Attualità Identificazione in Italia di un nuovo Fenotipo di BSE Casalone C., Zanusso G., Acutis P., Ferrari S., Capucci L, Tagliavini F., Monaco S. & Caramelli M Identification of a second bovine amyloidotic spongiform encephalopathy: molecular similarities with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease, Proc Natl Acad Sci U S A, 2004Mar 2; 101(9):3065-70 INTRODUZIONE L’Encefalopatia Spongiforme Bovina (BSE, bovine spongiform encephalopathy) è una malattia neurodegenerativa del bovino a decorso progressivo e ad esito invariabilmente fatale, appartenente al gruppo delle TSE (Transmissible Spongiform Encephalopathies) o malattie da prione. Questo gruppo di patologie che comprende oltre alla BSE, la malattia di Creutzfeldt-Jakob dell’uomo, la Scrapie degli ovini, la FSE del gatto, la CWD del cervo e la TME del visone è caratterizzato dall’accumulo a livello cerebrale di una isoforma patologica (PrPSc) di una normale glicoproteina di membrana (PrPc). La natura dell’agente trasmissibile di queste malattie non è stata definita con chiarezza, viceversa per alcune di esse (Scrapie, TME) è stata dimostrata l’esistenza di differenti ceppi infettanti naturali facilmente distinguibili sulla base di specifiche proprietà della PrPSc quali peso molecolare, grado di glicosilazione e pattern di deposizione. A seguito dell’epidemia di BSE, nel Regno Unito è stata rilevata una nuova patologia definita variante della malattia di Creutzfeldt-Jakob (vCJD) per molti aspetti affine alla BSE. Dati epidemiologici e studi di trasmissione sperimentale hanno dimostrato che alla base di questa nuova patologia umana vi è lo stesso ceppo prionico della BSE. Inoltre la tipizzazione biochimica della PrPSc ha evidenziato come le caratteristiche molecolari della proteina patologica siano identiche sia in corso di BSE sia in corso di vCJD e di patologie BSE correlate. Si ritiene dunque che a differenza di quanto accade nella CJD dell’uomo e nella Scrapie degli ovini, per quanto riguarda la BSE un solo ceppo ed un solo tipo di PrPSc siano stati sino ad ora individuati.Tuttavia non si esclude che il cosiddetto “salto di specie” possa aver ingenerato nell’agente della BSE modificazioni tali da far ipotizzare la presenza di uno o più nuovi ceppi dotati di proprietà molecolari e biologiche proprie e potenzialmente patogeni per l’uomo. Il sistema di sorveglianza attiva in Italia, a partire dal Gennaio 2001 e sino a Marzo 2004, ha permesso di identificare 118 casi di BSE a fronte di 2.189.816 test effettuati. Tutti i casi sono stati confermati mediante esame istologico, immunoistochimico e Western Blot. Uno studio approfondito sulle caratteristiche neuropatologiche e molecolari dei casi italiani di BSE è stato eseguito presso i laboratori del CEA dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Torino e del Policlinico G.B. Rossi di Verona in collaborazione con l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Brescia e l’Istituto Neurologico Besta di Milano. L’intero cervello di otto bovini risultati positivi ai test di conferma è stato sottoposto ad esame immunoistochimico e Western Blot. Aspetti assolutamente nuovi ed inattesi sono emersi in due degli otto cervelli esaminati. In particolare sia il glicotipo della PrPSc sia il pattern immunoistochimico sono risultati chiaramente differenti da quelli riscontrati in corso di BSE tipica al punto da indurre gli Autori a ritenere di essere in presenza di un nuovo fenotipo di BSE. Inoltre una notevole somiglianza è stata riscontrata sia dal punto di vista biochimico che patologico fra quello che a tutti gli effetti sembra essere un nuovo tipo di encefalopatia spon- 212 Il Progresso Veterinario 6/2004 Cristiano Corona e Maria Ines Crescio CEA- Istituto Zooprofilattico del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta giforme e la malattia di CreutzfeldtJakob sporadica sottotipo M/V2. MATERIALI E METODI Il cervello di otto bovini (4 di razza Frisona, 3 di razza Bruna Alpina , 1 di razza Piemontese) di età compresa fra 5 e 15 anni, regolarmente macellati e risultati positivi al test rapido per la diagnosi di TSE (Prionics, Zurigo) è stato prelevato e sezionato longitudinalmente. La parte sinistra è stata congelata a 80°C e destinata agli esami biochimici, mentre la parte destra è stata posta in formalina al 10%. Successivamente sezioni coronali di circa 5 mm di spessore sono state processate ed incluse in paraffina.Ai fini dello studio sono state selezionate le seguenti aree: il bulbo olfattivo, la corteccia frontale, parietale ed occipitale, il lobo piriforme, l’ippocampo, il nucleo striato, il talamo, il tronco encefalico e sezioni del cervelletto. Determinazione del gene della PrP bovina Il DNA genomico è stato estratto a partire da tessuto nervoso congelato utilizzando un kit del commercio (Qiagen). L’intero gene codificante la PrP è stato amplificato mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando i primer p78 modificato (+) (5’TAAGTGGGCATATGA TGCTC-3’) e p9 (-) (5’-CTGGGATTCTCTCTG GTA CT-3’), seguendo il protocollo decritto da Belt et al. (1995). I polimorfismi del gene PrP sono stati rilevati sequenziando entrambi i filamenti di DNA amplificato con sequenziatore capillare ABI 310 Applied Biosystems). Per determinare il numero di octapeptidi ripetuti presenti nella regione N-terminale della PrP, il gene è stato amplificato con i primer p78 modificato (+) e p60 (-) (5’-GATAGTAACGGTCCTCATAG-3’) e i prodotti di amplificazio- Attualità ne sono stati esaminati dopo elettroforesi in gel di agarosio al 3%. Neuropatologia ed immunoistochimica Sezioni istologiche sono state colorate con Ematossilina ed Eosina e con Tioflavina-S al fine di valutare eventuali modificazioni patologiche. L’esame immunoistochimico è stato eseguito utilizzando un kit immunoenzimatico del commercio (ABC, Vector Laboratories) secondo una metodica standardizzata, che prevede lo smascheramento in acido formico al 96%,l’autoclavaggio a 121°C per 30 minuti e l’incubazione over-night a 4°C con anticorpo monoclonale F99/97.6.1 (1: 1000). L’eventuale presenza di PrPSc è stata rivelata utilizzando 3-3’diaminobenzidina (DAB, Dakocytomation). Dopo apposito trattamento, alcune sezioni in paraffina sono state osservate mediante microscopio elettronico Zeiss EM 109. Western blot Estrazione 100 mg di ciascun campione di tessuto nervoso sono stati omogeneizzati in 9 volumi di un tampone di lisi (NaCl 100mM, EDTA 10mM, Nonidet P-40 0,5%, sodio deossicolato 0,5% e TrisHCl 10mM a pH 7,4) e successivamente digeriti con proteinasi K (50 µg/ml) per 1 ora a 37°C. Deglicosilazione Gli estratti proteici digeriti con proteinasi K sono stati sottoposti a deglicosilazione mediante l’enzima ricombinante N-Glicosidasi F (PNG-asi F) in accordo al protocollo della ditta produttrice (Boehringer Mannheim). Elettroforesi, blottaggio e rivelazione immunologica 10 µl di estratto (400 µg di tessuto) sono stati sottoposti ad elettroforesi su gel di poliacrilamide al 13% e blottati su membrana di PVDF (Immobilon P; Millipore) per 2 ore a 60 V.Dopo la saturazione le membrane sono state incubate a 4°C per tutta la notte con anticorpo monoclonale anti-PrP 6H4 (Prionics) diluito 1:5000. La rivelazione immunologica è stata eseguita mediante chemiluminescenza (ECL, Amersham Pharmacia) e visualizzata su lastra autoradiografica. Le lastre sono state in seguito analizzate mediante scansione densitometrica (GS-710; Bio-Rad). RISULTATI Genotipo. L’analisi genetica dei bovini esaminati ha permesso di identificare in quattro animali una mutazione silente (CAG _ CAA) al codone 70. Inoltre differenze sono state riscontrate per quanto riguarda il numero di ripetizioni octapeptidiche della PrP. Quattro animali erano omozigoti per 6 copie di octapeptidi e 1 per 7, mentre 2 bovini erano eterozigoti con 5:7 e 6:7 copie di octapeptidi. Neuropatologia ed immunoistochimica Sebbene la presenza di una precoce autolisi abbia precluso l’accurata valutazione di alcune aree encefaliche, lesioni spongiotiche significative non sono state rilevate né a livello dell’obex né in sezioni più rostrali di tronco encefalico. La corteccia frontale, parietale ed occipitale non presentavano vacuolizzazioni come pure il bulbo olfattivo, la corteccia del lobo piriforme e l’ippocampo. Una moderata spongiosi del neuropilo era osservata a livello talamico in due bovini di razza Frisona. Il riscontro di pattern immunoistochimici quanto mai differenti associato ad un’insolita distribuzione topografica della PrPSc delineavano la presenza di due gruppi di animali distinti. Il Gruppo 1 comprendeva sei bovini di razza Frisona , inclusi i due soggetti con lesioni spongiotiche a livello talamico, ed un bovino di razza Bruna Alpina. Nel Gruppo 2 erano presenti un bovino di razza Piemontese ed uno di razza Bruna Alpina rispettivamente di 15 ed 11 anni. Gli animali del Gruppo 1 mostravano un tipico fenotipo da BSE, caratterizzato da pattern di reazione immunoistochimica della PrPSc di tipo granulare, a tratti lineari e di tipo gliale o a cielo stellato. Diversamente i bovini del Gruppo 2 presentavano un pattern caratterizzato da placche amiloidi Kuru simili e depositi granulari a livello extracellulare e gliale. Le placche apparivano come strutture dense, unicentriche o più raramente multicentriche, generalmente di forma rotondeggiante e diametro di circa 25 µm, dotate di un core chiaro circondato da un bordo più scuro. Risultavano inoltre fluorescenti dopo colorazione con Tioflavina-S e ultrastrutturalmente composte da fibrille di circa 7 nm di diametro. Notevoli differenze fra i due gruppi di animali erano pure riscontrate nella 213 Il Progresso Veterinario 6/2004 distribuzione regionale dei depositi di PrPSc. Nel Gruppo 1 depositi granulari di PrPSc erano osservati prevalentemente a livello del tronco encefalico e del talamo, mentre il lobo piriforme, il bulbo olfattivo e la corteccia cerebrale risultavano meno coinvolti. Al contrario solo una debole positività era riscontrata nel tronco encefalico dei bovini appartenenti al Gruppo 2 in cui per altro il nucleo motore dorsale del nervo vago appariva risparmiato. Placche amiloidi erano osservate a livello del talamo, nella sostanza bianca subcorticale e negli strati profondi della corteccia cerebrale e del bulbo olfattivo. In fine lo strato molecolare del cervelletto presentava depositi di tipo gliale nel Gruppo 1 ed alcune placche amiloidi nel Gruppo 2. Western blot L’analisi mediante Western blot di omogenati di tessuto nervoso, prelevato dalle regioni corticale e subcorticale degli animali esaminati, ha rivelato la presenza di due diversi tipi di PrPsc sulla base sia del peso molecolare della banda non glicosilata, sia del glicotipo (rapporto in percentuale tra la banda di- e monoglicosilata). Negli animali del gruppo 1 è stato visto un rapporto tra le due glicoforme tipico della BSE e caratterizzato da un più alto valore della banda diglicosilata. Al contrario, nei bovini del gruppo 2, Piemontese e Bruna Alpina, è stato riscontrato un valore maggiore a carico della banda monoglicosilata e una mobilità elettroforetica più elevata per quella non glicosilata. Una diversa distribuzione della PrPSc è stata, inoltre, evidenziata a livello delle varie aree encefaliche. Nei bovini del gruppo 1, la PrPSc risultava prevalentemente distribuita nel tronco encefalico, nell’ipotalamo e nel talamo. Negli animali del gruppo 2, talamo, bulbo olfattorio, ippocampo e corteccia olfattoria rappresentavano le aree encefaliche di maggiore distribuzione della proteina prionica patologica, debolmente presente, invece, a livello del tronco encefalico. Sulla base del fenotipo neuropatologico, della distribuzione della PrPSc e del glicotipo, è stata ipotizzata una relazione tra quanto riscontrato nei bovini del gruppo 2 ed il fenotipo della CJD sporadica caratterizzato da eterozigosi Metionina/Valina al codone 129 del Attualità a b Fig. 1: Distribuzione della PrPsc (in rosso): nella BSE(a) la deposizione di PrPsc è maggiore a livello di tronco encefalico e talamo, mentre a livello corticale la deposizione è minima. Nella BASE (b) i depositi di PrPsc sono maggiori a livello di bulbo olfattorio, corteccia piriforme e talamo, molto inferiori a livello di tronco encefalico e cervelletto. gene della PrP e PrPsc di Tipo 2 (M/ V2). Pertanto, gli omogenati encefalici bovini dei gruppi 1 e 2 sono stati confrontati con i diversi tipi molecolari di PrPSc riscontrati in corso di CJD sporadica. Da questo confronto è emersa un’evidente analogia tra le caratteristiche molecolari della PrPSc dei bovini del gruppo 2 e della sCJD M/V2 sia in termini di peso molecolare che di glicoforme. I dati epidemiologici, neuropatologici e biochimici riscontrati, sono riportati in tabella 1. DISCUSSIONE A partire dal 01/01/2001 in Italia è iniziato un piano di sorveglianza attiva IHC, 20x IHC, 100x Fig. 2: BASE, placca amiloide nella sostanza bianca subcorticale, Immunoistochimica (20x e 100x) 1 2 3 4 5 6 7 8 Fig. 4: Western Bolt dei campioni digeriti con proteinasi K prima (lanel-4) e dopo deglicosilazione. (lane 5-8) sulla BSE, basata sull’utilizzo dei test rapidi per i bovini condotti al macello. L’efficacia di questo sistema ha consentito di identificare casi di infezione che diversamente sarebbero sfuggiti alla sor- Fig. 3: Pattern gliale, Immunoistochimica (40x) 214 Il Progresso Veterinario 6/2004 Attualità N° Identificativo Razza Età (anni) Ripetizioni octapeptidiche che Placche PrP amiloide Mutazioni 1088 Piemontese 15 6/6 Wild Type 109655 Bruna Alpina 5 5/7 Wild Type 102417 Frisona 9 6/6 Wild Type 141387 Bruna Alpina 11 6/7 Codone 70 CAG/CAA codifica Q/Q 78437 Bruna Alpina 5 7/7 Codone 70 CAA/CAA codifica Q/Q 16193 Frisona 5 6/6 Codone 70 CAG/CAA codifica Q/Q 128204 Frisona 7 6/6 Wild Type 72797 Frisona 8 6/6 Codone 70 CAG/CAA codifica Q/Q Tabella 1:Dati epidemiologici, neuropatologici e biochimici riscontrati nei bovini esaminati veglianza passiva. Grazie al Western Blot infatti è stato possibile riscontrare la presenza di PrPSc in animali in fase precoce di incubazione o comunque privi di una sintomatologia clinica evidente. Ciò spiega i risultati ottenuti in questo studio in cui il quadro istologico degli animali esaminati non ha mostrato lesioni spongiotiche di particolare intensità. Tuttavia in accordo con la teoria ufficialmente riconosciuta riguardante l’esistenza di un singolo fenotipo di BSE, il profilo istolesivo descritto risulta per molti aspetti simile a quello riscontrato da altri autori in bovini allevati nel Regno Unito (Simmons et al, 1996;Wells et al, 1989). Viceversa differenze sostanziali fra i due gruppi di bovini esaminati sono state riscontrate sia per quanto riguarda la distribuzione neuroanatomica della PrPsc sia per quel che concerne la morfologia dei depositi e le proprietà biochimiche della PrPsc stessa. Sebbene in condizioni di BSE sperimentale e naturale la formazione di placche amiloidi circondate da vacuolizzazione sia descritta nell’uomo ed in altre specie animali, la presenza di tale pattern associata a BSE nel bovino è un evento del tutto eccezionale. Anche per quanto riguarda le proprietà biochimiche riscontrate, la maggior intensità della banda monoglicosilata e la mobilità elettroforetica più elevata per quella non glicosilata risultano quanto meno atipiche in corso di BSE classica. I risultati ottenuti suggeriscono la presenza di un nuovo ceppo di BSE e di una nuova malattia ad esso correlata che sulla base dei reperti neuropatologici gli autori hanno definito come BASE (Bovine amyloidotic spongiform encephalopathy). Diverse ipotesi sono state formulate per spiegare la possibile origine di questa malattia e le differenze che la distinguono dalla BSE. Gli Autori ritengono che la BASE potrebbe essere la manifestazione di un nuovo tipo di PrPSc. E’ ragionevole pensare infatti che poiché differenze significative non sono state riscontrate nel genotipo dei due gruppi di animali esaminati, le caratteristiche fenotipiche della BASE siano da attribuire esclusivamente ad aspetti molecolari della PrPSc, come del resto accade nella CJD dell’uomo dove la proteina prionica viene classificata in Tipo1 e Tipo2. Una seconda teoria prende invece in considerazione una via d’ingresso e di diffusione della malattia diversa da quella alimentare. Lo scarso coinvolgimento del tronco encefalico ed in particolare del nucleo motore dorsale del nervo vago, associato alla marcata presenza di placche di PrPSc a livello del bulbo olfattivo fanno presupporre che proprio la via olfattiva potrebbe giocare un ruolo importante nella patogenesi della malattia. In ultima istanza la BASE potrebbe rappresentare una forma sporadica di TSE del bovino e ciò spiegherebbe le differenze di età riscontrate fra i due gruppi di animali esaminati Ulteriori studi sono senz’altro necessari al fine di approfondire le conoscenze su questa nuova malattia che sebbene descritta in soli due animali potrebbe celare aspetti epidemiologici interessanti. Non è nuova infatti in letteratura la descrizione di casi di amiloidosi focale nel cervello di bovini positivi per BSE, dunque la reale incidenza della malattia deve essere senza dubbio accertata. Approfondimenti necessitano pure gli aspetti sopra riportati circa la somiglianza tra la BASE e la CJD sporadica (M/V2).In particolare occorre compren- 215 Il Progresso Veterinario 6/2004 + 0 0 + 0 0 0 0 Glicoforma prevalente al western blot Monoglicosilata Diglicosilata Diglicosilata Monoglicosilata Diglicosilata Diglicosilata Diglicosilata Diglicosilata dere se vi sia effettivamente una relazione fra le due malattie e quali possano essere i potenziali rischi per la salute pubblica. A tal fine studi di caratterizzazione del ceppo su topi wild type e prove di trasmissione su topi transgenici umanizzati sono attualmente in corso. In fine è bene ricordare che sebbene sia importante mantenere alta l’attenzione nei confronti delle TSE, qualsiasi tipo di allarmismo riguardo alla BASE sarebbe ingiustificato anche in considerazione del fatto che i due casi riportati sono stati identificati grazie all’attuale sistema di sorveglianza. 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