Presentazione di PowerPoint - Laboratorio Virologia Cosenza

Fase analitica:
Terreni di coltura
ed identificazione
Dott.ssa Saveria Dodaro
Cosenza 06.05.2013
Laboratorio di microbiologia clinica
Diagnosi eziologica
1. identificare l’agente patogeno
2. appropriato trattamento terapeutico
Laboratorio di MICROBIOLOGIA clinica
Altri obiettivi :
Valutare l’efficacia della terapia
Valutare la presenza di portatori sani
(potenziale fonte di contagio in comunità)
Diagnosi di laboratorio delle malattie infettive
 Utilizzo
di
metodologie
scientificamente
valide ed eseguibili in tempi accettabili
 Necessità
di
acquisire
in
tempi
rapidi
informazioni utili alla diagnosi ed alla terapia
Diagnosi batteriologica
Diagnosi diretta
Sospetta infezione
batterica
Diagnosi indiretta
Siero del paziente
sangue
feci
urine
biopsie
tamponi
Ecc.
Metodo immunologico
ricerca di anticorpi verso
l‘agente batterico
immunoenzimatico (EIA)
immunofluorescenza (IFA)
Diagnosi rapida
Esame colturale
Semina su brodo di
arricchimento,terreno solido
non selettivo e/o selettivo
Metodo immunologico
(ricerca di antigeni dell’agente batterico)
Test di agglutinazione
ELISA
Immunocromatografia su membrana
Isolamento del microrganismo in coltura pura
Identificazione
Biochimica,immunologica,molecolare
Metodo molecolare
(ricerca di sequenze genomiche dell’agente
batterico)
PCR
Multiplex PCR
Nested PCR
NASBA
Ibridazione su una sonda verso l’agente
batterico
antibiogramma
Diagnosi batteriologica
Diagnosi diretta: presenza dell’agente patogeno
 Esame microscopico (batterioscopico)
Esame colturale (isolamento)
Ricerca di antigeni
Ricerca di sequenze geniche
Diagnosi diretta: esame microscopico
 Campioni “a fresco”oppure fissati ( al calore o chimicamente)
La scelta del tipo di microscopia dipende dal patogeno presente :
Microscopia in campo oscuro
Microscopia in contrasto di fase
Microscopia in fluorescenza
 Spesso si utilizzano colorazioni “dedicate”
 Gram
 Ziehl Neelsen (alcool-acido resistenza)
Microscopia in campo oscuro
borrelia burgdorferi
Microscopia contrasto di fase
Lieviti
Microscopia in fluorescenza
Diagnosi diretta : esame microscopico (previa colorazione)
Colorazioni SEMPLICI prevedono l’impiego di un solo
colorante :

cristalvioletto

fucsina basica

blu di metilene
Colorazioni DIFFERENZIALI prevedono l’impiego di più di un
colorante :

colorazione di Gram

colorazione di Ziehl -Neelsen
Diagnosi diretta: esame microscopico (previa colorazione)
UTILITÀ CLINICA
 Campioni fissati ( a calore o chimicamente)
• Idoneità del campione (espettorato-neutrofili/ cell.squamose)
Numero e percentuale di polimorfonucleati neutrofili
Presenza o assenza di microrganismi(batteri-funghi-parassiti)
 Colorazione del campione con tecnica di Gram:
Morfologia (cocchi-bastoncelli-coccobacilli)
Disposizione ( catenelle-clusters-diplococchi)
Quantità assoluta di batteri presenti
Percentuale relativa di Gram pos/neg
Localizzazione in sede intra o extra cellulare
 Altre specifiche colorazioni
 bacilli alcool-acido resistenti (Ziehl Neelsen)
 endospore batteriche (Verde malachite)
COLORAZIONE DI GRAM
Neisseria meningitidis
Streptococcus pyogenes
COLORAZIONE DI GRAM
osservazione microscopica
I batteri Gram+
(Staphylococcus, Streptococcuss, etc)
Staphylococcus epidermidis
I batteri Gram –
(E. coli, P. aeruginosa, Neisseriaceae, etc.)
Escherichia coi
COLORAZIONE DI ZIEHL-NEELSEN
Gli organismi acido-resistenti appaiono colorati in rosso
Mycobacterium tuberculosis
ESAME COLTURALE
TERRENI
DI COLTURA
Una condizione per poter studiare i
microrganismi è poterli coltivare nelle
condizioni di laboratorio
A tale scopo si devono conoscere le sostanze
nutritizie e le condizioni fisiche richieste
COLTIVAZIONE DEI BATTERI
In laboratorio l’impiego di “terreni di coltura”
riproduce artificialmente un ambiente in grado
di soddisfare le esigenze metaboliche del
batterio che si desidera coltivare
I terreni di coltura contengono tutte quelle
sostanze organiche ed inorganiche necessarie
per la crescita del microrganismo
La composizione chimica dei diversi terreni
di coltura è in parte differente in relazione
alle necessità nutrizionali del batterio che si
desidera coltivare
“Macronutrienti”
Alcune sostanze sono necessarie a tutti i microrganismi in
quantità notevoli
CARBONIO
AZOTO
OSSIGENO
IDROGENO
ZOLFO
FOSFORO
servono per la sintesi dei
componenti strutturali
della cellula
“Altri Macronutrienti”
“Micronutrienti”
Alcuni elementi sono necessari alla cellula, ma in quantità molto
esigue
TRASPORTO DEI NUTRIENTI ALL’INTERNO DELLA CELLULA
Per poter utilizzare i nutrienti è necessario portarli
all’interno della cellula: l’unico composto chimico che
entra o esce senza difficoltà alcuna dalla cellula
batterica, è l’acqua
TRASPORTO FACILITATO
Alcuni soluti possono passare il filtro della membrana per
diffusione passiva (senza spesa di energia da parte del
microrganismo) questo processo è tuttavia poco efficiente e
troppo lento e i procarioti fanno ricorso a enzimi di membrana
(le permeasi)
TRASPORTO ATTIVO
la concentrazione interna si mantiene superiore a
quella esterna, spendendo energia
L’energia spesa per il trasporto dei nutrienti può
provenire dall’ idrolisi di ATP
TERRENI DI COLTURA
Stato fisico
Possono essere liquidi (per ottenere biomassa senza
limiti spaziali), o solidi
Per solidificare i terreni si impiega L’AGAR
Un polisaccaride, estratto da alghe, che presenta il fenomeno
della sovrafusione (liquefa a 100 C ma resta liquefatto fino a
45 C). L’uso dell’agar permette di dare al terreno la forma
voluta, versandolo ancora liquido nel contenitore più idoneo e
lasciandolo solidificare
Inoltre:
 non è metabolizzato dalla gran parte dei
batteri;
 non manifesta alcuna tossicità;
i microrganismi
invisibili ad occhio nudo
(<0,2 mm) si rendono visibili, dopo replicazione
su substrato solido o liquido
Preparazione dei terreni
1. Dissoluzione degli ingredienti in volume di
H2O.
2. Determinazione del pH ed eventuale
correzione.
3. Distribuzione in contenitori idonei.
4. Sterilizzazione
In base alle sostanze che contengono e alle loro concentrazioni
relative, i terreni di coltura sono classificati come:
 Sintetici (o definiti)
 Complessi
Terreni sintetici o definiti
 I terreni sintetici o definiti sono quelli di cui si conosce
l’esatta composizione. Vengono quasi sempre preparati ad hoc a
seconda delle esigenze nutrizionali del microrganismo che si
desidera far crescere.
 Contengono un numero definito di sostanze a concentrazione
nota.
Terreni complessi
 sono quei terreni di cui non si conosce in maniera dettagliata la
composizione chimica
 Questi mezzi di coltura risultano di estrema utilità in quanto
permettono di far crescere contemporaneamente specie con
esigenze nutrizionali molto diverse fra loro
 Inoltre è possibile far crescere specie le cui esigenze
nutrizionali non sono ancora ben conosciute
Oltre alle sostanze “standard” i terreni complessi contengono:
Peptoni, idrosilati proteici che derivano da una parziale digestione
proteolitica;
Estratti di carne magra, ricchi in amminoacidi peptidi, acidi organici, vitamine
e sali minerali;
Estratti di lievito, ricchi di vitamina B e composti del carbonio e dell’azoto.
I caratteri colturali forniscono indizi utili
per l’identificazione
POPOLAZIONI MICROBICHE NATURALI
La popolazione microbica presente nel nostro ambiente è grande e
complessa. Molte differenti specie microbiche popolano
contemporaneamente vari distretti del nostro corpo (mucose:
orale, intestinale, cutanea) ed in modo analogo il nostro
ambiente (aria, suolo, acqua).
COLTURE MISTE
COLTURA PURA
Una coltura pura è costituita da una
popolazione di cellule derivate tutte da
un’unica cellula madre
Essa rappresenta una condizione artificiale
per l’accrescimento dei batteri ed è una
condizione ottenuta da manipolazioni di
laboratorio
Classificazione qualitativa dei terreni
Terreni elettivi
Sono terreni ricchi di nutrienti, spesso con la presenza di sangue di pecora o
cavallo, che consentono la crescita di quasi tutte le specie batteriche di
interesse medico.
Terreni selettivi
Sono terreni che favoriscono la crescita solo di particolari specie batteriche
grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo di altre specie.
Terreni differenziali
Sono terreni che, grazie alla presenza di particolari componenti, permettono di
distinguere fra diversi gruppi di batteri, consentendo una identificazione
presuntiva della specie isolata.
Terreni di arricchimento
Sono terreni che consentono di aumentare la carica della specie batterica che ci
interessa isolare, grazie alla presenza di fattori che inibiscono la crescita di
specie batteriche contaminanti presenti nel campione in esame.
ESEMPIO DI TERRENO ELETTIVO E
DIFFERENZIALE
a - b - g - emolisi su
piastra di agar
sangue
ESEMPIO DI TERRENO
SELETTIVO E DIFFERENZIALE
Lattosio fermentante
Fermentazione del
Lattosio su agar
Mac Conkey
Agar Mac Conkey
Lattosio non fermentante
ESEMPIO DI TERRENO ELETTIVO E
DIFFERENZIALE
Agar CLED
(Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient)
Lattosio non fermentante
Lattosio fermentante
Contiene:
Lattosio
Blu bromotimolo come indicatore del pH
Cistina amminoacido nutriente
Esame colturale
Pretrattamento del campione
• fluidificazione
• concentrazione
• sonicazione
• diluizione
Esame colturale
Semina del campione
quantitativa
per isolamento
Esame colturale
Incubazione dei terreni di coltura
• temperatura
• ossigeno
TEMPERATURA
• Psicrofili -10 C a +20 C (L.monocytogenes 5-8 C)
• Mesofili +10 a +50 C
• Termofili +40 a +70 C
OSSIGENO
Aerobi obbligati: Crescono solo in presenza di O2 atmosferico
Anaerobi obbligati: crescono solo in assenza di ossigeno atmosferico
Anaerobi facoltativi: crescono sia in condizioni aerobie che anaerobie
Microaerofili: crescono in ambienti con ridotta pressione parziale di ossigeno;
crescono bene in atmosfera addizionata di CO2
OSSIGENO
CRESCITA IN
ANAEROBIOSI
• Per la coltura dei batteri anaerobi bisogna utilizzare terreni riducenti
ed in incubatori speciali.
• I terreni riducenti sono terreni che contengono dei composti chimici
(tioglicolato di sodio) che si combinano chimicamente con l’ossigeno
atmosferico fino ad esaurirlo.
• Gli incubatori speciali a tenuta stagna, contengono sostanze chimiche
(bicarbonato di sodio e sodio boroidruro) che, quando vengono
umidificate, producono CO2 e H2 e successivamente H2O con scomparsa
dell’ossigeno
INCUBATORI SPECIALI
INCUBATORI SPECIALI
CO2
Diagnosi diretta : identificazione
CRESCITA DI COLONIE BATTERICHE SU
TERRENI DI COLTURA
IDENTIFICAZIONE
Caratteri macroscopici delle colonie
stafilococchi
streptococchi
Gram negativi
Enterobatteri
Non fermentanti
miceti
Agar sangue
Agar sangue
Agar
Mac Conkey
Agar
Sabouraud e
Terreni cromogenici
PANORAMA SULLA DIVERSITA’ MORFOLOGICA: LE COLONIE
Caratteri macroscopici
Diagnosi diretta : identificazione
 ID PRESUNTIVA
- Caratteri microscopici (colorazione, forma, organizzazione)
- Caratteri macroscopici (aspetto colonia)
 ID FINALE (DEFINITIVA)
-biochimica
-immunologica
-molecolare
Diagnosi diretta : identificazione biochimica
VALUTAZIONE DELLE CAPACITÀ METABOLICHE DEI MICRORGANISMI
 metabolizzare zuccheri per via ossidativa (via aerobica)
o per via fermentativa (via aerobica)
 produzione di specifici enzimi e/o di prodotti metabolici
metodi “manuali”o “automatizzati”
identificazioni in tempi rapidi (4-6 h)
identificazione manuale
Gram positivi
Stafilococco e streptococco
Cocchi Gram positivi catalasi-positivi
di forma sferica
riuniti in ammassi irregolari, dall’aspetto di
grappoli, del diametro di 0.8-1 μm
immobili
privi di capsula evidente
asporigeni
Gram positivi
Stafilo e strepto
Test CATALASI
2 H2O2
2 H2O + O2
Test: alcune goccie di H2O2 3% direttamente su colonie su
terreno solido (non AS); oppure mischiare una aliquota di
coltura (colonia o coltura liquida) con alcune goccie di H2O2
3% su vetrino portaoggetti e quindi coprire con vetrino
coprioggetti.
Test positivo: sviluppo rapido di effervescenza (O2)
positivo: Staphylococcus
negativo: Streptococcus
Gram positivi
test coagulasi
la coagulasi è un enzima liberato da alcuni batteri in grado di
coagulare il plasma citrato di coniglio.
E' possibile produrre due forme differenti di coagulasi, libera o
legata. Il test in provetta è in grado di rilevare la presenza di
coagulasi libera e legata.
positivo: Staphylococcus aureus
negativo: Staphylococcus epidermidis
Esame microscopico cocchi gram positivi
Aspetto delle colonie su agar sangue di S.aureus
Classificazione degli streptococchi clinicamente significativi
Cocchi Gram positivi: Streptococchi
sferici, con diametro di 1-1.5 μm, disposti in
coppie o catenelle
capsulati
immobili
asporigeni
ossidasi-negativi
catalasi-negativi
aerobi-anaerobi facoltativi
Cocchi Gram positivi: Streptococcus pyogenes
Test della sensibilità alla bacitracina
Agar Sangue (5% sangue di montone)
Incubazione a 37 C in presenza di 5% CO2
cresce anche in atmosfera aerobia
emolisi totale (di tipoβ)
Test della identificazione dell’antigene
polisaccaridico C metodica di Lancefield
(agglutinazione)
Cocchi Gram positivi: Streptococchi e enterococchi
Streptococcus agalactiae
Non presentano emolisi, solo raramente
presentano emolisi β.
Sono caratterizzati dal possesso
dell’antigene polisaccaridico di gruppo B
Enterococchi
Appartengono al genere Streptococcus.
Non presentano emolisi, solo raramente
presentano emolisi β. Sono caratterizzati
dal possesso dell’antigene polisaccaridico
di gruppo D
Cocchi Gram positivi: Streptococcus pneumoniae
Test della sensibilità all’optochina
 AgarSangue (5% sangue di montone)
Incubazione a 37 C in presenza di 5% CO2
cresce anche in atmosfera aerobia.
emolisi parziale del sangue (di tipo α)
Gram negativi
Proteus su Agar sangue e mac conkey
Escherichia coli
su Agar mac conkey
pseudomonas su Agar mac conkey
Gram negativi
Non fermentanti
fermentanti
Bacilli Gram negativi: Enterobacteriaceae
terreno indicatore McConkey Agar
Vengono incubate a 37 C in atmosfera aerobia
 Bacilli Gram-negativi
 asporigeni
 mobili per ciglia peritriche o immobili
 provvisti di pili
 aerobi o anaerobi facoltativi
 ossidasi-negativi
Bacilli Gram negativi: non Enterobacteriaceae o batteri
non fermentanti
non fermentano
gli zuccheri
Crescono su qualsiasi terreno
bastoncelli diritti o incurvati
mobili (uno o più flagelli polari)
isolati o a coppie o in brevi catene
asporigeni
catalasi-positivi
ossidasi-positivi
aerobi
Il test dell’ossidasi
Esame microscopico col.Gram P.aeruginosa
differenzia gli enterobatteri dai batteri gram negativi non
fermententi.I batteri lattosio non fermentanti ( pseudomoniaceae ) posseggono
l'enzima citocromo ossidasi, la cui presenza può essere messa in evidenza dalla
ossidazione di un accettore artificiale di elettroni la tetra-metil-para-fenilendiammina
Gram negativi : salmonella
bacilli
Gram-negativi
asporigeni,
aerobi facoltativi. Fermentano il
glucosio, producendo gas (acido
solfidrico), riducono i nitrati e non
producono citocromo-ossidasi. La
maggior parte non fermenta il lattosio
Salmonella colonie nere produttrici (acido solfridico)
Salmonella Colorazione rosa su terreno cromogeno
Bacilli Gram negativi: Haemophilus
Cresce su Agar Cioccolato (10% sangue di montone emolizzato
 incubazione a 37 C in presenza di 5%CO2
Fattore X, termostabile
Fattore V, termolabile (NAD)
Alternativamente può essere seminato su terreno
TSA (Tryptic Soy Agar) addizionato dei fattori X +V
ID BIOCHIMICA : metodo manuale (BioMèrieux) identification System
ID BIOCHIMICA : metodo automatizzato SIEMENS
Grazie