Pseudomyotonia congenita del bovino:
dal difetto genetico al meccanismo patofisiologico
Roberta Sacchetto, Francesco Mascarello
Dipartimento di Biomedicina Comparata e Alimentazione
Università degli Studi di Padova
Pseudomyotonia congenita (PMT) della
Chianina (Testoni et al. 2008)
quadro clinico :
1. rigidità muscolare conseguente ad un
aumento di attività;
2. animale stimolato a muoversi più
velocemete della normale camminata
a passo lento;
3. rigidità termina non appena cessa
l’attività sostenuta;
4. sintomi sono presenti fin dalla
nascita;
5. muscoli interessati: arti pelvici ma
anche arti toracici;
6. Elettromiografia e quadro
ematologico: no alterazioni;
Pseudomyotonia congenita bovina: quadro istologico
Muscolo bovino controllo SANO
H&E
Pseudomyotonia bovina: pre-exercise protocol test
H&E
Gomori’s staining
Pseudomyotonia bovina: post-exercise protocol test (10 min, 3 volte al dì, 10 giorni)
Gomori’s staining
H&E
Ab anti myosina neonatale
La fibra muscolare scheletrica: 1) miofibrille e 2) reticolo sarcoplasmatico
myosin actin
Rappresentazione schematica: contrazione e rilassamento (transitoria e rapida
variazione di concentrazione di Ca2+ nel citoplasma della fibra muscolare)
Guglielmi V et al.
J Genet Syndr
Gene Ther 2013
1) L’attività del motoneurone dà inizio alla depolarizzazione
del sarcolemma che genera il potenziale d’azione;
(2) Il recettore della Diidropiridina (DHPR) agisce da
sensore del cambiamento di potenziale d’azione;
(3) Il cambiamento conformazionale si trasmette al
recettore della ryanodina (RyR1) con conseguente apertura
del canale RyR stesso e rilascio del calcio dal lume del RS.
(4) Nel sarcoplasma il calcio si lega alla troponina
determinando lo spostamento della tropomiosina dai siti di
binding della miosina sui filamenti di actina abilitando così
la formazione dei cross-bridge tra actina e miosina con
conseguente accorciamento del sarcomero e contrazione
del muscolo.
(5) La Ca2+ATPase 1 (SERCA1) del RS è attivata dall’elevata
concentrazione di calcio nel citosol e catalizza il trasporto
del calcio dal sarcoplasma al lume del RS a spese dell’ATP.
Patologie animali correlabili alla pseudomyotonia
- Ipertermia maligna (maiale): porcine stress syndrome, (PSS) (RyR channels);
- Glycogen storage diseases (cavallo): Glicogenosi di tipo V o McArdle’s disease
(phosphorylase kinase);
- Miotonia (“fainting” goats, cavallo, pony, Miniature Schnauzer); EMG positiva
(chloride channels);
Patologie umane correlabili alla pseudomyotonia
- Miotonie congenite (Thomsen and Beker): EMG positiva (chloride channels);
- Malattia di Brody;
Pseudomyotonia congenita (PMT)
quadro clinico (Testoni et al. 2008):
Human Brody disease
quadro clinico: (Brody 1969 N Engl J Med)
1. rigidità muscolare conseguente ad un
aumento di attività;
1.
rigidità muscolare indotta da
esercizio;
2. animale stimolato a muoversi più
velocemete della normale camminata
a passo lento;
2.
contrattura e crampi iniziano dopo
pochi secondi dall’inizio di un
esercizio sostenuto;
3. rigidità termina non appena cessa
l’attività sostenuta;
3.
dopo un breve periodo a riposo la
rigidità cessa;
4. sintomi sono presenti fin dalla
nascita;
4.
sintomi si manifestano durante
l’infanzia;
5. muscoli interessati: arti pelvici ma
anche arti toracici;
5.
muscoli interessati: arti inferiori,
superiori, tronco e m. facciali;
6. EMG: no alterazioni;
6.
EMG: no alterazioni;
7.
difetto del gene ATP2A1 (SERCA1)
Pseudomyotonia bovina: analisi del gene ATP2A1 che codifica per la
sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+ ATPase (SERCA1) in bovini di razza Chianina
X
Legend:
Pseudomyotonia bovina: risultati dell’analisi genetica del gene ATP2A1
Chianina: mutazione
Arg164His
Romagnola: mutazioni
Gly211Val Gly286Val
Dutch Improved Red and
White: mutazione
Arg559Cys
Pseudomyotonia bovina: immunofluorescenza con Ab anti SERCA1 su sezioni trasverse
citoplasma
Ab secondario
Ab anti SERCA1
SERCA1
control m.
case 1
case 2
case 3
Pseudomyotonia bovina: isolamento della frazione arricchita in membrane di
reticolo sarcoplasmatico e immunoblot con Ab anti SERCA1 e marcatori del reticolo
myosin actin
pathol. case 2
control m.
RyR
myosin
SERCA1
CASQ
actin
1
2
3
4
5
1, 4: frazione microsomale
arricchita di SR
2, 5: frazione solubile
3, 6: fraction myofibrillare
6
Pseudomyotonia bovina: immunoblot con Ab anti SERCA1 e marcatori del reticolo
sulla frazione microsomale arricchita in membrane di reticolo sarcoplasmatico (SR)
frazione arricchita in membrane di SR
patologici
SERCA1
RyR
CASQ
frazione arricchita in membrane di SR
Pseudomyotonia bovina: attività Ca2+ ATPasica della frazione arricchita in
membrane di reticolo sarcoplasmatico
controls
case 3
case 4
case 1
case 2
Pseudomyotonia bovina: mutazione del gene ATP2A1
ridotta espressione di proteina SERCA1 nelle membrane del SR
rallentato Ca2+ re-uptake
livelli di Ca2+ citoplasmatici prolungati
Short term effect:
contrattura muscolare
Long term effect:
Ca2+ damages
?
Pseudomyotonia bovina: il sistema controllo qualità - ubiquitina-proteasoma
- autofagico-lisosomiale
Kisselev & Goldberg,
Chemistry & Biology
2001
Pseudomyotonia bovina: purificazione della SERCA1 bovina e cristallizzazione
della proteina
1
2
kDa
250
150
100
SERCA1
75
50
37
25
1 – frazione arricchita in SERCA1 bovina
2 - estrazione con detergenti della
proteina SERCA1
SERCA1 cristallo
Pseudomyotonia bovina: struttura tridimensionale della SERCA1 bovina
- la catena leterale protonata della Arg164 è controbilanciata dalla
carica negativa dell’acido glutammico Glu2.
La His a pH fisiologico è neutra e più corta e potrebbe destabilizzare
la proteina
- la catena leterale dell’Arg interagisce con gli atomi di ossigeno
carbonilici delle catene laterali di almeno quattro residui
amminoacidici circostanti: Ile165, The191, Lys7 and His5, agendo
così da “punto di ancoraggio” e assumendo un ruolo centrale per il
corretto “folding”.
Pseudomyotonia bovina: transfezione di cellule HEK293 con il cDNA ricombinante
DNA ricombinante:
pcDNA3.1
SERCA1 WT
pcDNA3.1
SERCA1 R164H
Cellule HEK293 transfettate col DNA ricombinante (plasmide)
Pseudomyotonia bovina: misfolded SERCA1 bersaglio del sistema controllo
qualità (proteasoma)
+ MG132
MG132
Trattamento delle cellule con
MG132, inibitore del proteasoma
ubiquitina
Pseudomyotonia bovina: misurazione dei transienti di Ca2+ con aequorina
DNA ricombinante:
cellule trasfettate con 24h con cDNA per
apoaequorin successivamente incubate due ore
con 5 mM coelenterazina
Pseudomyotonia bovina: trattamento ex vivo delle fibre muscolari con
inibitore del proteasoma MG132
Pseudomyotonia bovina: mutazione R164H della SERCA1
mutazione causa misfolding ma conservazione della attività catalitica
SERCA1 misfolded è degradata dal sistema ubiquitina-proteasoma
inibizione del proteasoma previene la degradazione della SERCA1
recupero quantitativo e
funzionale della SERCA1
approccio terapeutico
per la Brody disease
Nessuna malattia è così rara
da non meritare attenzione
grant N. 12058
Pharmacological rescue of misfolded proteins: innovative approaches for the
cure of three muscular diseases
Elisa Bianchini 1, Chiara Gomiero 2, Tiziano Dorotea 2, Giorgia Valle 1, Francesco Mascarello 2,
Romeo Betto 1,3, Pompeo Volpe 1, Roberta Sacchetto 2, Sandonà Dorianna 1
2Department
of Comparative Biomedicine and Food Science, 1Department of Biomedical Sciences University of Padova, 3Institute
of Neuroscience, Padova, National Research Council of Italy
