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Alcune classi particolari di malattie
genetiche
• Malattie Mitocondriali
• Malattie da triplette (X-fragile, SCA).
Concetto di premutazione ed anticipazione
• Imprinting (sindrome di Prader-Willi e
sindrome di Angelman)
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IMPRINTING GENOMICO:
La battaglia dei sessi comincia nello zigote
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DEFINIZIONE
Per la maggioranza dei geni di mammifero
l’espressione di un allele non dipende dal fatto
che l’allele sia stato ereditato dalla madre o dal
padre. Tuttavia alcuni geni sono particolari
poiché l’espressione di un allele dipende dalla
sua origine parentale: per alcuni geni viene
espresso l’allele materno per altri quello
paterno. A questo fenomeno si dà il nome di
IMPRINTING GENOMICO.
Si definisce “imprinted” la copia del gene che
non viene espressa.
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The expression of an imprinted gene depends on its parental origin
Paternal allele
GENE 1
ON
non Imprinted
Maternal allele
GENE 2
GENE 3
ON
OFF
Imprinted
Paternally
expressed
GENE 1
GENE 2
ON
OFF
Imprinted
Maternally
expressed
GENE 3
ON
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La scoperta dell’ Imprinting Genomico
• Solter e Surani
(1980):trapianti di nuclei.
Embrioni di topo
manipolati in modo da
contenere due genomi
materni o due genomi
paterni non si
sviluppavano
correttamente.
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La scoperta dell’ Imprinting Genomico
• Embrioni con 2 nuclei
derivati dalla madre si
sviluppano piu’ o meno
regolarmente
(inizialmente) ma con
minimo sviluppo delle
membrane
extraembrionali
(placenta)
• Embrioni con 2 nuclei
paterni hanno membrane
extraembrionali
relativamente normali ma
strutture embrionali
altamente anormali
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Conferma dell’importanza dell’Imprinting
genomico in condizioni umane
• Mola idatiforme= tumore placentare umano
causato dalla presenza di due corredi aploidi
di origine paterna, senza contributo materno.
• Teratoma ovarico= tumore ovarico derivato
da cellule contenenti due genomi femminili
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Altre osservazioni
• Gravidanze umane con assetto triploide
hanno caratteristiche diverse a seconda che il
genoma in più sia materno o paterno.
• Caratteri autosomici dominanti che si
manifestano solo quando ereditati da un
genitore.
• La delezione di certe regioni cromosomiche
dà un certo fenotipo a seconda che si trovi sul
cromosoma paterno o materno.
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QUANTI SONO I GENI IMPRINTED
• Ad oggi sono stati identificati 156 geni
sottoposti ad imprinting nel genoma dei quali
60 possono influenzare lo stato di salute.
• Nell’uomo quasi tutti i cromosomi presentano
geni imprinted. I cromosomi maggiormente
coinvolti sono il cromosoma 2, 6, 7, 11, 14,
15, 16, 20.
• Sono spesso geni coinvolti nel controllo della
crescita fetale.
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CARATTERISTICHE DEI GENI IMPRINTED
• Tendenza a formare cluster (80%);
• Metilazione differenziale dei due alleli;
• Possono codificare sia per proteine
che RNA non tradotti.
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Metilazione del DNA
Addizione covalente di gruppi metilici
alle basi del DNA. Negli eucarioti
consiste principalmente nella
metilazione delle citosine ed e’
associata a ridotti livelli di trascrizione
dei geni. Ad esempio nelle femmine di
mammiferi il cromosoma X inattivo e’
estesamente metilato.
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METILAZIONE DIFFERENZIALE
(presenza di differentially methylated regions: MDRs)
HA UNA RUOLO FONDAMENTALE NEL MANTENERE
L’IMPRINTING
• La metilazione può essere
introdotta nella linea germinale
e mantenuta durante lo
sviluppo in tutte le cellule.
• Può esserci una modificazione
della metilazione durante lo
sviluppo in alcuni tessuti.
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Genomic Imprinting and Human Disease
Syndromes involving imprinted
genes
Complex genetic diseases with
parent-of-origin effects
Beckwith–Wiedemann syndrome
Asthma, atopy
Prader–Willi syndrome
Autism
Angelman syndrome
Hirschsprung disease
Silver–Russell syndrome
Cornelia de Lange syndrome
Transient neonatal diabetes mellitus
Psoriasis
PHP1b, Albright hereditary
osteodystrophy
Handedness
Familial nonchromaffin paraganglioma
Type II diabetes
Maternal and paternal UPD14 syndromes
Alcoholism
Type I diabetes
Alzheimer disease
Syndromes that probably involve
imprinted genes
Turner syndrome phenotypes
Bipolar affective disorder
Schizophrenia
Familial pre-eclampsia
Maternal UPD2 syndrome
Maternal UPD16 syndrome
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IMPRINTING E MALATTIE
GENETICHE
• Delezione del gene;
• Mutazioni del centro dell’imprinting;
• Disomia uniparentale (UDP).
• SINDROME DI
BECKWITH-WIEDEMANN
• SINDROME DI SILVER RUSSEL
11p15.5
• SINDROME DI PRADER-WILLI
• SINDROME DI ANGELMAN.
15q11-13
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Sindrome di Prader - Willi
• Ipotonia, debole succhiatura
• Testicoli ritenuti (M)/Labbra
ipoplastiche (F)
• Iperfagia (2 - 3 anni)⇒ OBESITA’
• Facies: stretto diametro bitemporale
occhi a mandorla, strabismo
• Bassa statura, piccole mani e piedi
• Capelli chiari e ipopigmentazione
• RITARDO MENTALE medio
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Sindrome di Angelman
• Inappropriati accessi di riso
• Andatura atassica (a marionetta)
• EPILESSIA
• Facies: bocca larga, lingua protrusa, labbro sup. sottile, mandibola prominente
• Ipopigmentazione
• RITARDO MENTALE grave con assenza di parola
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Prader-Willi (PWS)
Angelman (AS)
• Ipotonia, debole, succhiatura
• Inappropriati accessi di riso
• Testicoli ritenuti (M)/Labbra
• Andatura atassica (a marionetta)
ipoplastiche (F)
• EPILESSIA
• Iperfagia (2 - 3 anni)⇒ OBESITA’
• Facies: bocca larga, lingua protrusa
• Facies: stretto diametro bitemporale
labbro sup. sottile, mandibola
occhi a mandorla, strabismo
prominente
• Bassa statura, piccole mani e piedi
• ASSENZA DELLA PAROLA
• Capelli chiari e ipopigmentazione
• Ipopigmentazione
• RITARDO MENTALE medio
• RITARDO MENTALE grave
LA MAGGIOR PARTE DEI CASI SONO SPORADICI
In entrambe le sindromi si trovano anomalie della
stessa regione del cromosoma 15 (delezione 15q11-q13)
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L’analisi molecolare ha dimostrato che è deleto lo stesso intervallo
La differenza del fenotipo è dovuta alla
differente origine parentale della delezione
Delezione dell’allele paterno ⇒ PWS
Delezione dell’allele materno ⇒ AS
Ci sono due o più geni "imprinted " in
maniera opposta nella regione deleta
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Il gene(i) PWS è espresso
Esclusivamente nell’omologo
paterno
Il gene AS (UBE3A) è espresso
esclusivamente nell’omologo
materno
La delezione dell’
allele espresso
determina nullisomia
IMPRINTING
La copia paterna e la copia materna di un gene sono
espressi DIFFERENTEMENTE
Il pattern di eredità è deviato rispetto alle regole mendeliane
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Disomia Uniparentale
presenza di due copie dello stesso
cromosoma ereditate dallo stesso genitore, mentre nessuna copia viene
dall’altro genitore
Materna
M
M
Paterna
P
P
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70 %
PWS
Delezione 15 q
visibile al cariotipo
75%
UPD = uniparental
20-25 %
disomy (disomia
uniparentale)
restanti
casi
2 %
Mutazioni puntiformi
nei geni AS
20% (UBE3A)
UPD =
eredità di entrambi i cromosomi omologhi da un singolo
genitore
UPD Materna ⇒ PWS ( = delezione omologo paterno)
UPD Paterna ⇒ AS ( = delezione omologo paterno)
Il meccanismo alla base sarebbe una non disgiunzione nella meiosi materna
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The PWS/AS Imprinting Cluster
*
*Candidate PWS genes
*
*
* Angelman gene Scaricato da www.sunhope.it
Beckwith-Wiedemann syndrome
(BWS, 1/13700)
overgrowth
macroglossia
• neonatal hypoglycemia
• visceromegaly
• ear pits/creases
abdominal wall defects
• naevus flammeus
• hemihypertrophy
• increased susceptibility
to childhood tumours
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Silver-Russell syndrome (SRS)
congenital
dwarfism
body
asymmetry
triangular
face
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NAP1L4
TSSC3
TSSC5
CDKN1C
Nap1l4
Tssc3
Tssc5
Cdkn1c
IC2
H19
Th
Ins2
Igf2
Ascl2
Kcnq1
Ltrpc5
Tssc4
Cd81
Tssc6
Kcnq1ot1/
Lit1
RPL23
H19
TH
INS
IGF2
ASCL2
TSSC6
TSSC4
CD81
KCNQ1
LTRPC5
KCNQ1OT1/
LIT1
CARS
cen
Cars
11p15.5 Imprinting Cluster
Domain 1
Human 11p15.5
IC1
tel
IC1
100kb
John et al.,
1998
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H19
IGF2
KCNQ1OT1/
LIT1
CDKN1C
Pathogenesis of BWS
cen
tel
IC1
IC2
Domain 2
Domain 1
Excess of paternally expressed genes
Defect of maternally expressed genes
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H19
IGF2
KCNQ1OT1/
LIT1
CDKN1C
Pathogenesis of SRS
cen
tel
IC1
IC2
Domain 1
Excess of maternally expressed genes
Defect of paternally expressed genes
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La genetica della sindrome BWS
• Mutazioni loss of function del gene CDKN1C
(40% familiari e nel 5% sporadici)
• uniparental disomy paterna (UPD) di 11p15.5
(1%)
• Mutazioni nel centro dell’Imprinting
• Aumento di metilazione del DNA materno
(ICD1)
• Perdita della metilazione del DNA materno ICD2
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LA GUERRA TRA I SESSI
Osservazione: i geni imprinted influenzano la crescita
fetale (molti geni imprinted sono espressi nella
placenta) e ciò avviene potenzialmente in modo
antagonistico:
• i geni espressi dal cromosoma paterno aumentano
la crescita;
• i geni espressi dal cromosoma materno la
sopprimono
TEORIA DEL CONFLITTO PARENTALE
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MODELLO DEL CONFLITTO
PARENTALE
• I geni espressi dal cromosoma paterno sono
selezionati in modo da estrarre maggiori risorse dalla
madre per incrementare il benessere della propria
prole.
• I geni espressi dal cromosoma materno tendono a
conservare le risorse per dividerle tra un maggior
numero di figli (magari con un diverso padre) in modo
da aumentare le proprie capacità riproduttive.
SPECIAZIONE
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REGOLA
LE MALATTIE MONOGENICHE SI TRASMETTONO
SECONDO PATTERN BEN DEFINITI (AD, AR, XL)
ASSENZA DI RISCHIO DI RICORRENZA NELLE
MUTAZIONI DE NOVO
PER UN LOCUS AUTOSOMICO IL FIGLIO EREDITA
UN ALLELE DA CIASCUNO DEI DUE GENITORI
ENTRAMBI GLI ALLELI DI UN LOCUS AUTOSOMICO SONO UGUALMENTE ESPRESSI
LE MUTAZIONI SONO STABILI
ECCEZIONE
⇒
⇒
⇒
⇒
⇒
EREDITA’ MITOCONDRIALE
Es. Neuropatia ottica di Leber
MOSAICISMO GERMINALE
Es. Osteogenesis imperfecta
DISOMIA UNIPARENTALE
Es. PWS e AS
IMPRINTING
Es. Prader Willi /Angelman
MUTAZIONI IN STABILI
X Fragile
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LA TERAPIA GENICA
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1-Definizione e principi
2-Strumenti (Vettori)
3-Strategie
4-Trials Clinici
5-Successi e fallimenti
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Terapia Genica
Trattamento di Malattie attraverso il Trasferimento e
l’Appropiata Espressione di una Informazione Genica
Funzionale in una Cellula Bersaglio
Terapia Genica
trattamento di malattie attraverso il trasferimento di
materiale genetico [DNA RNA]
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Il Dogma:
DNA
DNA
nucleus
cytoplasm
RNA
mRNA
AAAA
PROTEIN
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Strategie Terapeutiche
germinale non accettata su base Etico Scientifica
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Strategie Terapeutiche
Terapia Genica In Vivo
Terapia Genica Ex Vivo
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Strategie Terapeutiche
Trasferimento genico in vivo
Fibrosi Cistica
- Tessuto Specifico
- Gene Specifico
Tumore Cerebrale
- Cellula Specifico
- Gene Esogeno
Emofilia
- Tessuto Aspecifico
- Gene Specifico
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1-Definizione e principi
2-Strumenti (Vettori)
3-Strategie
4-Trials Clinici
5-Successi e fallimenti
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IDEALMENTE:
• Sistema di Trasferimento Genico Efficiente
e Specifico
• Espressione Stabile, Costante/Modulabile
• Mancanza di Tossicita’
• Non immunogeno
• Facilita’ di Produzione
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Trasferimento Genico
Metodi per Introdurre Acidi Nucleici in Cellule
Vettore = Agente che Permette l’ Ingresso del Gene
Terapeutico
Vettori Virali
Interazione con un Recettore della Cellula Bersaglio
Vettori Non Virali
Interazione Fisica con la Membrana Cellulare
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Vettori Non Virali
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Infezione (Virus)
Trasduzione (Vettore)
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I Virus Rappresentano Vettori Naturali Altamente Evoluti
per il Trasferimento di Informazione Genica Estranea
Ciclo Vitale del Virus
Infezione / Replicazione
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Conversione di un virus in un vettore:
eliminazione dal genoma dei geni virali…..
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…che vengono poi provvisti in trans nel processo
di produzione del vettore
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Trasferimento Genico
Vettorologia: Sviluppo di Nuovi Agenti per il
Trasferimento Genico
Retrovirus
Adenovirus
Adeno-Associated virus
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1-Definizione e principi
2-Strumenti (Vettori)
3-Strategie
4-Trials Clinici
5-Successi e fallimenti
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Malattie Genetiche
Recessive
Dominanti
Malattie Multifattoriali
Cancro
Malattie Cardiovascolari
Diabete
Malattie Infettive
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Espressione del Gene Terapeutico
Espressione Stabile
MALATTIE GENETICHE
Espressione Regolata
DIABETE
Espressione Transiente
TUMORI
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Le Mutazioni Possono Causare:
MUTANT DNA
MUTANT mRNA
AAAA
MUTANT
PROTEIN
Perdita di Funzione
Acquisizione di Funzione
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Strategia per Perdite di Funzione
Virus Ricombinante: Vettore
DNA
nucleus
mRNA
cytoplasm
AAAA
PROTEIN
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Strategia per l’ Acquisizione di Funzione
RNAi
AAAA
control.RNAi
VEGF.RNAi
Decreased CNV w/ RNAi vs.
VEGF
Reich et al, 2003 Mol Vis
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1-Definizione e principi
2-Strumenti (Vettori)
3-Strategie
4-Trials Clinici
5-Successi e fallimenti
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La Terapia Genica Rimane Confinata Alla Medicina Sperimentale
Tuttavia …
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1-Definizione e principi
2-Strumenti (Vettori)
3-Strategie
4-Trials Clinici
5-Successi e fallimenti
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Ragazzo di 18 anni affetto iniettato con 6x10e11 particelle/kg
Segni di sofferenza mentale 18 ore dopo la somministrazione, Coagulazione intravascolare disseminata e morte 96 ore dopo
polmone
fegato
milza
midollo
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Il pz, OTC19, mostra innalzamento patologico di alcune
citochine pro-infiammatorie. Questo studio ha stabilito la
dose letale di Adenovirus ed ha raffreddato l’
entusiasmo nei confronti della terapia genica.
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Terapia genica ex vivo in 10 pazienti con deficit di ADA e Immunodeficienza Severa Combinata: a 8 anni di distanza dal primo paziente trattato nessun serio evento avverso e tutti
I pazienti fanno una vita normale senza dover assumere ADA
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Primo trial clinico di terapia genica per una malattia ereditaria della retina. Risultati a breve termine mostrano sicurezza ed efficacia alla dose bassa del trattamento
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In conclusione….
• Come in ogni altra terapia sperimentale
esistono difficolta’ tecniche e rischi…
ma si intravedono anche i primi
successi clinici!
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