Approcci metodologici nella
microbiologia delle acque e criticità
dei metodi analitici
Istituto
Superiore di
Sanità – Roma
30 ottobre 2007
Rossella Briancesco
Metodi tradizionali
spesso poco sensibili
Metodi colturali
• Pre-arriccchimento
• Arricchimento
• Isolamento
• Identificazione e conferma
sottostima del reale
carico microbico
Solo una percentuale molto bassa (< 1%) dei
microrganismi presenti nell'ambiente acquatico è
evidenziabile sui terreni di coltura
I microrganismi sottoposti a condizioni di stress
ambientale possono:
perdere la capacità di moltiplicarsi in laboratorio
pur continuando a rimanere metabolicamente attivi
stato vitale
non coltivabile
L. pneumophila
Campylobacter
Vibrio
E. Coli O157:H7
Salmonella
Shigella
perdere la capacità di esprimere caratteristiche
metaboliche (pur moltiplicandosi nei substrati
colturali)
Escherichia coli nelle acque:
non fermentanti il lattosio ~ 10%
non producono gas
~ 8%
Metodi colturali - Limiti
• Specificità
• Sensibilità
• Tempo di rilevamento
Specificità e sensibilità
¾ Nutrienti non specifici
alimentano sia microrganismi target sia
microrganismi interferenti
Falsi positivi
¾ Agenti e fattori selettivi (antibiotici, sali, temperatura)
limitano la crescita della flora interferente
ma interagiscono anche con i microrganismi target
Falsi negativi
Metodi colturali - Limiti
Tempo di rilevamento
• batteri indicatori
• patogeni batterici
≥ 24 ore
≥ 48 ore
La scarsa selettività dei substrati colturali impone
più prove di conferma e/o identificazione biochimica,
sierologica degli isolati
• patogeni speciali, virus, parassiti
gg/sett
I risultati delle analisi si ottengono solo
dopo che l’acqua è giunta ai consumatori
ed è stata utilizzata
rischio per la salute
Metodi colturali
Colture su substrati liquidi
Colture su substrati
agarizzati
(conteggio delle colonie)
- Presenza/assenza
- MPN
- Inclusione in agar
- spatolamento su piastra
- filtrazione su membrana
I metodi MPN eseguiti su un numero elevato di repliche
garantiscono un livello di precisione molto alto (es. MPN
miniaturizzati: microplate, colilert)
Metodi colturali
VANTAGGI
SVANTAGGI
- Bassi costi
- Facilità di esecuzione
- Risultati qualitativi e
quantitativi
- Possibile identificazione
preliminare (subs. selettivi)
- Rilevamento anche di
cellule in basso numero in
combinazione con
tecniche di concentrazione
(filtrazione)
− Lunga esecuzione
− Non tutti i microrganismi
sono coltivabili
− Non sempre sono analizzabili
grandi volumi di acqua
−I m.o. vitali ma non coltivabili
non sono rilevabili
− A volte poco selettivi
− Non forniscono informazioni
sull’infettività del m.o.
− Rischio biologico per
l’operatore
Metodi standardizzati (ISO, CEN, IDF,
AOAC)
sono di norma metodi colturali tradizionali
Direttive europee (98/83/CE, 2006/7/CE)
stabiliscono l’uso di metodi colturali
tradizionali
Metodi rapidi
Requisito essenziale
☺: risultato nello stesso
giorno del prelievo
giorno del prelievo
fornire risultati nel più
breve tempo possibile
Tempestive
contromisure
Gran parte elaborati per la determinazione degli indicatori
di contaminazione fecale. Numerosi quelli colturali. Alcuni
particolarmente veloci sono da considerare metodi di early
warning.
6 Risultati in 18-22 ore, alcuni entro 10-12 ore
METODI RAPIDI
Requisiti
9 Sensibilità
9 Specificità
9 Possibilità di distinguere tra organismi vivi
e morti
9 Caratteristiche economiche e gestionali:
costi 6
disponibilità dei reagenti 6
particolari capacità dell’analista 6
particolare preparazione dei campioni 6
disponibilità di apparecchiature 6
facilità nella interpretazione dei risultati 6
METODI RAPIDI
METODI COLTURALI
(basati su attività enzimatiche)
TEST IMMUNOLOGICI
METODI MOLECOLARI
METODI RAPIDI
METODI COLTURALI che
sfruttano l’attività metabolica di
specifici enzimi cellulari dei
batteri
L’uso di specifici substrati - per idrolisi enzimatica di
cromofori o fluorofori - permette di selezionare i
microrganismi ricercati senza ulteriori prove per la
conferma dell’appartenenza al genere o alla specie.
Enzimi come β-D-galattosidasi, β-D-glucuronidasi,
β-D-glucosidasi e amino-peptidasi sono quasi
esclusivi dei batteri coliformi, di Escherichia coli,
degli enterococchi e di Pseudomonas aeruginosa.
METODI COLTURALI che sfruttano attività enzimatiche
Basati su : - filtrazione su membrana (substrati cromogeni)
- MPN (colilert, microplates)
- P/A (colifast)
Es.:
Colilert 18
Metodo ufficiale di riferimento
per le analisi delle acque
destinate al consumo umano
(ISS A 001A rev. 00)
Due nutrienti indicatori ONPG
e MUG, vengono
metabolizzati rispettivamente
dai coliformi e da
E. coli, con produzione di un
composto giallo e di uno
fluorescente.
METODI RAPIDI
TEST IMMUNOLOGICI
Tutti basati sulla specificità della
reazione antigene -anticorpo.
LA (latex agglutination)
EIA (enzyme immunoassay)
ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)
IFA (fluorescence immunoassay)
IMS (Immunomagnetic separation)
TEST IMMUNOLOGICI: IFA
Immunofluorescenza
(Metodi analitici per i protozoi
patogeni: ISS A 017A rev.00 e
ISS A 017B rev.00)
Singole cellule possono essere visualizzate al microscopio ad
epifluorescenza grazie al legame con anticorpi monoclonali
coniugati con fluorocromi (es. FITC), diretti contro epitopi di
superfice degli organismi target.
Non fornisce informazioni su vitalità e infettività; organismi
autofluorescenti possono inficiare il riconoscimento.
10 µm
10 µm
Cisti di Giardia
Oocisti di Cryptosporidium
TEST IMMUNOLOGICI: IMS
SEPARAZIONE IMMUNOMAGNETICA
Tecnica di concentrazione e di purificazione. Utilizzata
nella fase di chiarificazione del metodo di analisi dei
protozoi Giardia e Cryptosporidium.
Gli organismi target sono isolati da campioni concentrati di
acqua mediante utilizzo di microsfere magnetiche coniugate
con anticorpi monoclonali rivolti contro epitopi di superfice.
Separazione specifica, recuperi elevati, facile esame
microscopico sospensione finale.
METODI RAPIDI
Metodi molecolari
Obiettivo: rapida e sensibile ricerca dei m.o.
mediante rilevamento diretto degli acidi nucleici
elevata specificità
elevata sensibilità
bassa possibilità di falsi positivi (contaminazioni)
remota possibilità di falsi negativi
possibilità di identificare m.o. a crescita
difficile e con profilo biochimico incerto
!
FONDAMENTALI PER INTERVENTI RAPIDI IN CASO
DI SOSPETTO INQUINAMENTO DI ACQUEDOTTI O
EVENTI EPIDEMICI
METODI RAPIDI
Metodi molecolari
Tecniche di
Ibridazione
restrizione
amplificazione
usate singolarmente o combinate
Tecniche di ibridazione
Metodi molecolari
Southern Bloth: utilizzata per la conferma di ceppi isolati
ed identificati con metodi colturali
Limiti: - cross-reaction (falsi positivi, scarsa specificità)
- non è possibile differenziare tra m.o. vivi e morti
Fluorescent In Situ
Hybridation (FISH)
Utilizzata:
-studi di filogenesi dei
batteri
- e come test per
l’identificazione dei
protozoi G e C insieme
all’IFA
FISH
Tecniche di ibridazione
Specifiche sequenze nucleotidiche del m.o. target (rRNA)
vengono rilevate mediante ibridazione con sonde marcate a
fluorescenza, dopo aver fissato e permeabilizzato le cellule.
Vantaggi
Limiti
- Elevata specificità
- Rapidità di esecuzione (2-3 ore)
- Rileva anche i m.o. vitali non
coltivabili
- Elevata sensibilità se il target è
RNA ribosomiale
- Possibile ricerca simultanea di
più m.o.
- Possibile automazione mediante
scanning del filtro
-Scarsa sensibilità per i geni
cromosomali o per mRNA
- E’ identificabile solo ciò
che è tassonom. definito
- La distinzione tra
organismi vivi e morti è
difficoltosa
- Poco applicabile a
campioni ambientali con
scarso numero di cellule
(segnale debole)
Metodi molecolari
Tecniche di restrizione
o di digestione enzimatica con endonucleasi di
restrizione
es: ribotipizzazione o RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism)
Metodica di tipizzazione genotipica, basata sull’analisi dei
polimorfismi dei frammenti di restrizione dei geni codificanti
gli RNA ribosomiali.
Utilizzate solo su
colture pure. Utili
per differenziare
differenti ceppi di
una stessa specie
Tecniche di amplificazione
Metodi molecolari
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Reazione enzimatica di amplificazione in vitro di un
segmento specifico di DNA, ottenuta per mezzo di una
DNA polimerasi a partire da una coppia di primers
specifici.
Tecniche di amplificazione
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Vantaggi
Limiti
− Non è garantito il rilevamento
di un singolo m.o.
− Elevata sensibilità
− Occorre una quantità
− Elevata specificità
− Possibilità di identificare sufficiente di DNA del m.o. target
− Alcuni
composti
presenti
m.o. non coltivabili
nell’ambiente sono inibitori
− Rapidità (3 – 4 ore)
− Base di partenza per altre − La procedura di base non
consente la quantificazione
analisi
− Nessuna informazione sulla
vitalità
− Nessuna informazione sulla
infettività
Tecniche di amplificazione
PCR: quando?
Ricerca di microrganismi non coltivabili, o in fase VNC;
Ricerca di microrganismi difficili da coltivare e con tempi
analitici lunghi;
Ricerca di microrganismi a concentrazioni molto basse;
Ricerca di microrganismi privi di caratteristiche
biochimiche e colturali tipiche;
Ricerca di geni responsabili della virulenza in ceppi
patogeni;
Studi epidemiologici (sequenziamento dei prodotti della
PCR).
Tecniche di amplificazione
Varie tipologie di PCR
PCR standard: il target di amplificazione è DNA
RT- PCR: il target di amplificazione è RNA
Nested PCR: il prodotto di una prima reazione
di amplificazione è utilizzato come templato per
una seconda reazione di PCR
Multiplex PCR: simultanea amplificazione di più
sequenze target
PCR Real-time: PCR quantificativa
Tecniche di amplificazione
Metodi molecolari
RT– PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain
Reaction): il target di amplificazione è RNA che viene prima
retrotrascritto in cDNA e quindi amplificato.
Vantaggi
− Gli stessi della PCR
− Indicazioni sulla vitalità
− Informazioni sulla
virulenza
Limiti
- Gli stessi della PCR eccetto
la discriminazione tra vivi e
morti
- Difficoltà nell’estrazione di
molecole di RNA intatte, data
la loro instabilità
Utilizzata ad es. nel metodo ISS A 17D rev. 00 per la
stima della vitalità di cisti/oocisti di protozoi patogeni.
Real-time PCR
Nella PCR real-time oltre alla coppia di primers specifici del
microrganismo che si vuole ricercare, viene aggiunto al mix di
reazione di PCR una sonda fluorescente che, legandosi al
tratto compreso tra le estremità amplificate dai primers, permette
di visualizzare il prodotto di amplificazione in tempo reale.
La fluorescenza emessa
durante l’amplificazione
viene misurata da una
telecamera.
Elevata specificità
Elevata sensibilità
Rapidità di esecuzione
Dati quantitativi
Ridotta possibilità di
contaminazione post PCR
METODI MOLECOLARI
Criticità
♠ Costi
♠ Strumentazione specialistica
♠ Elevata specializzazione del personale
♠ Standardizzazione delle procedure analitiche
GRAZIE PER L’ATTENZIONE !
