Seconda Università degli Studi di Napoli
DiSTABiF
Anno Accademico 2015-16
Corso di Laurea Magistrale in
SCIENZE DEGLI ALIMENTI E DELLA NUTRIZIONE UMANA
Insegnamento di
BIOCHIMICA e BIOTECNOLOGIE
degli ALIMENTI
Prof. Augusto Parente
Lezione 23
ENZIMI IMMOBILIZZATI
I processi biotecnologici che utilizzano ENZIMI possono avvenire o
con enzima libero (disperso nel reattore), oppure con enzima
“immobilizzato”:
i) fisicamente confinato
ii) localizzato in una certa regione spaziale
iii) legato ad una matrice di supporto.
VANTAGGI DEGLI ENZIMI IMMOBILIZZATI
1. Uso ripetitivo di un’unica preparazione di enzima
2. Aumentata stabilità dell’enzima, limitando le possibilità di una
sua denaturazione anche in presenza di solventi organici
3. L’enzima non rimane nel prodotto e quindi non c’è necessità di
ulteriori passaggi di purificazione
4. La reazione può essere facilmente controllata aggiungendo o
rimuovendo l’enzima.
5.
Abbattimento dei costi di approvvigionamento
biocatalizzatori, grazie al possibile riutilizzo dell’enzima
dei
6.
Possibilità di conferire particolari caratteristiche di reazione
o di modificare i parametri cinetici del biocatalizzatore
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Esistono varie tecniche di immobilizzazione che si basano su uno dei
principi riportati di seguito e che considerano sia la natura della
interazione che determina la immobilizzazione che quella del
supporto sul quale l’enzima viene immobilizzato:
1- Adsorbimento
2- Accoppiamento (legame) covalente
3- Cross-linking
4- Intrappolamento fisico o incapsulamento in matrice
a- Adsorbimento su di un supporto minerale
(argilla o vetro) oppure organico (cellulosa, amido,
ciclodestrine, collagene, resina), grazie a legami
deboli (forze di Van der Waals, legami idrogeno,
legami ionici, legami con metalli);
b- Legame covalente ad un supporto minerale oppure
organico come riportato sopra.
L’immobilizzazione avverrà in due tempi: i) dapprima si
lega al supporto una molecola corta (bifunzionale), che ii)
poi reagirà con il suo secondo gruppo funzionale con un
gruppo funzionale della proteina enzimatica;
c- Cross-linking tra sole molecole dell’enzima oppure
includendo anche il carrier.
d- Intrappolamento o incapsulamento dell’enzima in
matrice in una rete polimerica preparata a partire da una
soluzione di monomeri chimici nella quale l’enzima viene
introdotto allo stato disperso.
L’enzima viene intrappolato quando i monomeri
polimerizzano.
a
1
2
ENZIMI IMMOBILIZZATI- Rappresentazione schematica
Legame a carriers: accoppiamento dell’enzima ad un carrier con
legami deboli (ionico, a idrogeno, forze di van der Waals,, con metalli) o
covalenti;
Cross-linking: legame delle molecole di enzima tra loro, con o senza la
partecipazione del carrier. Accoppiamento
Al
C= carrier
ENZIMI IMMOBILIZZATI- Rappresentazione schematica
Confinamento dell‘enzima in un’area ristretta da cui non può uscire ma in cui rimane
attivo (intrappolamento in una matrice solida).
Intrappolamento
Da parte di membrane
semipermeabili
In matrice
Gel o
polimero
Micella
inversa
Fibra
cava
Reattore a membrana
ENZIMI IMMOBIZZATI
.
Nella preparazione di Enzimi Immobilizzati
vanno considerati
ENZIMA
Proprietà Biochimiche
Tipo di reazione e cinetica
SUPPORTO
1
Caratteristiche Chimiche
3
2
Proprietà Meccaniche
4
Metodi di Immobilizzazione
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Enzima
1
Proprietà Biochimiche
• Peso Molecolare
• Gruppi Funzionali sulla
superficie della Proteina
• Purezza
2
Parametri Cinetici
• Attività Specifica
• pH optimum
• Temperatura ottimale
• Attività e Inibizione
• Stabilità
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Supporto
3
Caratteristiche Chimiche
• Composizione Chimica
• Gruppi Funzionali
• Volume e Dimensione dei
Pori
• Stabilità Chimica (intervallo
di pH)
4
Proprietà Meccaniche
• Diametro delle particelle
• Resistenza al flusso del
Substrato e Velocità di
sedimentazione (per
l’utilizzo di bioreattori)
ENZIMI IMMOBILIZZATI: Adsorbimento
L’adsorbimento di un biocatalizzatore su un carrier insolubile in
acqua è il metodo più vecchio ed il più largamente usato.
Le perdite di attività sono normalmente basse, ma piccoli
cambiamenti dei parametri di reazione, come la variazione della
concentrazione del substrato, della temperatura e del pH,
possono causare il desorbimento dell’enzima dal carrier.
Numerosi materiali organici ed inorganici sono usati come
carriers: carboni attivati, ossido di alluminio, celite, cellulosa e
resine sintetiche.
L’adsorbimento è il metodo migliore quando gli enzimi sono usati
in solventi organici perché non avviene il fenomeno di
desorbimento.
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Adsorbimento fisico Le interazioni si basano su legami deboli del tipo
forze di Van der Waals, di bassa e media intensità fra la proteina
enzimatica e la superficie del supporto, determinate mescolando una
soluzione concentrata dell'enzima con il solido. I supporti disponibili
sono sia organici che inorganici come quarzo, carbone attivo, vetro
poroso e argilla.
E’ caratterizzato da grande semplicità operativa, basso costo e bassa
inattivazione. Il principale svantaggio è rappresentato dalla possibile
perdita dell’enzima.
Adsorbimento chimico -> interazione ionica attrazione tra gruppi di
carica opposta.
La scelta delle matrici è svolta in funzione della carica netta dell’enzima
e dei gruppi funzionali ionizzabili. Industrialmente sono usate sia le
resine a scambio cationico (carbossimetil cellulosa, amberlite) che
quelle a scambio anionico (dietilamminoetil-cellulosa o -Sephadex).
SEGUE: Adsorbimento chimico -> interazione ionica
L’interazione ionica dà intensità di legame maggiore del semplice
adsorbimento, ma è pur sempre un legame reversibile.
In genere, sono possibili piccoli cambiamenti conformazionali del sito
attivo, ma l’attività in molti casi è alta.
Lo svantaggio principale legato a tale metodo è il rilascio dell’enzima dal
trasportatore dovuto ad una elevata forza ionica* e a variazioni di pH.
Interazione con metalli un enzima può interagire con uno ione
metallico, come zinco, rame, calcio e altri, complessato con la matrice,
mediante gruppi funzionali chelanti. L’enzima mantiene alta la propria
attività specifica, ma la stabilità del sistema è variabile, in particolare è
bassa con substrati ad alto peso molecolare.
Sono coinvolti amminoacidi quali His, Cys.
* = 1 cz2
2
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Legame Covalente
Il legame di tipo covalente di un enzima al carrier è certamente molto
stabile e la rottura del legame è piuttosto improbabile.
Lo svantaggio è che per legare l’enzima si impiegano normalmente
condizioni piuttosto drastiche con una normale perdita di attività dovuta
alla variazione di conformazione.
I gruppi funzionali dell’enzima normalmente coinvolti nel legame sono:
• gruppo amminico (Lys)
• gruppo carbossilico (Asp, Glu)
• gruppo sulfidrilico (Cys)
• gruppo ossidrilico (Ser, Thr)
• gruppo imidazolico (His)
• gruppo fenolico (Tyr)
• gruppo indolico (Trp)
(a) Activation of Sepharose by cyanogen bromide. Conditions are
chosen to minimise the formation of the inert carbamate.
(b) Chloroformates may be used to produce similar intermediates to those produced by
cyanogen bromide but without its inherent toxicity.
(c) Carbodiimides may be used to attach amino groups on the enzyme to
carboxylate groups on the support or carboxylate groups on the enzyme to amino
groups on the support. Conditions are chosen to minimize the formation of the
inert substituted urea.
(d) Glutaraldehyde is used to cross-link enzymes or link them to supports. It usually
consists of an equilibrium mixture of monomer and oligomers. The product of the
condensation of enzyme and glutaraldehyde may be stabilised against dissociation by
reduction with sodium borohydride.
(e) The use of trialkoxysilane to derivatise glass. The
reactive glass may be linked to enzymes by a number of
methods including the use thiophosgene, as shown.
CONFRONTO DI DIFFERENTI TECNICHE DI IMMOBILIZZAZIONE.
CARATTERISTICHE
Preparazione
Costo
Forza di legame
Perdita dell’enzima
Applicabilità
Problemi operativi
Effetti di matrice
Elevati effetti di
matrice
Protezione
microbica
Adsorbimento
Semplice
Basso
Variabile
Sì
Ampia
Alti
Sì
Legame Intrappo= Confinamento
covalente lamento in membrane
Difficile
Difficile
Semplice
Alto
Moderato
Basso
Forte
Debole
Forte
No
Sì
No
Selettiva
Ampia
Molto ampia
Bassi
Alti
Alti
Sì
Sì
No
No
No
Sì
Sì
No
No
Sì
Sì
