PEPTIDI (PROTEINE) Polimeri costituiti da monomeri relativamente semplici: gli amminoacidi. Hanno proprietà biologiche molto varie (ad es., antibiotici, ormoni, additivi alimentari, antidolorifici, ecc.) DEFINIZIONI Õ Gli amminoacidi sono tenuti insieme con legami ammidici; il legame ammidico viene chiamato anche legame peptidico Õ Gli amminoacidi che fanno parte di un peptide o di una proteina si dicono residui La distinzione tra proteine e peptidi è formale e di riferisce alle dimensioni: PEPTIDI polimeri costituiti da meno di 50 residui di amminoacidi; di solito non hanno una struttura tridimensionale ben definita. PROTEINE polimeri costituiti da almeno 50 residui (fino a oltre 1000); hanno strutture tridimensionali ben definite, da cui dipendono le proprietà biologiche. Per peptidi e proteine si definiscono: Struttura primaria è la sequenza dei residui Struttura secondaria si riferisce ad aspetti strutturali specifici all'interno di una molecola Struttura terziaria è la forma tridimensionale complessiva della molecola Struttura quaternaria quando unità separate di proteine sono bloccate insieme(per esempio, emoglobina, tropocollagene) PROPRIETA' CHIMICHE DEL LEGAME PEPTIDICO R H N .. C R' O R 1 H + N C R' -O 1. Il legame peptidico è piuttosto inerte. N non è né nucleofilo né basico. Perché gli elettrofili reagiscano con C=O servono condizioni drastiche 2. Il gruppo ammidico può talvolta funzionare da nucleofilo (in tal caso il centro nucleofilo è l'O). 3. Il gruppo ammidico è planare (importante per la forma tridimensionale). PROPRIETA' BIOLOGICHE DI PEPTIDI E DI AMMINOACIDI Non è necessario avere lunghe catene polimeriche per avere attività biologica Nome n. di residui GABA Glutammato monosodico Aspartame Penicillina TRH 1 1 2 3 3 Encefaline Falloina Angiotensina II Ossitocina 5 7 8 9 Gramicidina S 10 Proprietà biologiche neurotrasmettitore, implicato nel controllo degli impulsi nervosi additivo alimentare dolcificante artificiale (circa 100 volte più dolce del saccarosio) potente antibiotico (prodotto da alcune muffe) ormone che controlla il rilascio di un altro ormone (tirotrofina) ed influenza il sistema nervoso centrale. trovate nel cervello; sono peptidi coinvolti nella sensazione del dolore peptide biciclico, estremamente velenoso, in funghi non commestibili usato dal corpo per aumentare la pressione del sangue nonapeptide ormonale ciclico, che può essere usato per provocaare il travaglio decapeptide ciclico, potente antibiotico 2 1 La sequenza degli amminoacidi in molti peptidi è controllata dal codice genetico solo 20 α-amminoacidi sono codificati dal DNA anche così le combinazioni sono molte: pentapeptide 205 combinazioni 3 200 000 possibili peptidi Gli α-amminoacidi naturali (tranne la glicina) sono di serie L e di configurazione S CO2H H R H2N L Nome CO2H R NH2 (S) H struttura abbreviazioni punto catena laterale isoelettrico pKa tipo O H3C Alanina OH Ala, A 6.00 - L Arg, R 10.76 12.5 H+ Asn, N 5.41 NH2 NH Arginina H2N O N H OH NH2 O Asparagina O OH H2N Nome H 3 struttura abbreviazioni O Acido aspartico - NH2 OH punto catena laterale isoelettrico pKa tipo Asp, D 2.77 3.9 H- Cys, C 5.07 9.3 H- Glu, E 3.22 4.3 H- H OH NH2 O Cisteina HS OH NH2 O Acido glutammico O HO NH2 O Glutammina OH O H2N Gln, Q 5.65 - Gly, G 5.97 - OH NH2 O Glicina OH NH2 O Istidina (Histidine) N N OH NH2 His, H 7.59 6.1 H 4 2 Nome struttura abbreviazioni punto catena laterale isoelettrico pKa tipo O Isoleucina Ile, I 6.02 - L Leu, L 5.98 - L Lys, K 9.74 10.5 H+ Met, M 5.74 - L OH Phe, F 5.48 - L Pro, P 6.30 - L OH NH2 O Leucina OH NH2 Lisina H2N O OH NH2 O S Metionina NH2 OH O Fenilalanina (Phenylalanine) NH2 O Prolina OH N Nome 5 H struttura abbreviazioni punto catena laterale isoelettrico pKa tipo O Serina HO OH Ser, S 5.68 - - Thr, T 5.60 - - Trp, W 5.89 - L NH2 OH O Treonina OH NH2 O Triptofano OH NH2 N H O Tirosina OH Tyr, Y 5.66 9.1 L Val, V 5.96 - L NH2 HO O Valina OH NH2 H = idrofilo; L = lipofilo (idrofobo) 6 3 Amminoacidi "non usuali" Moltissimi amminoacidi presenti in natura non sono codificati dal DNA. Sono meno abbondanti di quelli codificati Catene laterali insolite esempi: Cl S H H N H N CO2H O CO2H H2N CH2CH2 CH2 C CO2H H CO2H H HO2C H N H NH2 CO2H CH2 C CH CH2 C CO2H H2N CH2CH2CH2 CH2 C H NH2 H NH2 Ornitina H NH2 Lisina presente in molti peptidi naturali (antibiotico) HO H N CO2H H Prolina H N H CO2H Idrossiprolina costituente principale del collagene β-amminoacidi esempi: CO2H H 2N H 2N CO2H 7 γ-amminoacidi OH H2N esempi: GABA CO2H CO2H acido 4-amminobutanoico entra nella trasmissione degli impulsi nervosi NH2 D-amminoacidi NH2 esempi: CH2 C H CO2H D-Phe H3C CH C H3C NH2 H CO2H CO2H N H H D-Pro D-Val sono sintetizzati da diversi organismi e sono importanti costituenti di antibiotici altri esempi: H3C + H3C N CH2 CO2 H3C Betaina agente metilante, entra nella biosintesi della metionina H2N CH2 CO2H Glicina 8 4 CLASSIFICAZIONE E PROPRIETA' FISICHE DEGLI α-AMMINOACIDI Gli amminoacidi vengono classificati, a seconda della natura della catena laterale, in: Amminoacidi "acidi“ contengono nella catena laterale un altro gruppo -CO2H contengono nella catena laterale un altro gruppo -NH2 Amminoacidi "basici“ polari contengono nella catena laterale un eteroatomo non polari la catena laterale è idrocarburica Amminoacidi "neutri" Gli α-aminoacidi naturali sono composti solidi cristallini, alto-fondenti, solubili in acqua Le proprietà fisiche sono diverse da quelle di acidi o ammine con lo stesso numero di atomi di C RCO2H pKa ~ 5 RNH2 pKb ~ 4 pKa ~ 10 pKb ~ 12 H2N CH CO2H R ? Allo stato solido gli α-amminoacidi sono "ioni dipolari" (zwitterioni) + H3N CO2C Il centro acido è -NH3+, il centro basico è -CO2- H R 9 IN SOLUZIONE ACQUOSA LA STRUTTURA PREVALENTE DIPENDE DAL pH In soluzione acquosa -NH3+ è più forte come acido di quanto -CO2- sia forte come base Come risultato della differenza di forza tra il centro acido ed il centro basico, UNA SOLUZIONE ACQUOSA DI ALANINA (amminoacido neutro non polare) CONTIENE PIU' ANIONI CHE CATIONI A pH 7 l'alanina ha una carica globale negativa. CO 2 + H3N H C base (più debole) + H2 O H2N C H + H3 O + R R acido (più forte) CO2- si comporta da base carica globale negativa Per tornare allo ione dipolare bisogna aggiungere H3O+ A pH 6 l'alanina ha una carica globale nulla. CO 2 H2N C R H + H3O + + H3 N CO2C H + H2O R 10 carica globale nulla 5 CO2H H2 N + H3 N H C CH3 CO2H C R L’alanina NON E’ MAI così L’alanina è così allo stato solido e al punto isoelettrico Si definisce PUNTO ISOELETTRICO quel valore di pH al quale l'amminoacido esiste in prevalenza come ione dipolare (complessivamente neutro). Al punto isoelettrico la concentrazione della forma cationica e di quella anionica sono uguali (e molto basse). Per un amminoacido "neutro" il punto isoelettrico (che dipende soprattutti dai valori del pKa di NH3+ e del pKb di -CO2-) è attorno a 5.5-6.0. CO2H2N C H+ + H3N H OH- R CO2C H+ H OH- R prevalente a prevalente a R prevalente a pH = pI pH > pI CO2H + H3N C H pH < pI 11 Ogni amminoacido ha un punto isoelettrico diverso In un amminoacido "acido" c'è un altro gruppo (il secondo carbossile) che reagisce con l'acqua (è il centro acido più forte) Una soluzione acquosa di un amminoacido "acido" è decisamente acida: + H3N acido (più debole) CO - base (più debole) 2 C + H 2O H CH2 CH2 CO2H acido (più forte) CO2+ H3N C H + H3O+ CH2 CH2 CO2si comporta da base carica globale negativa Per portare un amminoacido "acido" al punto isoelettrico E' NECESSARIA UNA CONCENTRAZIONE DI H3O+ MAGGIORE che per un amminoacido "neutro". Il punto isoelettrico di amminoacidi "acidi" è ~ pH 3. 12 6 In un amminoacido "basico" c'è un altro gruppo (il secondo gruppo amminico) che reagisce con l'acqua (è il centro basico più forte) Una soluzione acquosa di un amminoacido “basico" è decisamente basica + H 3N acido (più debole) base (più debole) CO 2 C + H2O H CH2 CH2 CH2 CH2 NH2 si comporta da acido base (più forte) CO2+ H 3N C H + OH+ CH2 CH2 CH2 CH2 NH3 carica globale positiva Per neutralizzare un amminoacido "basico" e portarlo al punto isoelettrico BISOGNA AGGIUNGERE IONI OH-. Il punto isoelettrico di amminoacidi "basici" è nell'intervallo 9-10 di pH. 13 TITOLAZIONE DELLA GLICINA + H3N CH2 CO2H + H2O K1 + + H3N CH2 CO2 + H3O Quando sono stati aggiunti 0.5 equivalenti di OHK1 = [H3O+] K1 = + [H3O+] [ H N CH CO ] 2 2 3 + [ H3N CH2 CO2H ] = 10-2.4 pKa1 = 2.35 Aggiungendo altro OH-: + H3N CH2 CO2 + H2O K2 H2N CH2 CO2 + H3O+ Quando sono stati aggiunti 1.5 equivalenti di OH- K1 = [H3O+] [ H2N CH2 CO2- ] + [ H N CH2 CO2 ] 3 al punto isoelettrico specie prevalente = 10-9.78 K2 = [H3O+] pKa2 = 9.78 + [ H2N CH2 CO2- ] = [ H3N CH2 CO2H ] + H3N CH2 CO2 14 7 + [ H3N CH2 CO2H ] x 10-2.4 [ H3N CH2 CO2 ] = [H3O+] [H3O+] [ H N CH CO - ] + 2 2 2 [ H N CH2 CO2 ] = 3 -9.78 10 Dal primo equilibrio Dal secondo equilibrio [ H3N CH2 CO2H ] x 10-2.4 [H3O+] = [H3O+] [ H N CH CO - ] 2 2 2 10-9.78 + 10-12.2 [ H3N CH2 CO2H ] 2 [H3O+] = [ H2N CH2 CO2 ] [H3O+] = al punto isoelettrico 10-12.2 Per gli amminoacidi "neutri" il valore del punto isoelettrico è determinato dall'effetto induttivo del gruppo R aumenta l'acidità, diminuisce la basicità il fenile ha effetto -I 15 Confronto fra le curve di titolazione di glicina e fenilalanina Curva di titolazione dell’acido glutammico (amminoacido “acido”) pKa=2.19 + H3N pKa=9.67 CO2H C pI = H pKa1 + pKa2 2 = 2.19 + 4.25 2 = 6.44 2 = 3.22 CH2 CH2 CO2H acido glutammico pKa=4.25 16 8 Curva di titolazione della lisina (amminoacido “basico”) + H3N pKa=8.95 pKa=2.18 CO2H C H + CH2 CH2 CH2 CH2 NH3 lisina pI = pKa2 + pKa3 2 = 19.74 2 = pKa=10.79 8.95 + 10.79 2 = 9.87 E’ significativo confrontare la carica complessiva dei quattro amminoacidi a pH diversi 17 IDROFILICITA'/LIPOFILICITA' La catena laterale degli amminoacidi ne influenza la solubilità Il fatto che tutti gli amminoacidi allo stato solido esistano come ioni dipolari li rende più solubili nei solventi polari che in quelli non polari. Amminoacidi (e peptidi) di solito sono solubili in acqua, ma spesso si sciolgono con difficoltà nei solventi organici le solubilità relative nei diversi solventi dipendono dalla natura della catena laterale in H2O (polare protico) Ser > Gly > Phe in CHCl3 (poco polare) Gly ~ Ser ~ Phe in benzene (non polare) Phe > Gly > Ser Gli amminoacidi "acidi", "basici" o "neutri polari" in grado di formare legami idrogeno si dicono IDROFILI ed hanno elevata solubilità in acqua. Gli amminoacidi "neutri" si dicono LIPOFILI (o IDROFOBI) e preferiscono mezzi non polari. Le proprietà fisiche degli amminoacidi sono determinate da tre fattori principali: - la carica complessiva ad un dato pH - il pH al quale c'è carica complessiva zero (pI) - l'idrofilicità o la lipofilicità delle catene laterali. 18 9 SINTESI DI α-AMMINOACIDI Amminazione di α-alogenoacidi 1. CH3CH2 CO2H P/Br2 NH3 CH3CH CO2H in eccesso Br CH3CH CO2- NH4+ NH2 E’ il metodo più semplice, ma il MENO UTILE in pratica, perché l’amminoacido prodotto è ancora nucleofilo e può reagire con il bromoacido. CH3CH CO2- NH4+ CH3CH CO2- NH + 4 NH CH3CH CO2 NH4+ NH2 + Br- CH3CH CO2H Prodotto indesiderato. Si abbassano le rese e si deve separare Br utile solo per preparare industrialmente la glicina 2. Sintesi di Gabriel O O N - K+ + R O H2O, H+ N CH CO2CH3 O CH CO2CH3 KBr Br O R R + OH H3N CH CO2H + OH O 19 3. Alchilazione di derivati dell'estere malonico CO2CH3 CH2 CO2CH3 1) CH3ONa CO2CH3 CH Br 2) Br2 CO2CH3 NH3 in eccesso CO2CH3 NH4Br CO2CH3 CO2CH3 1) CH3ONa CH2 C NH C R O 2) RX CO2CH3 CH NH2 H+ OH CH2 C O CO2CH3 PhCH2OCOCl CH2 C NH CH O CO2H + H3N C R CO2H Δ + NH CO2CH3 3 R CH CO2H CO2 in alternativa: O CO2CH3 N- K+ CH Br + CO2CH3 H+ H2O + NH O CO2CH3 O 1) CH3ONa CH N CO2CH3 O 3 R CH CO2H + CH3OH + 2) RX CO2CH3 O R C N CO2CH3 O CO2H CO2H 20 10 4. O R Sintesi di Strecker NH OH R CH NH2 .. + NH3 H H2O R H :CN 2) H+ NH2 + NH3 R CH CO2H H2O R CH C N H+ Tutti i metodi precedenti portano a miscele racemiche RISOLUZIONE DI MISCELE RACEMICHE DEGLI α-AMMINOACIDI 1) Metodi chimici Qualche volta è possibile la formazione di sali con un controione chirale, che può precipitare preferenzialmente con l'amminoacido D o con quello L. N-acetil-(±)-amminoacido + base otticamente attiva si separano e si aggiunge acido sali diastereomeri H3C li amminoacidi basici possono essere risolti direttamente, usando l'acido (1S)-10-canforsolfonico CH3 H CH2 O SO3H Non ci sono regole per poter prevedere quale enantiomero dia il sale che precipita, né le condizioni necessarie perché la cristallizzazione avvenga. bisogna operare per tentativi. 21 2) Metodi enzimatici N-acetil-(±)-amminoacido + acilasi L-amminoacido + N-acetil-D-amminoacido solubile in acqua insolubile in acqua da rene di maiale Se occorre anche l'amminoacido D, si recupera per idrolisi 3) HPLC chirale (metodo analitico) Con un gruppo chirale legato alla fase stazionaria diventa possibile separare glienantiomeri. Sono disponibili colonne HPLC chirali che usano come componenti chirali della fase stazionaria carboidrati o proteine.Le fasi stazionarie chirali più usate sono quelle con derivati di amminoacidi legatiad un supporto di silice. OEt O H O Si O N H NO2 O NO2 fase stazionaria chiraledi Pirkle 22 11 SINTESI ASIMMETRICA 1) Uso di reagenti chirali Sono disponibili reagenti ossidanti chirali, reagenti riducenti chirali e catalizzatori chirali Esempio: .. 1) [Rh(COD)Cl]2/NaBF4 .. O P RhH(R,R-Dipamp) 2) H2 P O COD = (R,R)-Dipamp H2 O N H CO2H O H [RhH(R,R)Dipamp] CO2H N H resa 100% e.e. 96% (1972) 23 2. Uso di ausiliari chirali Nel composto di partenza c'è un gruppo chirale rimovibile, che indirizza l'andamento stereochimico nella formazione del nuovo centro chirale; alla fine del processo (e dopo la purificazione) il gruppo chirale si rimuove Esempio: O H H CH 3 N OH NH2 OR' R O 1) HNO2 H H CH 3 Al/Hg O N N CH3OCH2CH2OCH3 O R riduzione stereospecifica sulla faccia inferiore 2) LiAlH4 OH H CH 3 H2 N 1) H2/Pd C + O N OH 2) OHH R H H H CH 3 H N N O O H R 24 12 3. Sintesi chirale Si parte da materiale otticamente attivo, il cui centro chirale viene poi incorporato nel prodotto. Esempio: O HO H2N OH 2) 2 PrLi H L-Ser SH 1) HS BF3.Et2O O 1) TsCl HO HN H Ts O O HBr [O] HO HN H Ts HO HN H Ts 2) Ni Raney HO H2N H Acido D-2-amminoesanoico Resa complessiva: 24%; >99% e.e. (1984) Ci sono molti modi per preparare un dato amminoacido: quale via scegliere in un caso specifico dipende da un'accurata considerazione della struttura da preparare e dall'esame di sintesi riportate in letteratura per composti simili. 25 Esempio L'acido γ-amminobutanoico (GABA) è un neurotrasmettitore e molti suoi derivati sono stati studiati per le loro potenzialità come farmaci. Un importante derivato, il 3-idrossi (GABOB), è anch'esso un neurotrasmettitore; l'enantiomero R ha attività biologica molto maggiore dell'S. OH H2N CO2H (R)-GABOB CO2H H2N GABA acido 4-ammino-3-idrossibutanoico All'inizio è il GABOB è stato preparato come miscela racemica con metodi tradizionali. La risoluzione della miscela racemica è stata ottenuta per cristallizzazione del sale canforsolfonico dell'ammide. H3C OH H2N CH3 H H3C CH3 H + H3 N CONH2 + (R,S) CH2 O SO3H CH2 O SO3- OH OH CONH2 + H2N (R) (in soluzione) H2O, OH- precipitato cristallino CONH2 (S) OH CO2H H2N (R) (1977) questo metodo ha permesso di ottenere (R)-GABOB, ma è lungo e con sprechi 26 13 Nel 1980 è stata pubblicata una sintesi chirale a partire dall'acido ascorbico (Vitamina C) H CH2OH OH O HOH acido L-ascorbico (Vitamina C) O Metodo 3: sintesi chirale OH Sintesi lunga (nove passaggi) e resa bassa (~ 10%). Metodo 1: reagente chirale Nel 1983 è stata pubblicata una sintesi asimmetrica OH OH O 1) RuO4 O t-BuOOH/Ti(O-iPr)4 OH L-(+)Tartrato dietilico H2N 2) NH3 OH Resa globale 17%; 55% e.e. Sintesi breve (tre passaggi), ma resa scarsa ed e.e. modesto Un miglioramento si è avuto con la pubblicazione nel 1985 di una sequenza in tre passaggi che comprendono una riduzione enzimatica O lievito di birra Cl O Cl OH O 1) NMe3 OC8H17 OC8H17 2) H2O/HCl Metodo 1: reagente chirale OH O + Me3N Cl OH Resa globale 45%; >95% e.e. La difficoltà maggiore è stata la ricerca del β-chetoestere migliore 27 A tutt'oggi il metodo migliore comporta una sintesi chirale a partire dall'acido malico (acido 2-idrossibutandioico), disponibile sia come isomero R che S, anche se la sintesi è stata fatta con l'acido S-malico, meno costoso. Metodo 3: sintesi chirale O OCOCF3 OH OH HO O O acido (S)-malico NH2 O O 1) Zn(MnO4)2 2) HCl O O H+ HO O O 2) MeOH/HCl OH NH2 O O C(CH3)3 C(CH3)3 O O 1) NH3 (CF3CO)2O O 1) LiAlH4 2) (t-BuOCO)2O HO NH Boc OH NH2 Resa complessiva 25%; ~ 100 % e.e. (1987) Fra i molti metodi a disposizione la scelta può dipendere dall'importanza della purezza ottica (se per esempio l'enantiomero "sbagliato" è tossico) o dalla resa o dalla versatilità del metodo. 28 14 POLIPEPTIDI I peptidi conservano molte delle proprietà degli amminoacidi, avendo alle due estremità un gruppo acido ed un gruppo amminico. Le proprietà fisiche dei peptidi possono grosso modo essere determinate considerando insieme gli effetti di tutte le catene laterali, più quelli dei gruppi amminico e carbossilico alle estremità - cariche globali tipiche a diversi pH - punti isoelettrici caratteristici - affinità specifiche per la fase acquosa e quella non acquosa R C O H N .. R' R H + N C R' -O Legame rigido e planare Con due amminoacidi diversi si possono avere due dipeptidi diversi, a seconda di quale gruppo carbossilico e quale gruppo amminico formino il legame peptidico 29 esempio: con glicina e alanina In un peptide l’amminoacido con l’NH2 libero si chiama estremità amminica o residuo N-terminale; l’amminoacido con il gruppo –CO2H libero si chiama estremità carbossilica o residuo C-terminale; la catena che comprende i legami ammidici si chiama catena principale; i sostituenti R degli amminoacidi costituenti il peptide si chiamano catene laterali. 30 15 Per convenzione i peptidi si rappresentano scrivendo la sequenza da sinistra verso destra, a partire dall'estremità con il gruppo amminico: R' O H2N residuo N-terminale N H R primo residuo H N O O OH residuo C-terminale R" terzo residuo secondo residuo NOMENCLATURA. Il residuo C-terminale costituisce il nome base; gli altri residui si chiamano come sostituenti (desinenza -ile). O H2 N CH3 N H OH O I nomi degli amminoacidi si abbreviano con le prime tre lettere, si collegano con"-" o con "." glicilalanina O Gly-Ala H2N SH H N O H2N N CH3 H N CH3 H OH alanilglicina O Ala-Gly O OH alanilcisteinilfenilalanina Ala-Cys-Phe O Ala.Cys.Phe 31 In caso di amminoacidi sostituiti, il sostituente si può indicare di seguito alla abbreviazione del nome dell'amminoacido H2N CH CO2H CH2 CH2 CO2CH3 Me Glu H2NCH2CONH2 GlyNH2 Si presuppone che gli amminoacidi siano di serie L. Se sono di serie D, va indicato O H2N O OH CH3 D-Ala H2N N CH3 H SH H N O O OH D-Ala-Cys-Phe Quando si studiano i peptidi (e le proteine) le operazioni importanti sono: 1. Purificazione ed isolamento 2. Analisi degli amminoacidi e determinazione della sequenza 3. Sintesi 1. Perché si estrae dalla matrice biologica, insieme ad altre migliaia di composti 2. L’analisi non solo deve identificare quali amminoacidi costituiscono il peptide, ma anche la sequenza, cioè l’ordine con cui gli amminoacido sono legati tra loro, a partire dal residuo N-terminale fino al residuo C-terminale 3. Per avere quantità di peptide sufficiente per gli studi clinici, servono quantità 32 molto maggiori di quelle che si posono ottenere dalla matrice biologica. 16 PURIFICAZIONE ED ISOLAMENTO DEI PEPTIDI Oltre al pI ed alla affinità per l'acqua o per i solventi organici è importante la dimensione del 1. peptide DIALISI Con membrane semipermeabili è possibile separare molecole piccole (peptidi) da molecole grandi (proteine) Il piccolo peptide, però, sarà distribuito dentro e fuori la membrana semipermeabile. il volume esterno deve essere molto grande: quando la concentrazione dentro e fuori la membrana semipermeabile è uguale, c'è molto più peptide fuori. Quando si ha una miscela complessa, tutte le molecole al di sotto di una certa dimensione passano attraverso la membrana, tutte quelle più grandi restano nella sacca della dialisi La dialisi è un metodo per una purificazione grossolana, che permette di maneggiare grandi quantità di materiale 33 2. GEL FILTRATION La gel filtration impiega un supporto polimerico poroso. Le molecole grandi, che non entrano nei pori, vengono eluite rapidamente, mentre le molecole più piccole hanno tempi di ritenzione più lunghi. Se la miscela di peptidi è complessa, più grandi delle dimensioni dei pori verranno eluiti insieme ed insieme verranno eluiti quelli più piccoli Usando un intervallo di dimensioni dei pori, le molecole di dimensioni piccole entreranno in tutti i pori, quelle di dimensioni medie entreranno solo in alcuni, le molecole grandi non entreranno in nessuno Per molecole di dimensione intermedia diventano importanti i fattori di diffusione ed i tempi di ritenzione sono approssimativamente una funzione lineare di log(MW). Purificazione per gel filtration di una miscela con 4 peptidi di MW 5000 (A), 3000 (B), 500 (C) e 100 (D) Colonna di gel filtration con una sola dimensione dei pori Con pori di dimensione corrispondente a circa MW 1000 (~12Å) verranno eluiti prima A+B e poi C+D MW>1000 MW<1000 34 17 Colonna di gel filtration con un intervallo di dimensione dei pori I pori differiscono tra loro all’incirca di 12Å : i quattro peptidi vengono separati Questo è un profilo tipico per una gel filtration e dà anche un’indicazione del peso molecolare dei peptidi Con la gel filtration si ha un miglioramento della purezza del peptide ed una idea del peso molecolare, ma per isolare un peptide veramente puroservono altri metodi. 3. CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO Se una soluzione di una miscela di peptidi viene fatta passare lungo una colonna che contiene un supporto polimerico carico, i peptidi verranno eluiti con una velocità diversa, che dipende soprattutto dalla loro carica complessiva. La carica del polimero può essere sia positiva che negativa. 35 P O L I M E R O H2SO4 NO2 Sn/HCl NO2 + N(CH3)3 I- P O L I M E R O P O L I M E R O P O L I M E R O HNO3 + N(CH3)3 I- H2SO4 SO3 P O L I M E R O P O L I M E R O NH2 CH3I (eccesso) NH2 cromatografia a scambio di anione l'anione ioduro può essere sostituito da altri anioni SO3H NaOH SO3H P O L I M E R O SO3 Na+ SO3 Na+ cromatografia a scambio di catione il catione sodio può essere sostituito da altri cationi I peptidi carichi positivamente hanno una elevata affinità per resine anioniche e non vengono eluiti; i peptidi carichi negativamente non interagiscono con le resine anioniche e vengono36 eluiti rapidamente (il contrario si ha con le resine cationiche). 18 Per essere sicuri che tutto venga eluito in un tempo ragionevole, spesso si varia l'eluente con il tempo e questo di solito migliora anche la separazione dei componenti. Si può variare il pH o la forza ionica A = Ala-Lys B = Ala-Lys-Ala-Lys A pH <9 entrambi i peptidi vengono eluiti lentamente. Aumentando il pH entrambi vengono eluiti abbastanza rapidamente ed escono a valori di pH prossimi al loro pI C = Lys-Ala-Ala D = Lys-Glu-Lys Tra pH 3 e 10 hanno carica complessiva molto simile D contiene più gruppi polari: la sua maggiore affinità per i solventi polari è incrementata dall’aumento della forza ionica. 37 4. ELETTROFORESI Nell'elettroforesi, una miscela di peptidi viene applicata su un supporto solido; il supporto viene permeato con una soluzione di elettrolita, in modo che possa essere applicata una differenza di potenziale. Quando si fa passare la corrente, i peptidi carichi positivamente sono attratti verso il catodo, verso cui migrano. Invece i peptidi carichi negativamente migrano verso l'anodo. Il supporto più semplice è una striscia di carta ed i peptidi si applicano vicino al centro della striscia. I diversi peptidi migrano con velocità diversa a seconda della loro carica complessiva e della loro resistenza al movimento: peptidi piccoli con carica elevata migrano più velocemente. 38 19 tipico elettroforetogramma da una miscela di di- e tri-peptidi, eseguito a pH 7. I dipeptidi Phe-Phe e Lys-Glu sono elettricamente neutri e restano vicino all'origine. Più alta è la carica complessiva, più migrano i peptidi (per es., Lys-Lys > Lys-Phe), ma un aumento di dimensione riduce la mobilità (per es., Lys-Lys-Phe migra meno di Lys-Lys). L'elettroforesi su carta è un metodo molto efficace per purificare piccole quantità di peptidi. Elettroforesi SDS-PAGE (PolyAcrylAmide Electrophoresis) Come supporto, invece della carta, si preparara un gel di un polimero come la poliacrilammide e la miscela di peptidi si applica ad una estremità I gel di poliacriloammide si formano per polimerizzazione radicalica della propenammide (acrilammide). 39 R. . R NH2 NH2 O. O radicale stabilizzato NH2 O . O iniziatore radicalico R R NH2 + NH2 + O R NH2 NH2 . O O NH 2 n R O O O NH2 O NH2 O NH2 NH2 NH Per dare solidità al gel si usano agenti di cross-linking. CH2 O PAGE si può eseguire come l'elettroforesi su carta NH O PAGE si esegue in presenza di dodecilsolfato si sodio (SDS) O + CH3CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2CH2 O S O Na O SDS (Sodium DodecylSuplhate) SDS: è un tensioattivo e denatura i peptidi (e le proteine) circonda i peptidi (e le proteine) conferendo loro una carica complessiva negativa e facendoli quindi migrare verso l'anodo fa migrare i peptidi (e le proteine) solo in funzione del loro peso molecolare (migrano 40 più rapidamente i più piccoli). 20 (-) Tipico elettroforetogramma SDS-PAGE; il peso molecolare si deduce dalla distanzapercorsa, per confronto con standard noti il campione si applica qui Peso molecolare a scala non è lineare ed è graduata in kilodaltons (1 kD = peso molecolare 1000) Migrazione SDS-PAGE è un ottimo metodo per separare peptidi (e proteine) sulla base del solo peso molecolare e permette anche di determinare il pesomolecolare approssimato. (+) 5. HPLC (High Performance Liquid Chromatography) L'HPLC è una tecnica che usa supporti con elevata area superficiale e che può sopportare pressioni abbastanza elevate. 10-100 atm, l'analisi dura 10-30 min La presenza di un solo segnale all'HPLC è criterio per la purezza del peptide - metodo analitico (< 1 mg) - fase inversa La cromatografia a fase inversa usa una fase stazionaria NON polare ed una fase mobile polare. 41 I peptidi idrofili vengono eluiti rapidamente, quelli lipofili hanno tempi di ritenzione più lunghi. Il supporto consiste di granelli di silice ( < 10 mm), in cui i gruppi Si-OH presenti sulla superficie sono stati sililati per trattamento con RMe2SiCl. Si(CH3)2R CH3 H3C OH HO HO Si Cl O R OH R(CH3)2 Si OH O R(CH3)2 Si R = catena idrocarburica O O O Si(CH3)2R O Si(CH3)2R O O O O Più lungo è R, più lipofila è la colonna campione in solvente polare O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O eluente O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O acqua con quantità crescenti di un solvente meno polare (MeCN, MeOH, i-PrOH), a pH costante e vicino alla neutralità. O O ----------------------- 42 21 HPLC tipico Il campione viene iniettato (I). A questo punto inizia il gradiente del solvente. A è il peptide più idrofilo, D il più lipofilo. 43 RIVELAZIONE DEI PEPTIDI 1. METODI NON DISTRUTTIVI Assorbimento nell'ultravioletto λmax ~ 214 nm (π π* del carbonile ammidico) di solito si usano λ 230 o 254 nm (spalla), perché la maggior parte degli eluenti ha assorbimento significativo a 210 nm. Se ci sono sostituenti aromatici (Phe, Tyr), si usa λ = 280 nm Indice di rifrazione Quando nell'eluente è presente un composto, cambia l'indice di rifrazione (RI refractive index) del solvente. Metodo molto sensibile, non può essere usato con gradiente di solventi Rotazione ottica (OR) La presenza di C chirali nei peptidi fa sì che questi ruotino la luce polarizzata rivelatori OR laser, molto sensibili I metodi non distruttivi non si possono usare per l'analisi di elettroforetogrammi 44 22 2. METODI DISTRUTTIVI O O Ninidrina H2O O OH OH O O conferisce una colorazione caratteristica viola-porpora R O O CH R O + H2N CH CO2H N H2O O O R ON O C OH CH H2O, H+ NH2 + H CO2, H+ O R C O Solo l’N del residuo Nterminale viene incorporato nel prodotto: il saggio non permette di distringuere tra i vari amminoacidi (o peptidi) H O O OH O .. NH2 + O OH O O N H2O O O O λmax= 570 nm Fluorescammina R O O O 45 reagisce con qualsiasi gruppo -NH2 N + RNH2 assorbe a 390 nm riemette a 475 nm OH O CO2H O Il metodo è molto sensibile, in grado di rivelare picomoli (10-12 moli) Cloruro di dansile H3C N CH3 H3C N reagisce con qualsiasi gruppo -NH2 CH3 + RNH2 assorbe nell'UV SO2Cl SO2 NHR Il metodo è in grado di rivelare < 1 μg (10-8 moli) di qualsiasi amminoacido (o peptide) 1,2-Benzendicarbaldeide (Aldeide ftalica, OPA o-phthalaldehyde) in presenza di mercaptoetanolo, reagisce con qualsiasi gruppo -NH2 CHO HS + RNH2 CHO OH S N R OH assorbe a 340 nm riemette a 450 nm 46 23 I metodi distruttivi sono accettabili solo se si usano piccole quantità di materiale. Se si sta usando l'elettroforesi per purificare i peptidi, si può rimuovere una sottile striscia di carta, sulla quale vengono visualizzati i peptidi A BC D A B C ------------------------------ D A BC D Una volta visualizzati i peptidi, si deduce la loro posizione sull'elettroforetogramma, si ritagliano le strisce contenenti i peptidi, che vengono recuperati lavandoli via con un solvente. La purificazione di un pentapeptide incognito verrà ottenuta con più passaggi successivi, iniziando con quelli che permettono di trattare grandi quantità di materiale e passando poi a tecniche che abbiano risoluzione sempre maggiore, man mano che diminuisce la quantità di campione. Una sequenza tipica può essere: 1. Dialisi: per rimuovere le proteine 2. Gel filtration: dà una purificazione significativa ed un PM approssimato 3. Cromatografia a scambio ionico: permette di trattare quantità relativamente grandi di materiale. 4. HPLC in fase inversa: metodo ottimo per purificare quantità piccole di peptidi 5. Elettroforesi su carta: per controllare la purezza del peptide e, se necessario, per isolare in piccola scala il peptide veramente puro. 47 ANALISI DEI PEPTIDI L’analisi dei peptidi consiste nell’individuare gli amminoacidi presenti e nel determinare la sequenza con cui sono legati fra loro ANALISI DEGLI AMMINOACIDI 1. Idrolisi totale dei peptidi a) Idrolisi acida I gruppi ammidici sono relativamente poco reattivi e possono essere idrolizzati incondizioni fortemente acide o basiche od usando enzimi specifici. E' il metodo più usato per l'idrolisi totale dei peptidi allo scopo di analizzare gli amminoacidi Condizioni standard: HCl acquoso 6M 110°C, 24 ore pompa da vuoto riscaldato a 110°C per 24 ore HCl 6 M La reazione si esegue di solito in un tubo di vetro sigillato, che prima di essere chiuso viene accuratamente degassato. fiamma campione di peptide Al termine il tubo viene rotto, il solvente viene evaporato, lasciando gli amminoacidi che costituivano il campione. 48 24 Alcuni amminoacidi possono essere distrutti nelle condizioni di idrolisi acida: - Ser e Thr si disidratano ad alcheni (di solito le perdite non sono gravi) - Met, Cys e Cys2 si ossidano facilmente a 110°C. Non basta degassare, bisogna flussare accuratamente con azoto. - Trp viene completamente distrutto. Anche le catene laterali ammidiche vengono idrolizzate: l'asparagina ad acido aspartico, la glutammina ad acido glutammico. b) Idrolisi basica Condizioni standard: NaOH 2 M in acqua, 100°C. Arginina, cisteina, serina e treonina sono completamente distrutte, il triptofano no. c) Idrolisi enzimatica Gli enzimi peptidasi scindono i legami ammidici Condizioni standard: pH 7, 37°C, quantità catalitica di enzima Amminopeptidasi Carbossipeptidasi scindono (velocemente) i legami peptidici, liberando gli amminoacidi uno dopo l'altro, a partire dal residuo N-terminale. La scissione si interrompe tutte le volte che si arriva: - ad un residuo Pro: il gruppo amminico è secondario e la catena laterale non può entrare nel sito attivo dell'enzima - ad un D-amminoacido: la configurazione D impedisce alla catena laterale di entrare nella tasca del sito catalitico. scindono (lentamente) i legami peptidici, liberando gli amminoacidi uno dopo l'altro, a partire dal residuo C-terminale. 49 2. Separazione degli amminoacidi Eseguita l'idrolisi totale del peptide, il problema successivo è separare gli amminoacidi liberati. a) Cromatografia a scambio ionico Di solito si usano solfonati (resine a scambio di catione). I tempi di ritenzione relativi sono influenzati dalla carica complessiva dell'amminoacido. Gli amminoacidi si separano in base alla carica complesiva. Si raccolgono più frazioni che poi si analizzano Supponiamo di avere Gly, Phe, Lys e Glu a pH 7 Gly: ha H come catena laterale; praticamente non carico Phe: ha CH2Ph come catena laterale (effetto -I); praticamente non carico Glu: ha un altro gruppo acido; complessivamente ha una carica negativa Lys: ha un altro gruppo amminico; complessivamente ha una carica positiva. Ordine di eluizione a pH 7 Glu (carica complessiva -1) Gly e Phe (carica complessiva 0) Lys (carica complessiva +1) 50 25 a pH 2 A pH 2 gli amminoacidi non avranno cariche intere, perché è un valore di pH più acido del punto isoelettrico. Gly + 0.7, Phe + 0.4, Glu + 0.6, Lys + 1.6 Phe, Glu, Gly, Lys Ordine di eluizione a pH 2 eluizione molto lenta (anche alcuni giorni) Per separare tutti gli aminoacidi in tempi ragionevoli, nel corso della eluizione il pH viene gradualmente aumentato da 3 a 10: vengono eluiti prima gli amminoacidi acidi, poi quelli neutri ed infine quelli basici La cromatografia a scambio ionico si può effettuare automaticamente, con un analizzatore di amminoacidi. Le frazioni raccolte sono esaminate spettrofotometricamente, dopo aggiunta di ninidrina, a 570 nm (sapendo il coefficiente di estinzione molare, si conosce anche la 51 concentrazione. pH 3.25 A a 570 nm (eluente + ninidrina) Cys Asp pH 4.25 Ser Thr Glu Met Val Leu Ile Gly Ala Tyr Phe pH 9.0 Trp NH His Lys 3 Cys Arg 2 Pro Volume di eluizione, ml Cromatografia a scambio di catione per la separazione di quantità equimolari degli aa codificati dal DNA A (eluente + ninidrina) Volume di eluizione, ml A = Glu, B = Gly, C = Phe, D = Lys, E = ammoniaca Gli amminoacidi ottenuti dall'idrolisi totale di un peptide, fatti passare attraverso una colonna 52 a scambio di catione, vengono identificati per confronto con gli standard. 26 b) HPLC L'HPLC in fase inversa è particolarmente efficiente per separare gli amminoacidi, che si possono rivelare con la ninidrina o facendone i fluorenilmetossicarbonilderivati, che assorbono a circa 280 nm. R + H2N CO2H λ = 280 nm O O O O Cl cloruro di fluorenilmetossicarbonile R NH CO2H Derivato Fmoc dell'amminoacido (Fmoc-Cl) vantaggi si usano strumenti HPLC standard e si rivelano tutti gli amminoacidi, compresa la prolina. c) Gascromatografia Gli amminoacidi, esistendo generalmente come ioni dipolari, non sono volatili e vanno trasformati in derivati volatili per poter essere analizzati via GC. 1. EtOH, H+ 2. (CF3CO)2O R H2N O N H F 3C CO2H R CO2Et R Me3SiCl Me3 Si Et3N N H CO2SiMe3 Generalmente la temperatura della colonna viene aumentata con il tempo (+) fiamma (-) Registratore H O 2 53 Rivelatore ad ionizzazione di fiamma: il gas di trasporto (eluente) viene convogliato su una fiamma che brucia in una camera, attraverso la quale è applicata una differenza di potenziale: la corrente dipenderà dal numero di particelle ionizzate prodotte dalla fiamma. 2 gas dal GC Gly (92°C) Quantità rivelata Glu (148°C) Phe (135°C) Lys (170°C) vantaggi Si possono usare gli strumenti GC standard. Si possono rivelare tutti gli amminoacidi (anche se danno risposte diverse al f.i.d.) Il GC può essere direttamente collegato ad uno spettrometro di massa Tempo di ritenzione, min Analisi GC dei trifluoroacetammido esteri degli aa 54 27 d) Elettroforesi su carta La tecnica si effettua caricarndo la miscela di amminoacidi su una striscia di carta che viene poi imbevuta con un tampone acquoso ad un pH opportuno. Quando alla carta si applica una differenza di potenziale, gli amminoacidi con carica globale positiva migrano verso il catodo, quelli con carica globale negativa migrano verso l'anodo. (-) (+) il campione Phe viene Lys applicato Gly qui elettroforesi a pH 8 Glu scarsa risoluzione- Svantaggi: molto difficile eseguire un'analisi quantitativa Vantaggi: ☺ ☺ utile per separare amminoacidi insoliti utile per separare amminoacidi marcati con isotopi radioattivi 55 a) Cromatografia su carta La cellulosa funziona da supporto e l'acqua ad essa legata (legame idrogeno) fa da fase stazionaria. Si usa un eluente acquoso (cromatografia di ripartizione). La cromatografia su carta separa gli amminoacidi in base alla polarità. Gli amminoacidi meno polari vengono eluiti più rapidamente. Al termine dell’eluizione ai spruzza ninidrina, che dà una macchia violetta in corrispondenza degli amminoacidi. Eluenti tipici contengono: - acqua - soluzione ammoniacale (per aumentare il pH) - acido acetico (per diminuire il pH) 56 - 1-butanolo (per diminuire la costante dielettrica). 28 Se non si riesce a separare completamente gli amminoacidi con la cromatografia su carta, si può tentare una cromatografia bidimensionale. Si fa correre l'eluente in una direzione, si asciuga la carta, si cambia eluente e si fa correre in direzione perpendicolare alla precedente. S O L V E N T E 1 Glu 2 Ser 3 Gly 4 Thr 5 Lys 6 Ala 7 Arg 8 Tyr 9 Val 10 Pro B SOLVENTE A Cromatografia su carta in due dimensioni di una miscela di 10 a 57 DETERMINAZIONE DELLA SEQUENZA 1. Analisi dei residui alle estremità del peptide I residui alle estremità sono gli unici che hanno, rispettivamente, il gruppo aminico ed il gruppo carbossilico liberi (a parte quelli che li contengono nelle catene laterali). Si modificano chimicamente questi gruppi funzionali, si esegue l'idrolisi del peptide: gli amminoacidi alle estremità vengono liberati in forma modificata Residuo N-terminale a. Metodo di Sanger I gruppi amminici primari e secondari sono abbastanza nucleofili da dare reazione con il 2,4-dinitrofluorobenzene (reagente di Sanger), dando i 2,4-dinitrofenil derivati (DNP, dinitrophenyl) H F .. R NH2 + NO2 R H NH F R N + - NO2 NO2 HF NO2 NO2 NO2 58 Frederick Sanger 29 Il gruppo DNP è stabile all'idrolisi acida. Idrolizzando il peptide, si liberano gli amminoacidi: l’unico con DNP in α è il residuo N-terminale. F CO2H NO2 CO2H H N H2N O H N N H O O H N NH O NO2 CO2H N H O O O2N O H N N H N H O CO2H SMe SMe NO2 NH NO2 NH2 Asp-Met-Phe-Lys-Ala NO2 + CO2H H2O, H+ O H3N OH + OH NH H3N O O2N O OH + + NH + + NO2 + H3N SMe + OH H3N CO2H O NO2 DNP-Asp Lys(DNP) NO2 Ala Phe Met Provenendo dall’idrolisi acida, gli amminoacidi sono in forma cationica! 59 L'identificazione si fa per confronto con i DNP derivati degli amminoacidi. Gli amminoacidi che hanno gruppi amminici in catena laterale saranno sostituiti in una posizione diversa dalla α. CO2H H2N α γ β O2N δ ε NH NO2 derivato Nε-DNP (tutti i residui di Lys) NO2 CO2H N NO2 H NH NO2 derivato Nα,Nε-bis-DNP (Lys N-terminale) NO2 l processo di identificazione si può migliorare estraendo i DNP derivati con solventi organici (cloroformio, acetato di etile). Più recentemente il cloruro di dansile viene utilizzato a preferenza del reagente di Sanger (i derivati hanno forte assorbimento nell'UV). H3C N CH3 H3C N CH3 + RNH2 SO2Cl SO2 NHR 60 30 Residuo C-terminale L'identificazione dell'estremità carbossilica è meno facile a. trattamento con NH2NH2 L'idrazina (Nu forte) attacca tutti i legami ammidici e come base dà l'anione carbossilato. L’unico carbossile libero al termine della reazione è quello del residuo Cterminale (o un carbossile in catena laterale) H N Asp Met Phe O H N Asp Met Phe CO2H N H .. H2N + NH NH2 + H2N NH2 H2N NH2 Asp NH NH2 O Met NH NH2 + NH2 Phe NH NH2 CO2 NH2 + Lys NH NH2 b. trattamento con LiBH4 Tutti i gruppi carbossilici si trasformano in esteri metilici: il trattamento con LiBH4 riduce le funzioni esteree, ma non quelle ammidiche. O N H Asp Met Phe Lys Asp Met Phe Lys CO2H N H CO2CH3 N H 61 O Asp Met Phe Lys O MeOH, H+ CO2CH3 O LiBH4 Asp Met Phe Lys CH2OH N H Per idrolisi totale del peptide modificato, si ottengono gli amminoacidi ed un amminoalcool (quello dal residuo C-terminale) H2O, H+ Δ Asp + Met + Phe + Lys + H2N CH2OH estraibile con solvente organico (etossietano) a pH 11 I metodi non sono molto sensibili ed il limite inferiore è circa 10μg. 2. Rimozione dei residui uno alla volta Residuo N-terminale Degradazione di Edman S reagente: isotiocianato di fenile N C Edman 62 31 S R H + C N N N Peptide H H O S C N R H N H2N + S Peptide R C HN N H S- O Peptide O R H C + N N Peptide H H O N H N tiourea Si aggiunge HCl 6 M che distrugge l'eccesso di Ph-N=C=S e promuove la reazione successiva S HN R C N H H+ H N Peptide + H2N Peptide HN N O R S H con un residuo in meno rispetto al peptide iniziale O N S O N H R H derivato della feniltioidantoina (termodinamicamente più stabile) La tioidantoina si estrae con un solvente organico e si identifica per confronto con le 63 tioidantoine preparate con i vari amminoacidi. Esempio: CO2H H N H2N N O H N N H O 1. O N H O CO2H C S S + HN N 2. H+ CO2H + O H3N N H O O H N SMe SMe + H3N O N O H N N H Met-Phe-Lys-Ala NH2 Asp-Met-Phe-Lys-Ala N H O CO 2 H C 1. N 3 O H N + + H3 N + NH N H O O CO 2 H S + Met-Phe-Lys-Ala H N H3 N HN 2. H+ SMe + S S CO2H N H O NH3 + Phe-Lys-Ala O N H O CO2H N 1. 2. H+ Phe-Lys-Ala NH3 + NH3 C + S S HN N O H3N CO2H N H + O Lys-Ala + NH3 64 32 + O H3N N H CO2H N 1. S C HN S + N + 2. H+ Lys-Ala H3N O CO2H N + H3 Ala + NH3 ☺ con 50 μg si può ricostruire la sequenza di un pentapeptide ☺ il processo è stato automatizzato Vantaggi: Svantaggi non è abbastanza sensibile per le piccole quantità di peptide spesso a disposizione con la ripetizione del ciclo di reazione il peptide rimanente contiene sempre più impurezze e dopo 20 residui i risultati possono essere ambigui è necessario che l'estremità contenga il gruppo amminico libero (ed in molti peptidi naturali non è così). Se si deve ricostruire la sequenza di un peptide contenente più di 20-30 residui di amminoacidi, si effettua una scissione parziale a peptidi più piccoli. 65 Residuo C-terminale La carbossipeptidasi scinde gli amminoacidi uno alla volta, partendo dal residuo C-terminale. L'idrolisi è abbastanza lenta ed interrompendola intempi successivi (per es., per acidificazione) è possibile determinare i primi residui dagli amminoacidi liberati. Esempio: Usando la carbossipeptidasi sul pentapeptide Asp-Met-Phe-Lys-Ala, si ottengono i seguenti risultati: tempo di reazione (min) 2 6 20 60 Aa liberati (equivalenti) Ala (0.34) Ala (0.73) Lys (0.17) Ala (0.96), Lys (0.52), Phe (0.07) Ala (0.96), Lys (0.52), Phe (0.07) Met (0.12) Con il procedere del tempo, le diverse velocità di idrolisi determinano un quadro più complesso. Di solito non è possibile risalire la sequenza per più di 3-5 residui. 66 33 3. Idrolisi parziale L'idrolisi parziale (chimica o enzimatica) scinde il peptide in peptidi più piccoli, di cui è più facile ricostruire la sequenza: la struttura del peptide iniziale si ricostruisce trovando i punti in comune dei peptidi più piccoli. Esempio Ala-Phe-Gly-Glu-Phe-Ser-Ser-Phe ottapeptide idrolisi parziale eptapeptidi + amminoacidi Ala + Phe-Gly-Glu-Phe-Ser-Ser-Phe + Ala-Phe-Gly-Glu-Phe-Ser-Ser + Phe esapeptidi + dipeptidi Ala-Phe + Gly-Glu-Phe-Ser-Ser-Phe + Ala-Phe-Gly-Glu-Phe-Ser + Ser-Phe pentapeptidi, tripeptidi 67 Si raccolgono tutti i peptidi della stessa lunghezza: per esempio i tripeptidi Ala-Phe-Gly-Glu-Phe-Ser-Ser-Phe Ala-Phe-Gly Glu-Phe-Ser Phe-Gly-Glu Phe-Ser-Ser Gly-Glu-Phe Ser-Ser-Phe Ala-Phe-Gly Phe-Gly-Glu Gly-Glu-Phe Glu-Phe-Ser Phe-Ser-Ser Ser-Ser-Phe Un peptide (o una proteina) può essere idrolizzato parzialmente anche usando enzimi, detti endopeptidasi, che catalizzano l’idrolisi di un legame ammidico non terminale Idrolisi enzimatica Enzima Tripsina Chimitripsina Elastasi Specificità idrolizza dal lato carbonilico di Arg e Lys idrolizza dal lato carbonilico di amminoacidi contenenti anelli aromatici a 6 termini (Phe, Tyr, Trp) idrolizza dal lato carbonilico di piccoli amminoacidi (Gly, Ala) 68 34 SINTESI DEI PEPTIDI La sintesi dei peptidi permette di: -confermare la struttura di un peptide naturale - preparare quantità relativamente grandi di peptidi rari - preparare peptidi nuovi Supponiamo di dover preparare il pentapeptide Glp-Phe-Gly-Gly-Lys partendo da Lamminoacidi facilmente disponibili. + H3N Affrontiamo il problema iniziando ad unire insieme due residui a partire da quello C-terminale: si tratta di fare il dipeptide Gly-Lys H3N + CO-2 + CO2 ? H N H3N + CO2 O NH2 NH2 si può pensare di trasformare la glicina nel suo cloruro acilico e poi di aggiungere la lisina H3N + CO-2 + SOCl2 H N NH2 Se però si fa questa reazione: CO2 H2 N Cl H2N H2N H2N CO2 O O + NH H2N + polimeri della Gly NH2 CO2 O + polimeri oltre al dipeptide desiderato si formano un centinaio di sottoprodotti! 69 Per formare un dipeptide dagli amminoacidi che lo costituiscono, bisogna proteggere tutti i gruppi funzionali, tranne quelli che dovranno essere coinvolti nella formazione del legame ammidico H2N H2N CO-2 CO2 ? Gly-Lys + NH2 posizioni che devono essere protette per avere l'accoppiamento corretto si devono scegliere gruppi protettori che si possano rimuovere senza rompere il legame peptidico appena formato - Protezione del gruppo amminico si ottiene diminuendo la nucleofilicità dell'N, trasformando il gruppo amminico in alcossicarbonil derivato R NH O O R = PhCH2, t-Bu, Et Cambiando R, la deprotezione si può ottenere con varie condizioni blande. - Protezione del gruppo carbossilico si ottiene trasformando l'acido nell'estere corrispondente (gli esteri sono più reattivi 70 delle ammidi) 35 La sintesi del dipeptide Gly-Lys si può perciò effettuare nel modo seguente O Gly Et O Cl N H H2N H O O Et O CO2Me CO2Me N N H 1. OH-, H2O O 2. H+ acquoso O Et HN Lys Gly-Lys O O Et HN O Questa strategia funziona bene per preparare il dipeptide. Se però si vuole continuare la sintesi di un peptide più lungo, bisogna introdurre di nuovo i gruppi protettori: sarebbe meglio poter rimuovere solo il gruppo protettore dell'NH2 in α H N O Gly R' O N H CO2R H N H2N CO2R accoppiamento del residuo successivo (X) X all'NH2 libero in α O O rimozione selettiva di R' Lys ecc. CO2R O R HN O R HN Gly Lys OR O O 71 La sintesi dei peptidi si semplifica notevolmente, se si usano due tipi di gruppi protettori, ciascuno dei quali può essere rimosso selettivamente. L'uso di gruppi protettori complementari si dice protezione ortogonale Un esempio di protezione ortogonale si ha con i bruppi benzile/terz-butile RCO2H RCO2R' RNH2 R HN reagente TFA H2/Pd-C × √ R'=CH2Ph √ R'= CMe3 (t-Bu) O R' × O = stabile √ × = deprotezione entrambi i gruppi si possono rimuovere con HBr/AcOH o HF Combinando i gruppi protettori benzile e t-butile, si può preparare facilmente un dipeptide Gly-Lys protetto, pronto per le reazioni successive O H3C H3C C O N H3C H O H N O O Boc Gly O HN O Lys OCH2Ph Z 72 36 il trattamento con TFA deproteggerà solo il gruppo amminico in α, lasciando protetti il gruppo carbossilico ed il gruppo amminico in catena laterale. L'NH2 su può accoppiare con il successivo amminoacido protetto e così via, fino ad ottenere la sequenza desiderata Il pentapeptide Glp-Phe-Gly-Gly-Lys si può preparare nel modo seguente: Boc Gly OH + H Lys OCH2Ph Z 1. accoppiamento 2. aggiunta di TFA OH Boc Gly + H Gly Lys OCH2Ph Z 1. accoppiamento 2. aggiunta di TFA Boc Phe + OH H Gly Gly Lys OCH2Ph 1. accoppiamento Z 2. aggiunta di TFA OH Glp + H Phe Gly Gly Lys OCH2Ph Z accoppiamento Glp Phe Gly Gly Lys OCH2Ph Z H2/Pd-C 73 Glp Phe Gly Gly Lys Un modo abbreviato di rappresentare la sintesi peptidica è quello di indicare ciascun residuo con una linea verticale, i legami con linee orizzontali, i gruppi protettori con segmenti diagonali e mettendo i reagenti tra le strutture: Glp Gly Phe Lys Gly Z Boc Boc Boc Boc Boc Boc OH H accoppiamento H2/Pd-C OH H accoppiamento TFA OH H accoppiamento TFA OH H accoppiamento TFA Z OCH2Ph OCH2Ph Z OCH2Ph Z OCH2Ph Z OCH2Ph Z OCH2Ph Z OCH2Ph Z OCH2Ph OH 74 37 - Protezione di altri gruppi In catena laterale ci possono essere gruppi che devono essere protetti Amminoacido protetto abbreviazione rimozione Arg(NO2) H2/Pd-C Amminoacido protetto abbreviazione rimozione NO2 N NH2 NH H3N CO-2 H3N + + Na/NH3liq. Cys(CH2Ph) S CO2 O N His(Bom) N O H2/Pd-C H3N H3N + CO2- Ser(CH2Ph) CO-2 HBr/AcOH o Na/NH3liq. + O Tyr(CH2Ph) H3N + CO-2 HBr/AcOH o Na/NH3liq. 75 Tutti questi gruppi protettori sono stabili quando si tratta con TFA. Sono tutti rimuovibili con HF. INTRODUZIONE DEI GRUPPI PROTETTORI Spesso costa meno comperare gli amminoacidi già protetti (perché preparati ingrandi quantità). Dovendoli preparare, i gruppi protettori più comuni si introducono nel modo seguente: O O O R NH2 + O R NH2 + R CO2H R CO2H O Cl O O + O NHR R Z NH R Boc NH O NEt3 O O OH + NEt3 NHR O H+ R O O H+ R O R CO2CH2Ph R CO2But Un problema particolare si presenta quando dobbiamo differenziare due gruppi amminici o due gruppi carbossilici. La soluzione dipende da quale gruppo si deve proteggere. 76 38 Per esempio, la protezione della catena laterale della lisina con Z si può effettuare sul chelato con un catione, come quello rameico; successivamente il gruppo amminico si protegge con Boc, dopo aver rimosso il catione O CO2 H2N H2N H2N .. Cu2+ 2 O NH2 O O . .. O Cu.. . . NH O 2 Cl NEt3 NH2 O O N H O .. O Cu.. . .NH O 2 H2N .. . O H N O O O H2S O O O O O O O O N H CuS N H NEt3 NH2 H N O O CO2H CO2 Boc Lys(Z) OH 77 FORMAZIONE DEL LEGAME PEPTIDICO Dovendo formare il legame ammidico tra due amminoacidi, opportunamente protetti, bisogna trasformare il gruppo OH dell'acido in un buon gruppo uscente O O Boc HN Boc HN OH X Boc-Gly-X Boc-Gly-OH Per gli acidi carbossilici l'attivazione più usata nel passato è stata la trasformazione in cloruri acilici O R O SOCl2 R OH O R'NH2 Cl R NHR' per la formazione del legame peptidico, se l'attivazione è troppo forte, si hanno dei problemi, il principale dei quali è la racemizzazione del C α però O (-) O base O R (-) R X X R OH H otticamente puro X R acido X O O X R + H R H racemico X 78 39 L'acido carbossilico libero non dà racemizzazione in ambiente basico, ma il cloruro acilico la dà, (Cl favorisce la formazione dell'anione) O O H base H2 N N O OH H R il centro chirale è "al sicuro" H R O H N H H N base X (dianione sfavorito) OX racemizzazione R R Con i peptidi (e con gli amminoacidi con il gruppo amminico protetto come ammide semplice) c'è un altro meccanismo con cui avviene la racemizzazione quando il gruppo OH dell'acido carbossilico è sostituito con un gruppo uscente molto buono. O H N = X OH O R H N .. R X O N X R H O H+ O ossazolone Gli ossazoloni sono molecole abbastanza reattive e possono fare legame peptidico per trattamento con l'opportuno composto con il gruppo amminico N N R H O R' H+ : NH O -O O 2 N R O O H N R' H O H N R H N R' H O H R N H R' 79 però l'ossazolone dà racemizzazione in condizioni molto blande, soprattutto inseguito a deprotonazione base-catalizzata, dando un anello aromatico a 6 elettroni π N R :B N H O BH+ O O O - R N - N R O O R O O - qualunque formazione di ossazolone potrebbe portare a racemizzazione del centro chirale, pregiudicando l'integrità del peptide appena preparato Per ridurre il grado di racemizzazione durante le reazioni di formazione del legame peptidico si può: eseguire reazioni di accoppiamento in cui il carbossile attivato sia quello della glicina (che non è chirale) o della prolina (che non forma ossazolone) scegliere condizioni di reazione che minimizzino la racemizzazione (solvente poco polare, pH neutro, bassa temperatura) scegliere accuratamente le condizioni per attivare il carbossile (v. dopo) usare nelle reazioni di accoppiamento amminoacidi protetti con gruppi alcossicarbonile R'O H N O O H R acido X } praticamente nessuna racemizzazione 80 base 40 con questi derivati non si osserva praticamente racemizzazione, tranne che in condizioni molto estreme (si pensa che gli alcossiossazoloni corrispondenti siano difficili da deprotonare sul C α). gli amminoacidi protetti con alcossicarbonile possono essere "attivati" e poi accoppiati con l'amminoacido appropriato, senza rischio di avere racemizzazione. REAGENTI PER L'ACCOPPIAMENTO PEPTIDICO DICICLOESILCARBODIIMMIDE (DCC) R O C OH N C N + R O C HN O C N R' NH2 R O C HN O C NH + NHR' DCC dicicloesilurea La DCC può essere aggiunta direttamente alla miscela di acido ed ammina, perché con l'ammina dà solo un equilibrio. La dicicloesilurea è poco solubile e si separa per filtrazione L'uso della DCC permette di accoppiare un acido ed un'ammina in una reazione 81 "one-pot" ed è il metodo più semplice di formazione del legame ammidico. ANIDRIDE Se l'acido carbossilico si tratta con mezzo equivalente di DCC, si osserva la formazione del precipitato bianco di diciloesilurea anche prima dell'aggiunta della DCC, a causa della formazione di anidride 2 R O C DCC OH H2O R O C O C O R L'anidride può essere utilizzata per la formazione del legame ammidico R O C O C O R + R' NH 2 R O C + NHR' R O C OH Questo procedimento è molto usato nella sintesi di peptidi, perché la reazione è pulita ed avviene velocemente (di solito entro un'ora). Le anidridi simmetriche, formate da acido e DCC, reagiscono con le ammine per dare ammidi che di solito sono molto pure, ma questo metodo comporta lo spreco di metà dell'acido carbossilico (costoso). L'inconveniente si può evitare usando anidridi miste: R O C O C + H3C Cl OH H3C C CH3 R O C O C O O CH3 R' NH2 + (CH3)3CO2H C C R NHR' H3C CH3 82 41 ESTERE ATTIVO Gli esteri metilici sono poco reattivi con le ammine e perciò non sono buoni substrati per la sintesi di peptidi. la reazione diventa utile con esteri con gruppi OR migliori gruppi uscenti (maggiore stabilità do RO- ) R O C F O R' + H2N R' R R O C O C O F C R O NO2 O esteri pentafluorofenilici (reagiscono in 12 ore) + R'O- F F esteri p-nitrofenilici NHR' F (reagiscono in 1 ora) Alcuni esteri attivi possono essere preparati in situ. Per esempio, l'1-idrossibenzotriazolo e la DCC vengono fatti reagire con l'acido carbossilico in uno stadio di "pre-attivazione"; la successiva aggiunta di ammina porta alla formazione pulita dell'ammide desiderata. N R O C DCC HN C O N OH O C N N R HO R O C N N HN + O C HN O N Quando gli esteri attivi vengono fatti reagire con le ammine, si ottengono ammididi elevata purezza, ma gli esteri attivi possono essere difficili da preparare (o costosi 83 da comperare). AZIDI Le azidi aciliche si possono formare dagli esteri carbossilici per trattamento con idrazina (che forma l'idrazide dell'acido) ed acido nitroso (fonte di NO+). R O C O R' H2N NH2 MeOH R O C NO+ + N N N R C O NH NH2 azide acilica (stabilizzata per risonanza) Il gruppo azido è un gruppo uscente moderatamente buono. La reazione con le ammine avviene in circa 10 ore, dando l'ammide corrispondente. R O C N3 + H2N R' H+, N3- R O C NHR' Il metodo dell'azide non viene scelto di solito, perché le azidi aciliche danno reazioni secondarie (per esempio la trasposizione di Curtius) e la formazione di ammide è piuttosto lenta. Però le azidi non danno racemizzazione. La formazione di legame peptidico con azide si usa solo quando la racemizzazione è un problema serio, soprattutto nell'accoppiamento di due frammenti peptidici. 84 42 Riassumendo, i quattro metodi principali di accoppiamento peptidico sono: Metodo Forma attivata R DCC O C R Estere attivo R HN O C N O C Anidride Vantaggi Svantaggi qualche reazione secondaria semplice O C O R reazione molto pulita sprechi piuttosto costoso reazione molto pulita esteri attivi costosi o di non facile preparazione F O C NO2 O O F C R O F F F Azide R assenza di racemizzazione nell'accoppiare frammenti O C N3 numerose reazioni secondarie 85 STRATEGIA Dovendo preparare un peptide, dobbiamo eseguire la sintesi aggiungendo un amminoacido alla volta o dobbiamo costruire la molecola in pezzi? Ci sono altri fattori che possono influenzare il progetto della via sintetica? SINTESI LINEARE o CONVERGENTE ? Una sintesi di peptide si chiama lineare se la molecola-obbiettivo viene costruita accoppiando un residuo amminoacidico alla volta. Una sintesi di peptide convergente comporta la sintesi separata di frammenti peptidici (contenenti due o più residui) che poi vengono accoppiati, formando il peptide finale. Consideriamo la sintesi di un ottapeptide, la cui sequenza di amminoacidi si indichi con: A-B-C-D-E-F-G-H Supponiamo di poter garantire una resa del 90% per ciascun passaggio di accoppiamento e confrontiamo la resa complessiva di una sintesi lineare con quella di una sintesi convergente Sintesi lineare: A + B + F + C A-B A-B-C 90% 81% A-B-C-D-E-F 59% + G + D A-B-C-D-E-F-G 53% + E A-B-C-D A-B-C-D-E 73% + H 66% A-B-C-D-E-F-G-H 48% 86 43 Sintesi convergente: 90% A + B C + D A-B C-D E + F G + H E-F G-H } } 81% A-B-C-D 73% } A-B-C-D-E-F-G-H E-F-G-H La resa complessiva mette in evidenza il vantaggio della sintesi convergente. Il numero di passaggi è lo stesso, ma il metodo lineare fa sì che si abbia a che fare con peptidi sempre più grandi ad ogni passaggio di accoppiamento, mentre il metodo convergente permette di eseguire la maggior parte dei passaggi con frammenti relativamente piccoli. La sintesi convergente dà rese più elevate e comporta la manipolazione di frammenti peptidici piccoli e facili da maneggiare per la maggior parte dei passaggi. QUALI FRAMMENTI ACCOPPIARE? Per la sintesi convergente di un pentapeptide, per esempio Glp-Phe-Gly-Gly-Lys, ci possono essere strade diverse Glp-Phe Glp + + Glp-Phe Phe-Gly Gly-Gly-Lys + + Gly-Gly A C Gly-Lys B + Lys Glp-Phe-Gly-Gly-Lys D Glp-Phe-Gly + Gly-Lys 87 C'è una strategia significativamente migliore delle altre? La via D presenta un accoppiamento semplice, perché è coinvolta la glicina (non chirale): in assenza di problemi di racemizzazione, si può usare il metodo semplice della DCC. Però i precursori (di- e tri-peptidi) devono essere preparati con il metodo lineare. Sintesi lineare Glp-Phe-Gly attivazione del residuo C-terminale H-Gly-Lys-P P O Glp Phe N CH2 C H X Glp-Phe-Gly-Gly-Lys- P P (P = gruppo protettore: occorre proteggere anche la catena laterale della lisina) Nel decidere quali frammenti accoppiare, è preferibile scegliere come componente carbossilico quello che non dà racemizzazione (glicina o prolina) e quindi usare il metodo semplice della DCC. Se nell'accoppiamento dei frammenti non si può usare un residuo Glyo Pro C-terminale, bisogna usare l'accoppiamento con l'azide. LA SINTESI DEL PEPTIDE DEVE INIZIARE DALL'ESTREMITA' N- o C-? Anche se il metodo complessivo è convergente, quasi sempre richiede qualche sintesi lineare al suo interno (per es., la via D precedente) 88 44 Glp + Phe Sintesi lineare dall'estremità N-terminale Phe + Gly Sintesi lineare Glp Phe Gly Phe Glp Gly dall'estremità C-terminale Glp Phe Gly E' meglio costruire il peptide "da destra a sinistra", perché si può minimizzare la racemizzazione. Per la sintesi lineare di peptidi è meglio partire dall'estremità C-terminale, perché gli amminoacidi protetti con alcossicarbonile si possono attivare facilmente, senza seri rischi di racemizzazione. Boc Phe OH + H Gly OCH2Ph DCC Boc Phe Gly OCH2Ph TFA H Phe Gly OCH2Ph Glp/DCC Glp Phe Gly OCH2Ph H2, Pd/C 89 Glp Phe Gly Nonostante i vantaggi della sintesi convergente, in seguito all'avvento della sintesi dei peptidi in fase solida, la maggior parte della sintesi peptidica si esegue in modo lineare. SINTESI DEI PEPTIDI IN FASE SOLIDA Uno dei problemi principali nella sintesi peptidica non sono tanto i passaggi di protezione/ deprotezione o le reazioni di accoppiamento, quanto la necessità di purificare il peptide ad ogni passaggio, per evitare che si accumulino le impurezze. Un modo di semplificare notevolmente la purificazione si deve a Merrifield, che ha sviluppato la tecnica di legare l'estremità C- ad un supporto polimerico insolubile. Merrifield ha usato un supporto di polistirene trattato con clorometossimetano in presenza di un acido di Lewis. Questa reazione di Friedel-Crafts dà un polimero insolubile, in grado di formare un legame di tipo estere benzilico con l'appropriato derivato di un amminoacido: Cl H2C polimerizzazione ClCH2OMe SnCl4 Cl H2C Cl H2C R O Boc N HR O Boc N H Boc N H O CH2 CH2 RO O CH2 O Questi polimeri si presentano come palline; l'amminoacido reagisce come se fosse un semplice estere benzilico; il polimero è insolubile nei solventi organici: il peptide in crescita è l'unica molecola 90 organica legata alla resina. Tutte le impurezze vengono rimosse per lavaggio. 45 Si usano metodi di accoppiamento che assicurano reazione completa entro un'ora e si aggiunge un eccesso (3-5 equivalenti) dell'amminoacido attivato. Ancora oggi sono è molto usata la combinazione di protezione ed attivazione originale di Merrifield: protezione del gruppo amminico con Boc, attivazione con DCC, protezione di tipo benzilico delle catene laterali. Alla fine della sintesi si usa HBr/AcOH, che rimuove i gruppi protettori benzilici e contemporaneamente stacca il peptide dalla resina. R O Boc N H Durante la sintesi dei peptidi si esegue il seguente ciclo di reazioni: CH2 O 1) TFA deprotezione 2) lavaggio con DMF lavaggio R O H 2N CH2 O ciclo completo R' 1) Boc N H X accoppiamento O 2) lavaggio con DMF Boc N H R' Bruce Merrifield lavaggio R O N H O CH2 O 91 si ripete Più recentemente sono state sviluppate altre combinazioni di supporto polimerico, di legame del C-terminale, di protezione e deprotezione. 1. Supporto polimerico La polimerizzazione radicalica della N,N-dimetilpropenammide (acrilammide), in presenza di un derivato funzionalizzato e di un agente di "cross-linking" dà un polimero permeabile in solventi come DMF, che può essere supportato su Kiselguhr (argilla inorganica), per avere sintesi peptidica in "flusso continuo“ (i reagenti ed il solvente scorrono attraverso una colonna contenente la resina). O O H3C N CH3 O + H3C O O Me2 N O polimerizzazione radicalica N CH3 O H3C N Me O O Me2 N O O N H N H agente di cross-linking 92 46 2. Collegamento polimero-peptide Una modifica in due passaggi del gruppo estere metilico dà un idrossi derivato, a cui si può legare l'amminoacido C-terminale con un semplice legame estereo HO NH2 1. H2N H3C O O 2. O X O HH O N N HO O O O Il legame è labile in ambiente acido ed il peptide finale può essere rilasciato con ac. trifluoroacetico. 3. Protezione Il gruppo protettore Fmoc si rimuove facilmente in condizioni basiche blande (di solito 20% azaciloesano). H2C Fmoc R O O N H COX Durante la sintesi il peptide in crescita viene in contatto solo con reagenti blandi ed93 il trattamento finale con TFA libera dalla resina il peptide completamente de-protetto. 4. Attivazione Gli esteri di Dhbt (3,4-diidro-4-osso-1,2,3-benzotriazol-3-ile, 3,4-dihydro-4-oxo1,2,3-benzotriazol-3-yl) si accoppiano abbastanza velocemente con i gruppi amminici liberi (circa 30 min). Durante la reazione di accoppiamento la resina si colora di giallo e quando l'accoppiamento è completo il colore scompare. O R Fmoc N H O O N N ODhbt N Quattro fattori hanno fatto sì che il metodo in fase solida sia quelloattualmente più usato nella sintesi dei peptidi Le sintesi sono veloci: in un giorno si possono facilmente accoppiare 5-10 residui (la sintesi convenzionale in soluzione di un ottapeptide può richiedere un mese o più). I passaggi sono semplici e ripetitivi ed è stato possibile ottimizzare le reazioni fino a rese di quasi il 100%. La purificazione mediante HPLC ha permesso di isolare rapidamente peptidi molto puri. Dato che il metodo è così semplice e ripetitivo è stato possibile renderlo completamente automatico. I sintetizzatori automatici dipeptidi sono costosi, ma adatti per le ditte farmaceutiche, che li possono far funzionare ventiquattro ore al giorno. 94 47 La sintesi dei peptidi in fase solida ha però degli inconvenienti Dopo 15-20 residui le impurezze cominciano a diventare significative Qualche volta l'accoppiamento può diventare difficile in modo inatteso e non evidenziato dal metodo, probabilmente per il ripiegamento della catena peptidica Ci sono dei limiti alla quantità di peptidi che si possono preparare con la sintesi in fase solida. La resina non può essere caricata troppo con il primo residuo, altrimenti diminuisce l'efficienza dell'accoppiamento; 0.5 g di resina (che è la quantità maneggiata nella maggior parte dei laboratori) possono dare solo 75 mg di un pentapeptide (abbastanza per semplici prove biologiche, ma non per l'eventuale applicazione medica) La resina, gli amminoacidi protetti, i reagenti ed i solventi per la sintesi in fase solida sono molto costosi. La sintesi dei peptidi in fase solida immobilizza il peptide in crescita su un polimero insolubile, permettendo una purificazione facile dopo ciascun accoppiamento. E' un metodo veloce ed affidabile per ottenere piccole quantità (10-100 mg) di peptide per i test biologici. Quantità maggiori di peptide si preparano usando la sintesi convergente in soluzione. 95 48