cfl'cllo
deU'ossalacetato che in tutte le condizioni capaci di provocare la form a·
zione di NAD ridotto modifica l'attivitìt isocitrico d eidrogenasica impedendo
la completa t r asformazione dell'is oritrato e del NADP+ nei rispettivi prodotti di r eazione.
Di particolare interesse ci sembra il m eccanismo di formazione del
~ADH + H+ . E sso è ben evidente nel caso in cui venga utilizzata l'isocitrico
tleidrogenasi NAD+ dipendente contenuta in minime quantità nella pr e·
parazione studiata: infatti, data la presenza di malico deidrogen asi, il NAD
e·
A nn. I•t. Super. Sanità (1971) 7, 87(..380
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379
M ORAlTI, MONTANi E RUFFO
ridotto viene riossidato ad opera di quest'ultimo enzima con il conseguente
mancat o assorbimento spettrofotometrico che simula un'inibizione.
P er spiegare lo st esso risultato nel caso dell'isocitrico deidrogenasi
:NADP+ si deve invece ammettere la presenza n ella preparazione di una
transid.rogenasi che det ermina una trasformazione del NADPH + H + in
:NADH + H + qualora siano contenute anche tracce di NAD +. In altri t ermini
entrerebbe in gioco lo s tesso m eccanismo proprio dcll'ossidazione mitocond riale dell'isocitrato ch e coinvolge la inter conversione de i due coenzimi
piridinici ridotti e la successiva riossidazione del NADH+ H + ad opera
degli enzimi della catena r espiratoria e dell'02 ( 6• 14-21) .
Un commen to m erita anche l'isocitrico deidrogenasi NAD + dipendente.
È noto infatti che t ale enzima è soggetto a r egolazione allost erica, ma tale
proprietà n on è piìt rilevabile nella preparazione enzimatica da noi esamina t a.
Infa tti la curva che r appresenta il comportamento della v elocità di r eazione
in fwu;ione di concentrazioni cr escenti di s ubstrato non ha l'andamento
tli tipo sigmoidc proprio degli enzimi a llost erici (5·6) ma quello di un enzima
l'he obbedisce alla classica cinetica di Michaelis-l\Ientcn (22 ) . Ntùlo è inoltr e
l'effetto di attivazione da parte dcll'ADP c dell'AMP. Di ciò p uò esser e
individ uata la spiegazione t enendo conto che le propr iet à allost erichc sono
curatterizzate da particolarità strutturali che con m olta verosimiglianza
possono esser e alter ate nel corso di processi di purificazionc e di conserva·
;;:ione tlclla proteina enzim atica.
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