IZSTO
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del
Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta
IBV
emersione di nuove varianti
virali in Piemonte
Francesca Rizzo - biologo
S.S. Lab. spec. diagn.molec.virologica e ovocoltura
IZS PLVA – Sede di Torino
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Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta
BRONCHITE INFETTIVA AVIARE
Famiglia Coronavirinae, Ordine Nidovirales, Genere Gamma Coronavirus
Grossi virus muniti di ENVELOPE, diametro di 120-160
nm
RNA monocatenario a polarità +, 27600 nucleotidi
Morfologia sferica a "corona" con spikes glicoproteici
che si proiettano verso l'esterno a partire dall'envelope
IBV
ssRNA
+
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BRONCHITE INFETTIVA AVIARE
Da 70 anni ancora uno dei principali problemi sanitari per all. avicoli:
DIFFUSIONE A LIVELLO MONDIALE
ESTREMA VARIABILITA’ DEL VIRUS
PRESSIONE SELETTIVA DEI VACCINI
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BRONCHITE INFETTIVA AVIARE
Da 70 anni ancora uno dei principali problemi sanitari per all.avicoli:
DIFFUSIONE A LIVELLO MONDIALE
ESTREMA VARIABILITA’ DEL VIRUS
PRESSIONE SELETTIVA DEI VACCINI
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VARIABILITA’ DEL VIRUS
TASSI DI MUTAZIONE DEI VIRUS
IBV
ssRNA
+
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VARIABILITA’ DEL VIRUS
ERRORI DELLE POLIMERASI
incorporazione di una base sbagliata
IBV
ssRNA
+
Virus a RNA= compiono intero ciclo replicativo nel citoplasma, sprovvisto di quei sistemi
di PROOFREADING (enzimi deputati al controllo e alla correzione degli errori della
polimerasi) che si trovano soltanto nel nucleo delle cellule eucariotiche.
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VARIABILITA’ DEL VIRUS
RICOMBINAZIONE per SCELTA DI COPIA DELLA
RNA POLIMERASI
La RNA polimerasi salta da un template all’altro
In caso di coinfezione nella stessa cellula di due
varianti di una stessa specie virale:
• Le RNA-pol RNA-dip sono poco processive (si
fermano dopo poche addizioni di basi)
• Alla ripresa dell’attività possono saltare su un
diverso template e continuare la sintesi
• Si forma in al modo un nuovo genoma ibrido
IBV
ssRNA
+
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VARIABILITA’ DEL VIRUS
RAPIDA EVOLUZIONE VIRALE
• Brevi tempi di generazione di progenie virale
• Alto tasso di replicazione di progenie virale
(in genere circa 104-105 virioni/cellula per generazione)
• Tassi di errore variabili nella replicazione
IBV
ssRNA
+
La crescita esponenziale della particelle virali e la
bassa fedeltà delle polimerasi virali aumentano la
probabilità che si verifichino eventi di mutazione.
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IBV: struttura
S
IBV
ssRNA
+
Spike
Envelope
4 proteine strutturali:
- S degli spikes o peplomeri
M
- M e E di membrana glicosilata
Matrice
N
Nucleocapside
H
Emoagglutinina
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IBV: Proteina S
S
S1
Epitopi stimolanti la
risposta immunitaria
Spike
S2
estremamente variabile, specie la subunità S1
numerosi sierotipi differiscono tra loro per più del 20% degli aa
sufficiente mutamento di pochi aa a livello degli epitopi stimolanti la risposta
neutralizzante, con una variazione di solo il 2-3%, perché il MAb specifico non
riconosca più il virus
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Classificazione dei ceppi di IBV
Metodiche virologiche
ISOLAMENTO
• su uova embrionate di pollo SPF
lesioni caratteristiche da IBV:
depositi di ureati nel mesonefro, emorragie cutanee, arricciamento
dell'embrione
• su TOCs colture di tessuto tracheale da embrioni di pollo
Caratterizzazione in GENOTIPI, basata su studi del genoma virale:
- RT-PCR amplificazione della parte di genoma che codifica per la subunità S1
-RFLP “Restriction enzyme fragment lengh polymorphism”
- Sequenziamento regione S1
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Classificazione dei ceppi di IBV
Metodiche sierologiche: sierotipi
Uso di antisieri diretti verso epitopi antigenici all’interno della S1
• Virus-neutralizzazione (VN): + usato per sierotipizzazione/ laborioso, alti costi
• Inibizione dell’emoagglutinazione (HI) con Ag trattati con fosfolipasi C, per valutare
risposte sierotipo-specifiche in seguito a vaccinazione (soprattutto su polli giovani)/ poco
standardizzabile, costi alti, elevata crossreattività
• ELISA: valutare la risposta anticorpale a un trattamento vaccinale e studi di campo/ non
sierotipizza
•Anticorpi monoclonali (MAb’s) : ottimi per tipizzare/ se epitopi mutano rischio di falsi
OIE Terrestrial Manual 2013
negativi
Buona correlazione sierotipo/genotipo, ma vi sono situazioni non corrispondenti:
- ceppi di differenti sierotipi con omologia di sequenza elevata
- ceppi dello stesso sierotipo le cui sequenze nucleotidiche differiscono in modo
rilevante
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IBV
ssRNA
+
Razionale del progetto :
PROGETTO RICERCA CORRENTE 2007
Ricerca finanziata dal Ministero della Salute
Caratterizzazione su base genomica e sierologica dei ceppi di IBV presenti
sul territorio piemontese
Obiettivo dello studio
definire la situazione epidemiologica aggiornata sulla circolazione
di IBV aviare in un’area a rischio.
- la presenza/emersione di nuove varianti, attraverso l'isolamento e la caratterizzazione
virale
- la loro diffusione e il loro significato sul territorio
- favorire la creazione di una rete diagnostica sul territorio in grado di supportare il
veterinario nella definizione di programmi vaccinali mirati
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MATERIALI E METODI
Disegno dello studio- 1
AREA DI STUDIO: provincia di Cuneo ad alta intensità
di allevamenti di pollame con sospetto di circolazione
IBV per riscontri clinici (sintomatologia respiratoria)
POPOLAZIONE DI STUDIO:
galline ovaiole
pollame da carne
(broilers)
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Disegno dello studio- 2
NUMEROSITA’ CAMPIONARIA
50 allevamenti
10 tamponi tracheali (50 soggetti totali)
50 sieri
SCHEDA ANAMNESTICA
Dati anagrafici relativi all'allevamento e
specifiche sui soggetti, quali :
• età dei soggetti dell’unità produttiva
• tipologia di stabulazione
• la consistenza del gruppo
• le patologie pregresse
• la sintomatologia registrata
• le manifestazioni specifiche
• eventuali vaccinazioni praticate
Attività di prelievo realizzate
in collaborazione con i medici
veterinari aziendali di filiera e
alcuni medici veterinari ASL
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Materiali e metodi
FASE 1-Screening
su tutti i campioni
ANALISI VIROLOGICHE
ANALISI SIEROLOGICHE
50 animali/azienda
5 pool di tamponi tracheali
liquido allantoideo
30 sieri /azienda
One step RT-PCR
target subunità S1
(Cavanagh D., 1999)
POSITIVI PCR
Isolamento
Elettroforesi su gel agarosio 2%
banda attesa 383 bp
uova embrionate spf:
- inoculate a 9-12gg
- incubate 7gg a 37°C
- fino a 3 passaggi
- PCR a ogni fine passaggio
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Materiali e metodi
FASE 2-Tipizzazione del ceppo
sui campioni positivi
Per definire a quale genotipo circolante il nostro campione sia più simile
Sequenziamento del target filogenetico- Subunità S1
Purificazione dell’amplificato
PCR di cycle sequencing e purificazione della reazione di sequenza
Corsa su sequenziatore ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)
Analisi delle sequenze e costruzione della matrice d'identità nucleotidica
Si ottiene per ogni sequenza una percentuale di identità nucleotidica (omologia)
rispetto ad una sequenza di riferimento
Nome
Italy 02
793/b
6881-97 B1648
QX-IBV
QX IBV
(D388)
624-I
D1466 D274
Q1
M41
accession
AJ457137 AY544778 DQ386095 X87238 GQ253486 DQ674739 AJ243262 M21971 X15832 AF286302 EU822341
number
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Materiali e metodi
FASE 2- Sierotipizzazione del ceppo
solo su alcuni dei sieri positivi
Inibizione emoagglutinazione (HI)
Antigeni e antisieri acquisiti per lo svolgimento del progetto di ricerca:
D388(QX), M41, 793/b, Italy 02, D274, D1466
Sieri diluiti 1:2; aggiunta Ag emoagglutinanti (4UEA); aggiunta globuli rossi di pollo all'1%;
incubazione; lettura immediata
Il titolo del siero in esame è
il reciproco del valore della
diluizione registrato
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RISULTATI- Analisi virologiche
20 allevamenti risultati positivi all’RT PCR, tutti di broiler
In 13 allevamenti è stato possibile sequenziare il ceppo rilevato
7 allevamenti positivi all’isolamento virale
SEQUENZIAMENTO TRATTO S1
ISOLAMENTO SU UOVA
6 allevamenti ceppo circolante M41
3 positivi all’isolamento
1 allevamento ceppo circolante D274
positivo all’isolamento
2 allevamenti ceppo circolante Qx
nessun isolamento
4 allevamenti ceppo circolante Q1
3 positivi all’isolamento
Isolamento positivo: banda netta in PCR di LA
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Ceppo Q1
Cina 1996-98: proventricolite in ovaiole (Yu et
al. 2001)
Italia,Veneto luglio 2011: aumento di
mortalità in broiler di 15gg, edema
polmonare e sofferenza renale (Toffan,
2012)
Italia, Piemonte giugno-settembre 2011:
manifestazioni specifiche rilevate enterocolite,
rantoli, difformità del gruppo
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RISULTATI- Analisi sierologiche -1
ELISA test
Individuati 4 profili sierologici (dati PCR; dati vaccinazione):
A) 20 allevamenti
SIERONEGATIVI: 2/3 dei sieri NEG (6PCR +;14PCR -;13 V; 6NV ; 1?)
infez.in stadio precoce, pratica vaccinale non corretta
B) 16 allevamenti
SIEROPOSITIVI: prevalenza di alti valori ELISA (1PCR+QX;14PCR-; 13V;2NV;1?)
protezione efficace; no verso Qx (wild type)
C) 6 allevamenti
SIEROPOSITIVI: valori di titolo distribuiti in modo irregolare tra alti,medi e
bassi valori ELISA (2PCR+;5PCR-; 5V; 1NV)
Tipico profilo di vaccinazione spray
D) 5 allevamenti
SIEROPOSITIVI: presenza di sieri ad alto e medio valore ELISA, ma anche
presenza di almeno 1/3 di sieri negativi o bassi positivi (4PCR+;1PCR-; 4NV; 1?)
infez.in stadio precoce, pratica vaccinale non praticata
Tutti gli 11 allevamenti di ovaiole e pollastre analizzati ricadevano in profilo B, PCR-
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RISULTATI- Analisi sierologiche - 2
Inibizione emoagglutinazione (HI)
Elevato costo degli antigeni
Difficoltà di reperimento
Difficoltà di standardizzazione
Forte cross-reattività tra Ag
Criteri di selezione degli allevamenti sottoposti al test HI sono stati i seguenti:
1- verificare l’avvenuta siero-conversione specifica verso un particolare ceppo selvaggio
2- verificare alcuni allevamenti profilo B (sieropositivi ad alto titolo ELISA), ma PCR neg e NV,
la veridicità di quest’ultima affermazione
1- Allevamenti infetti da Qx: HI/Qx NEG
2- Sieroconversione verso M41 e D274 (ceppi vaccinali)
no sieroconversione vs Qx
vaccinati?
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DISCUSSIONE
Approccio diagnostico virologico:
Screening con RT-PCR su matrici di partenza:
- sensibile e veloce
- capace di rilevare anche virus non vitali
- consente rapida tipizzazione (sequenziamento di amplicone regione S1)
Opportuna la valutazione costante della regione target relativa al gene S1
vs
Isolamento virale: costoso, laborioso,
L'isolamento dipende da numerosi fattori:
- vitalità o meno del virus inoculato
- carica virale di partenza
- difficile adattamento di alcuni ceppi alla crescita su uova
- necessità di numerosi passaggi
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DISCUSSIONE
Approccio diagnostico sierologico:
Test ELISA :
- rapido
- standardizzabile e poco costoso
Utile per valutare la risposta anticorpale in seguito a vaccinazione
vs
Inibizione emoagglutinazione (HI):
- alto costo
- forte cross-reattività tra Ag
-difficoltà nell’interpretazione dei risultati
Valutare sieroconversione verso ceppo wild-type specifico, con doppio prelievo a
distanza di 21 gg
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CONCLUSIONI
monitoraggio utile strumento per rilevare l’emersione di nuove varianti
- allestimento di un servizio diagnostico rapido e affidabile sul territorio,
prima non presente
- effettuare una corretta pratica vaccinale (diffusa, ma mal applicata)
allevamenti vaccinati risultati SIERONEGATIVI (Profilo ELISA A)
- sviluppare pratiche vaccinali ad hoc varianti specifiche per ciascuna area
- rispettare le buone norme di biosicurezza e igiene
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Grazie a tutti!
ASL CN1
E.Boetti
M.David
M.Giammarino
G.Giordana
Veterinario
aziendale
C.Longoni
S.S. Lab.spec.diagn.molec.
virologica e ovocoltura IZS PLV
D. Ameri
Ballardini M.
G. Renna
G. Previto
M. Belvedere
E. Barcucci
D. Maglione
M.L. Mandola
IZSPLV- Diagnostica
generale
C.Grattarola
IZSLER- Sezione di
Brescia
I. Barbieri
