Identificazione in Italia di un nuovo Fenotipo di BSE

Attualità
Identificazione
in Italia di un nuovo
Fenotipo di BSE
Casalone C., Zanusso G., Acutis P., Ferrari S., Capucci L, Tagliavini F., Monaco
S. & Caramelli M Identification of a
second bovine amyloidotic spongiform
encephalopathy: molecular similarities
with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease,
Proc Natl Acad Sci U S A, 2004Mar 2;
101(9):3065-70
INTRODUZIONE
L’Encefalopatia Spongiforme Bovina (BSE, bovine spongiform encephalopathy) è una malattia neurodegenerativa del bovino a decorso progressivo e ad
esito invariabilmente fatale, appartenente al gruppo delle TSE (Transmissible
Spongiform Encephalopathies) o malattie da prione. Questo gruppo di patologie che comprende oltre alla BSE, la
malattia di Creutzfeldt-Jakob dell’uomo, la Scrapie degli ovini, la FSE del
gatto, la CWD del cervo e la TME del
visone è caratterizzato dall’accumulo
a livello cerebrale di una isoforma
patologica (PrPSc) di una normale glicoproteina di membrana (PrPc).
La natura dell’agente trasmissibile
di queste malattie non è stata definita
con chiarezza, viceversa per alcune di
esse (Scrapie, TME) è stata dimostrata
l’esistenza di differenti ceppi infettanti
naturali facilmente distinguibili sulla
base di specifiche proprietà della PrPSc
quali peso molecolare, grado di glicosilazione e pattern di deposizione.
A seguito dell’epidemia di BSE, nel
Regno Unito è stata rilevata una nuova
patologia definita variante della malattia di Creutzfeldt-Jakob (vCJD) per
molti aspetti affine alla BSE. Dati epidemiologici e studi di trasmissione sperimentale hanno dimostrato che alla
base di questa nuova patologia umana
vi è lo stesso ceppo prionico della BSE.
Inoltre la tipizzazione biochimica della
PrPSc ha evidenziato come le caratteristiche molecolari della proteina patologica siano identiche sia in corso di BSE
sia in corso di vCJD e di patologie BSE
correlate. Si ritiene dunque che a differenza di quanto accade nella CJD dell’uomo e nella Scrapie degli ovini, per
quanto riguarda la BSE un solo ceppo
ed un solo tipo di PrPSc siano stati sino
ad ora individuati.Tuttavia non si esclude che il cosiddetto “salto di specie”
possa aver ingenerato nell’agente della
BSE modificazioni tali da far ipotizzare
la presenza di uno o più nuovi ceppi
dotati di proprietà molecolari e biologiche proprie e potenzialmente patogeni
per l’uomo.
Il sistema di sorveglianza attiva in
Italia, a partire dal Gennaio 2001 e
sino a Marzo 2004, ha permesso di
identificare 118 casi di BSE a fronte
di 2.189.816 test effettuati. Tutti i casi
sono stati confermati mediante esame
istologico, immunoistochimico e Western Blot.
Uno studio approfondito sulle caratteristiche neuropatologiche e molecolari dei casi italiani di BSE è stato eseguito presso i laboratori del CEA
dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Torino e del Policlinico G.B. Rossi di Verona in collaborazione con
l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale
di Brescia e l’Istituto Neurologico Besta
di Milano. L’intero cervello di otto bovini risultati positivi ai test di conferma è
stato sottoposto ad esame immunoistochimico e Western Blot. Aspetti assolutamente nuovi ed inattesi sono emersi
in due degli otto cervelli esaminati. In
particolare sia il glicotipo della PrPSc
sia il pattern immunoistochimico sono
risultati chiaramente differenti da quelli riscontrati in corso di BSE tipica al
punto da indurre gli Autori a ritenere di
essere in presenza di un nuovo fenotipo
di BSE. Inoltre una notevole somiglianza è stata riscontrata sia dal punto di
vista biochimico che patologico fra
quello che a tutti gli effetti sembra essere un nuovo tipo di encefalopatia spon-
212
Il Progresso Veterinario 6/2004
Cristiano Corona e Maria Ines Crescio
CEA- Istituto Zooprofilattico del
Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta
giforme e la malattia di CreutzfeldtJakob sporadica sottotipo M/V2.
MATERIALI E METODI
Il cervello di otto bovini (4 di razza
Frisona, 3 di razza Bruna Alpina , 1 di
razza Piemontese) di età compresa fra 5
e 15 anni, regolarmente macellati e
risultati positivi al test rapido per la diagnosi di TSE (Prionics, Zurigo) è stato
prelevato e sezionato longitudinalmente. La parte sinistra è stata congelata a 80°C e destinata agli esami biochimici,
mentre la parte destra è stata posta in
formalina al 10%. Successivamente
sezioni coronali di circa 5 mm di spessore sono state processate ed incluse in
paraffina.Ai fini dello studio sono state
selezionate le seguenti aree: il bulbo
olfattivo, la corteccia frontale, parietale
ed occipitale, il lobo piriforme, l’ippocampo, il nucleo striato, il talamo, il
tronco encefalico e sezioni del cervelletto.
Determinazione del gene della PrP
bovina
Il DNA genomico è stato estratto a
partire da tessuto nervoso congelato
utilizzando un kit del commercio (Qiagen). L’intero gene codificante la PrP è
stato amplificato mediante reazione a
catena della polimerasi (PCR) utilizzando i primer p78 modificato (+) (5’TAAGTGGGCATATGA TGCTC-3’)
e p9 (-) (5’-CTGGGATTCTCTCTG
GTA CT-3’), seguendo il protocollo decritto da Belt et al. (1995). I polimorfismi del gene PrP sono stati rilevati sequenziando entrambi i filamenti di
DNA amplificato con sequenziatore capillare ABI 310 Applied Biosystems).
Per determinare il numero di octapeptidi ripetuti presenti nella regione N-terminale della PrP, il gene è stato amplificato con i primer p78 modificato (+) e
p60 (-) (5’-GATAGTAACGGTCCTCATAG-3’) e i prodotti di amplificazio-
Attualità
ne sono stati esaminati dopo elettroforesi in gel di agarosio al 3%.
Neuropatologia ed immunoistochimica
Sezioni istologiche sono state colorate con Ematossilina ed Eosina e con
Tioflavina-S al fine di valutare eventuali modificazioni patologiche. L’esame
immunoistochimico è stato eseguito
utilizzando un kit immunoenzimatico
del commercio (ABC, Vector Laboratories) secondo una metodica standardizzata, che prevede lo smascheramento in acido formico al 96%,l’autoclavaggio a 121°C per 30 minuti e l’incubazione over-night a 4°C con anticorpo
monoclonale F99/97.6.1 (1: 1000). L’eventuale presenza di PrPSc è stata rivelata utilizzando 3-3’diaminobenzidina
(DAB, Dakocytomation).
Dopo apposito trattamento, alcune
sezioni in paraffina sono state osservate
mediante microscopio elettronico Zeiss
EM 109.
Western blot
Estrazione
100 mg di ciascun campione di tessuto nervoso sono stati omogeneizzati
in 9 volumi di un tampone di lisi (NaCl
100mM, EDTA 10mM, Nonidet P-40
0,5%, sodio deossicolato 0,5% e TrisHCl 10mM a pH 7,4) e successivamente digeriti con proteinasi K (50 µg/ml)
per 1 ora a 37°C.
Deglicosilazione
Gli estratti proteici digeriti con proteinasi K sono stati sottoposti a deglicosilazione mediante l’enzima ricombinante N-Glicosidasi F (PNG-asi F) in
accordo al protocollo della ditta produttrice (Boehringer Mannheim).
Elettroforesi, blottaggio e rivelazione
immunologica
10 µl di estratto (400 µg di tessuto)
sono stati sottoposti ad elettroforesi su
gel di poliacrilamide al 13% e blottati
su membrana di PVDF (Immobilon P;
Millipore) per 2 ore a 60 V.Dopo la saturazione le membrane sono state incubate a 4°C per tutta la notte con anticorpo monoclonale anti-PrP 6H4 (Prionics) diluito 1:5000. La rivelazione immunologica è stata eseguita mediante
chemiluminescenza (ECL, Amersham
Pharmacia) e visualizzata su lastra autoradiografica. Le lastre sono state in seguito analizzate mediante scansione
densitometrica (GS-710; Bio-Rad).
RISULTATI
Genotipo.
L’analisi genetica dei bovini esaminati ha permesso di identificare in quattro animali una mutazione silente (CAG
_ CAA) al codone 70. Inoltre differenze
sono state riscontrate per quanto riguarda il numero di ripetizioni octapeptidiche della PrP. Quattro animali erano
omozigoti per 6 copie di octapeptidi e 1
per 7, mentre 2 bovini erano eterozigoti
con 5:7 e 6:7 copie di octapeptidi.
Neuropatologia ed immunoistochimica
Sebbene la presenza di una precoce
autolisi abbia precluso l’accurata valutazione di alcune aree encefaliche, lesioni spongiotiche significative non sono
state rilevate né a livello dell’obex né in
sezioni più rostrali di tronco encefalico.
La corteccia frontale, parietale ed occipitale non presentavano vacuolizzazioni come pure il bulbo olfattivo, la corteccia del lobo piriforme e l’ippocampo.
Una moderata spongiosi del neuropilo
era osservata a livello talamico in due
bovini di razza Frisona.
Il riscontro di pattern immunoistochimici quanto mai differenti associato
ad un’insolita distribuzione topografica
della PrPSc delineavano la presenza di
due gruppi di animali distinti. Il Gruppo
1 comprendeva sei bovini di razza
Frisona , inclusi i due soggetti con lesioni spongiotiche a livello talamico, ed un
bovino di razza Bruna Alpina. Nel
Gruppo 2 erano presenti un bovino di
razza Piemontese ed uno di razza
Bruna Alpina rispettivamente di 15 ed
11 anni. Gli animali del Gruppo 1 mostravano un tipico fenotipo da BSE,
caratterizzato da pattern di reazione
immunoistochimica della PrPSc di tipo
granulare, a tratti lineari e di tipo gliale
o a cielo stellato. Diversamente i bovini
del Gruppo 2 presentavano un pattern
caratterizzato da placche amiloidi Kuru
simili e depositi granulari a livello extracellulare e gliale. Le placche apparivano
come strutture dense, unicentriche o
più raramente multicentriche, generalmente di forma rotondeggiante e diametro di circa 25 µm, dotate di un core
chiaro circondato da un bordo più
scuro. Risultavano inoltre fluorescenti
dopo colorazione con Tioflavina-S e
ultrastrutturalmente composte da fibrille di circa 7 nm di diametro.
Notevoli differenze fra i due gruppi
di animali erano pure riscontrate nella
213
Il Progresso Veterinario 6/2004
distribuzione regionale dei depositi di
PrPSc. Nel Gruppo 1 depositi granulari
di PrPSc erano osservati prevalentemente a livello del tronco encefalico e del
talamo, mentre il lobo piriforme, il
bulbo olfattivo e la corteccia cerebrale
risultavano meno coinvolti. Al contrario solo una debole positività era riscontrata nel tronco encefalico dei bovini appartenenti al Gruppo 2 in cui per
altro il nucleo motore dorsale del nervo
vago appariva risparmiato. Placche
amiloidi erano osservate a livello del
talamo, nella sostanza bianca subcorticale e negli strati profondi della corteccia cerebrale e del bulbo olfattivo. In
fine lo strato molecolare del cervelletto
presentava depositi di tipo gliale nel
Gruppo 1 ed alcune placche amiloidi
nel Gruppo 2.
Western blot
L’analisi mediante Western blot di
omogenati di tessuto nervoso, prelevato
dalle regioni corticale e subcorticale
degli animali esaminati, ha rivelato la
presenza di due diversi tipi di PrPsc sulla
base sia del peso molecolare della
banda non glicosilata, sia del glicotipo
(rapporto in percentuale tra la banda
di- e monoglicosilata). Negli animali del
gruppo 1 è stato visto un rapporto tra le
due glicoforme tipico della BSE e caratterizzato da un più alto valore della
banda diglicosilata. Al contrario, nei
bovini del gruppo 2, Piemontese e
Bruna Alpina, è stato riscontrato un
valore maggiore a carico della banda
monoglicosilata e una mobilità elettroforetica più elevata per quella non glicosilata. Una diversa distribuzione della
PrPSc è stata, inoltre, evidenziata a livello delle varie aree encefaliche. Nei bovini del gruppo 1, la PrPSc risultava prevalentemente distribuita nel tronco
encefalico, nell’ipotalamo e nel talamo.
Negli animali del gruppo 2, talamo, bulbo olfattorio, ippocampo e corteccia
olfattoria rappresentavano le aree
encefaliche di maggiore distribuzione
della proteina prionica patologica,
debolmente presente, invece, a livello
del tronco encefalico.
Sulla base del fenotipo neuropatologico, della distribuzione della PrPSc e
del glicotipo, è stata ipotizzata una relazione tra quanto riscontrato nei bovini
del gruppo 2 ed il fenotipo della CJD
sporadica caratterizzato da eterozigosi
Metionina/Valina al codone 129 del
Attualità
a
b
Fig. 1: Distribuzione della PrPsc (in rosso): nella BSE(a) la deposizione di PrPsc
è maggiore a livello di tronco encefalico e talamo, mentre a livello corticale la
deposizione è minima. Nella BASE (b) i depositi di PrPsc sono maggiori a livello
di bulbo olfattorio, corteccia piriforme e talamo, molto inferiori a livello di tronco
encefalico e cervelletto.
gene della PrP e PrPsc di Tipo 2 (M/
V2). Pertanto, gli omogenati encefalici
bovini dei gruppi 1 e 2 sono stati confrontati con i diversi tipi molecolari di
PrPSc riscontrati in corso di CJD sporadica. Da questo confronto è emersa
un’evidente analogia tra le caratteristiche molecolari della PrPSc dei bovini del
gruppo 2 e della sCJD M/V2 sia in termini di peso molecolare che di glicoforme.
I dati epidemiologici, neuropatologici e biochimici riscontrati, sono riportati in tabella 1.
DISCUSSIONE
A partire dal 01/01/2001 in Italia è
iniziato un piano di sorveglianza attiva
IHC, 20x
IHC, 100x
Fig. 2: BASE, placca amiloide nella sostanza bianca subcorticale, Immunoistochimica (20x e 100x)
1
2
3
4
5
6
7
8
Fig. 4: Western Bolt dei campioni digeriti con proteinasi K prima
(lanel-4) e dopo deglicosilazione. (lane 5-8)
sulla BSE, basata sull’utilizzo dei test
rapidi per i bovini condotti al macello.
L’efficacia di questo sistema ha consentito di identificare casi di infezione che
diversamente sarebbero sfuggiti alla sor-
Fig. 3: Pattern gliale, Immunoistochimica (40x)
214
Il Progresso Veterinario 6/2004
Attualità
N°
Identificativo
Razza
Età
(anni)
Ripetizioni
octapeptidiche
che
Placche PrP
amiloide
Mutazioni
1088
Piemontese
15
6/6
Wild Type
109655
Bruna Alpina
5
5/7
Wild Type
102417
Frisona
9
6/6
Wild Type
141387
Bruna Alpina
11
6/7
Codone 70 CAG/CAA codifica Q/Q
78437
Bruna Alpina
5
7/7
Codone 70 CAA/CAA codifica Q/Q
16193
Frisona
5
6/6
Codone 70 CAG/CAA codifica Q/Q
128204
Frisona
7
6/6
Wild Type
72797
Frisona
8
6/6
Codone 70 CAG/CAA codifica Q/Q
Tabella 1:Dati epidemiologici, neuropatologici e biochimici riscontrati nei bovini esaminati
veglianza passiva. Grazie al Western
Blot infatti è stato possibile riscontrare la
presenza di PrPSc in animali in fase precoce di incubazione o comunque privi di
una sintomatologia clinica evidente. Ciò
spiega i risultati ottenuti in questo studio
in cui il quadro istologico degli animali
esaminati non ha mostrato lesioni spongiotiche di particolare intensità. Tuttavia
in accordo con la teoria ufficialmente
riconosciuta riguardante l’esistenza di un
singolo fenotipo di BSE, il profilo istolesivo descritto risulta per molti aspetti
simile a quello riscontrato da altri autori
in bovini allevati nel Regno Unito
(Simmons et al, 1996;Wells et al, 1989).
Viceversa differenze sostanziali fra i
due gruppi di bovini esaminati sono state
riscontrate sia per quanto riguarda la distribuzione neuroanatomica della PrPsc
sia per quel che concerne la morfologia
dei depositi e le proprietà biochimiche
della PrPsc stessa. Sebbene in condizioni
di BSE sperimentale e naturale la formazione di placche amiloidi circondate
da vacuolizzazione sia descritta nell’uomo ed in altre specie animali, la presenza di tale pattern associata a BSE nel
bovino è un evento del tutto eccezionale. Anche per quanto riguarda le proprietà biochimiche riscontrate, la maggior intensità della banda monoglicosilata e la mobilità elettroforetica più elevata per quella non glicosilata risultano
quanto meno atipiche in corso di BSE
classica.
I risultati ottenuti suggeriscono la
presenza di un nuovo ceppo di BSE e di
una nuova malattia ad esso correlata che
sulla base dei reperti neuropatologici gli
autori hanno definito come BASE
(Bovine amyloidotic spongiform encephalopathy).
Diverse ipotesi sono state formulate
per spiegare la possibile origine di questa
malattia e le differenze che la distinguono
dalla BSE. Gli Autori ritengono che la
BASE potrebbe essere la manifestazione
di un nuovo tipo di PrPSc. E’ ragionevole
pensare infatti che poiché differenze
significative non sono state riscontrate nel
genotipo dei due gruppi di animali esaminati, le caratteristiche fenotipiche della
BASE siano da attribuire esclusivamente
ad aspetti molecolari della PrPSc, come
del resto accade nella CJD dell’uomo
dove la proteina prionica viene classificata in Tipo1 e Tipo2.
Una seconda teoria prende invece in
considerazione una via d’ingresso e di
diffusione della malattia diversa da quella alimentare. Lo scarso coinvolgimento
del tronco encefalico ed in particolare del
nucleo motore dorsale del nervo vago,
associato alla marcata presenza di placche di PrPSc a livello del bulbo olfattivo
fanno presupporre che proprio la via
olfattiva potrebbe giocare un ruolo
importante nella patogenesi della malattia. In ultima istanza la BASE potrebbe
rappresentare una forma sporadica di
TSE del bovino e ciò spiegherebbe le differenze di età riscontrate fra i due gruppi
di animali esaminati
Ulteriori studi sono senz’altro necessari al fine di approfondire le conoscenze
su questa nuova malattia che sebbene
descritta in soli due animali potrebbe
celare aspetti epidemiologici interessanti. Non è nuova infatti in letteratura la
descrizione di casi di amiloidosi focale
nel cervello di bovini positivi per BSE,
dunque la reale incidenza della malattia
deve essere senza dubbio accertata. Approfondimenti necessitano pure gli
aspetti sopra riportati circa la somiglianza tra la BASE e la CJD sporadica
(M/V2).In particolare occorre compren-
215
Il Progresso Veterinario 6/2004
+
0
0
+
0
0
0
0
Glicoforma
prevalente
al western blot
Monoglicosilata
Diglicosilata
Diglicosilata
Monoglicosilata
Diglicosilata
Diglicosilata
Diglicosilata
Diglicosilata
dere se vi sia effettivamente una relazione fra le due malattie e quali possano
essere i potenziali rischi per la salute
pubblica. A tal fine studi di caratterizzazione del ceppo su topi wild type e prove
di trasmissione su topi transgenici umanizzati sono attualmente in corso. In fine
è bene ricordare che sebbene sia importante mantenere alta l’attenzione nei
confronti delle TSE, qualsiasi tipo di
allarmismo riguardo alla BASE sarebbe
ingiustificato anche in considerazione
del fatto che i due casi riportati sono stati
identificati grazie all’attuale sistema di
sorveglianza.
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