Caratteristiche sierologiche del fenotipo DFR in una famiglia di donatori di sangue Maria Palange, Antonella Matteocci, Maria Graziella Dionisi, Manuela Testi, Katiuscia Castagna, Angela Collaretti, Lorella Donnini, Cinzia Mazzoli, Letizia Rogai, Carla Gargiulo Laboratorio di Immunoematologia Eritrocitaria Centro Nazionale Trasfusione Sangue - Croce Rossa Italiana - Roma Responsabile: Dott. Emilio Mannella Classification of subjects with a Dmosaic antigen was traditionally performed with immune anti-D sera. The development of monoclonal antibodies enables a fine analysis to be made of the specificity of the epitopes that are present or missing in these cases. A systematic search in a donor's population (Italian Red Cross) revealed 3 related individuals with a red cell phenotype characteristic of Dmosaic category FR without anti-D in their serum. In this study the specimens were all tested with two methods: solid phase and cards with gel matrix. Clinical consequences for the prevention of immunization of these subjects are mentioned. Parole chiave: fenotipo Dmosaic, fenotipo DFR, fase solida, agglutinazione su colonna. Key words: Dmosaic phenotype, DFR phenotype, solid phase, agglutination in gel matrix. Introduzione Il termine D debole (Du) è stato introdotto per la prima volta da Stratton13 nel 1946 per descrivere globuli rossi D positivi che venivano agglutinati debolmente e soltanto da alcuni antisieri. È oggi generalmente accettato che questa debole agglutinazione sia dovuta ad un numero ridotto di molecole dell'antigene D sulla superficie dei globuli rossi. Un'altra forma di espressione anomala del D è stata descritta da Argall et al.1 nel 1953 come risultato della presenza di anticorpi anti-D in soggetti D positivi che erano stati trasfusi con globuli rossi D positivi. L'espressione anomala Ricevuto: 1 febbraio 2001 - Accettato: 7 marzo 2001 Corrispondenza: Dott.ssa Maria Palange Laboratorio di Immunoematologia Eritrocitaria Centro Nazionale Trasfusione Sangue - CRI Via B. Ramazzini, 15 00151 Roma dell'antigene D probabilmente riflette una lesione qualitativa nel genoma e viene identificata come Dmosaic. Il termine D debole, quindi, viene usato per indicare la anormalità nel DNA che si manifesta solo in una riduzione quantitativa dell'espressione di una molecola D normale, mentre il termine Dmosaic viene usato per indicare la anormalità nel DNA che induce fondamentalmente una variazione qualitativa nella struttura del D nonostante il numero di molecole presenti sulla superficie dei globuli rossi. Lo sviluppo degli anticorpi monoclonali come reagenti in uso per il fattore Rh permette una fine analisi dell'antigene D; i patterns di reazione ottenuti identificano l'appartenenza alle diverse categorie di Dmosaic secondo la classificazione di Patricia Tippett15. In questo lavoro viene descritto il caso di 3 soggetti, appartenenti alla stessa famiglia, che esprimono il fenotipo DFR nell'ambito delle categorie Dmosaic. Materiali e metodi Materiali I campioni raccolti in EDTA sono stati testati sul Groupamatic 2000 (Kontron, Milano) usato in routine per la tipizzazione automatica dei gruppi sanguigni. Sono stati, poi, cimentati con un antisiero monoclonale anti-D IgM (GTI, Milano), tre antisieri monoclonali anti-D blended IgM+IgG (Dade, Milano; Menarini, Firenze; Ortho, Milano) e un antisiero policlonale anti-D IgG (Sanofi, MI). I campioni a siero (sangue coagulato) sono stati testati per la eventuale presenza di anticorpi anti-D in fase solida. Si è poi proceduto alla tipizzazione in fase solida con il kit commerciale "Partial Rh Typing" della Immucor (Noverasco di Opera, Milano) costituito da sei antisieri monoclonali di tipo IgG i cui componenti fondamentali sono derivati da colture in vitro di eteroibridomi uomo/topo. In parallelo, la tipizzazione del Dmosaic è stata eseguita LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 46 - num. 3 maggio-giugno 2001 (169-172) 169 M Palange et al. con il test di agglutinazione su colonna usando il kit "IDPartial RhD-Typing Set" della DiaMed (Usmate/Velate, Milano) costituito da schedine a 6 microcolonne contenenti antiglobuline umane polispecifiche immerse nella matrice di gel. Fanno parte del kit i 6 antisieri monoclonali anti-D delle seguenti linee cellulari: LDG76, LDG77, LDG70, LDG59, LDG169, LDMI e l'ID-Diluent 2 che è un LISS modificato per la sospensione dei globuli rossi. Metodi L'antisiero monoclonale anti-D IgM (GTI) è stato usato per il test rapido su vetrino e in provetta con la metodica descritta nel foglietto illustrativo della Ditta fornitrice. I tre antisieri monoclonali anti-D blended IgM+IgG (Dade, Menarini, Ortho) sono stati usati con le metodiche previste per un anti-D incompleto, compreso il test all'antiglobulina per determinare la presenza di una variante D debole o Dmosaic. L'antisiero anti-D blended della Dade, inoltre, è stato utilizzato anche per la tipizzazione con il Groupamatic 2000 (Kontron); per questo uso è stato diluito 1:85 in PBS usando le emazie bromelinate. L'antisiero policlonale anti-D IgG (Sanofi) è stato usato per il test in provetta e per la conferma della variante D debole o Dmosaic con il test all'antiglobulina. Il Partial RhD Typing (Immucor) è stato adattato alla fase solida, notoriamente più sensibile e specifica, con delle modifiche rispetto al test eseguito in provetta sia nella preparazione delle emazie dei soggetti da testare che nella diluizione ottimale degli antisieri. In breve, in ogni pozzetto si dispensano 50 µL di emazie lavate 3 volte e risospese all'1%; si effettua, quindi, una centrifugazione a 900 gpm per 5, minuti necessaria perché si formi il monostrato. Segue un lavaggio con tecnica manuale o automatica per eliminare l'eccesso di antigene. A questo punto si dispensano 100 µL di LISS e 50 µL di antisiero specifico pre-diluito (i sei antisieri di classe IgG); si effettuano, quindi, una incubazione a 37 °C per 20 minuti in incubatore a secco (necessaria perche avvenga la reazione antigene/anticorpo) e successivi lavaggi. Si dispensano, quindi, 50 µL di emazie indicatrici ricoperte da anticorpi anti-IgG umane e si centrifuga a 1.900 gpm per 2 minuti; si leggono i risultati. In assenza di legame antigene/anticorpo (test negativo), le emazie indicatrici non sono ostacolate durante la loro migrazione e si evidenziano come un bottone sul fondo dei pozzetti; viceversa, se è avvenuto il legame tra le emazie adese al fondo dei pozzetti, gli anticorpi IgG presenti nell'antisiero specifico e le emazie indicatrici, il test risulta positivo ed apparirà un velo più o meno uniforme di cellule. Nel ID-Partial RhD-Typing Set (DiaMed) la sospensione dei globuli rossi da testare deve essere preparata allo 0,8% 170 dispensando 1 mL di ID-Diluent2 in una provetta e pipettando 10 µL di pappa di emazie. A questo punto si dispensano 50 µL di questa sospensione in ogni microcolonna; si aggiungono 25 µL di ciascun antisiero anti-D (dall'1 al 6), si incuba la schedina per 15 minuti a 37 °C e si centrifuga per 10 minuti. A questo punto si leggono i risultati; nel caso di un test negativo si avrà un bottone compatto di globuli rossi non legati sul fondo della microcolonna. Viceversa, nel test positivo, apparirà una linea rossa di globuli rossi agglutinati sulla superficie del gel o agglutinati dispersi nel gel. I patterns di reazione ottenuti vengono confrontati con la Master List inserita nel kit per identificare l'appartenenza alle diverse categorie di Dmosaic. Descrizione del caso e risultati Sono giunte all'osservazione del Laboratorio di Immunoematologia Eritrocitaria le donatrici di sangue NG di anni 32 e LG di anni 30, sorelle, iscritte anche all'IBMDR (Italian Bone Marrow Donor Registry). L'identificazione del raro fenotipo DFR è stata determinata inizialmente dal rilievo, in corso di tipizzazione routinaria automatica ABO-Rh, di una reazione negativa con il siero anti-D. A questo punto è stato eseguito un test di Coombs indiretto che è risultato debolmente positivo al microscopio. Si è, quindi, proceduto all'identificazione dei fenotipi Dmosaic sia in fase solida (Immucor) che con il test di agglutinazione su colonna (DiaMed). I risultati di tali esami hanno messo in evidenza l'appartenenza alla categoria DFR secondo la classificazione di Tippett13. Le donatrici sono state convocate per un ulteriore controllo su un nuovo campione di sangue e informate delle problematiche legate a tale fenotipo sia in campo trasfusionale che nella prevenzione dell'alloimmunizzazione materno-fetale. In considerazione di ciò, le stesse donatrici si sono rese disponibili ad ampliare lo studio agli altri membri della famiglia di origine (padre e madre) e acquisita (coniugi e figli). Tutti sono stati testati nelle stesse condizioni, con gli stessi antisieri e con le stesse metodiche. I risultati ottenuti sono quelli riportati nella figura 1. Discussione In tre membri di una stessa famiglia è stato messo in evidenza il fenotipo DFR; in tutti i soggetti tale fenotipo risulta associato al complesso cE e, come riportato da vari Fenotipo Rh DFR Figura 1: albero genealogico della famiglia G Autori in letteratura, è responsabile della produzione di un antigene a bassa frequenza, che è parte integrante del complesso sistema Rh, denominato FPTT e osservato per la prima volta in quattro donatori francesi. Per questo fenotipo è stato selezionato il termine DFR perché la F ricorda l'antigene FPTT e, essendo richiesto un minimo di tre lettere per la nomenclatura, è stata aggiunta la R alla F per ricordare l'iniziale collegamento francese. I donatori con un fenotipo Dmosaic devono essere considerati D positivi per evitare il rischio di immunizzazione in pazienti D negativi; infatti, non è ancora conosciuta l'immunogenicità degli antigeni Dmosaic . Solo un caso è stato descritto in letteratura di una madre D negativa immunizzata dal figlio DVa (secondo la classificazione di Tippett). D'altro canto il fatto che molti Dmosaic siano D deboli non esclude che possano essere immunogeni per i pazienti D negativi. Come pazienti, i soggetti Dmosaic devono essere considerati D negativi perché potrebbero a loro volta essere immunizzati da trasfusioni di sangue D positivo portanti gli epitopi mancanti. In campo trasfusionale, quindi, i soggetti portanti un fenotipo D mosaic devono essere trasfusi con emocomponenti D negativi e, per quanto riguarda le donne, in caso di aborto o gravidanza o di altre manovre ostetriche invasive legate alla stessa, è necessario eseguire immunoprofilassi anti-D. Per tutte queste ragioni, la conoscenza del Dmosaic nei donatori e nei pazienti è di importanza clinica. Siccome l'incidenza dei soggetti Dmosaic nella popolazione non è molto elevata, è necessario innanzitutto che in un Laboratorio di tipizzazione vengano usati almeno due differenti tipi di reagente anti-D. È ovvio che solo reagenti policlonali o un'appropriata miscela di anticorpi monoclonali sono capaci di reagire con tutti i globuli rossi, parziali o no. Il secondo tipo di reagente deve essere necessariamente monoclonale, capace di agglutinare la maggior parte dei D deboli compresi quelli a basso grado. Tuttavia, l'ideale sarebbe che tutti i campioni catalogati in un primo momento come D deboli venissero studiati con kit specifici costituiti da pannelli di anticorpi monoclonali in grado di identificare le categorie più frequenti di Dmosaic. Riassunto La classificazione di soggetti con un fenotipo Dmosaic viene comunemente effettuata con sieri immuni anti-D. Lo sviluppo di anticorpi monoclonali permette di valutare la specificità degli epitopi presenti o assenti in questi casi. Una ricerca sistematica sui donatori di sangue del 171 M Palange et al. Centro Nazionale Trasfusione Sangue della CRI ha permesso di identificare in due sorelle il raro fenotipo DFR e, grazie alla disponibilità delle stesse, lo studio è stato ampliato agli altri membri della famiglia di origine e acquisita. In questo lavoro i campioni sono stati testati con due metodiche alternative alla fase liquida: la fase solida e l'agglutinazione su colonna. Sono state prese in considerazione le conseguenze cliniche per la prevenzione dell'immunizzazione di questi soggetti. Ringraziamenti Particolari ringraziamenti per la collaborazione vanno alla famiglia G. Bibliografia 1) Argall CI, Ball JM, Trentelman E: Presence of anti-D antibody in the serum of a Du patient. J Lab Clin Med, 41, 895, 1953. 2) Beckers EA, Porcelijn L, Ligthart P et al.: The RoHar antigenic complex is associated with a limited number of D epitopes and alloanti-D production: a study of three unrelated persons and their families.Transfusion, 36, 104,1996. 3) Dimonte D, Poliseno G, Cazzato L et al.: Identificazione di soggetti D parziale. La Trasf del Sang, 45, (Suppl 2), pag s215, 2000. 6) Lomas C, Grassmann W, Ford D et al.: FPTT is a lowincidence Rh antigen associated with a "new" partial RhD phenotype, DFR. Transfusion, 34, 612, 1994. 7) Lomas C, Tippett P, Thompson KM et al.: Demonstration of seven epitopes on the Rh antigen D using human monoclonal anti-D antibodies and red cells from D categories. Vox Sang, 57, 261, 1989. 8) Palange M, Dionisi MG, Matteocci A et al.: Caratteristiche sierologiche di antigeni Dmosaic in 5 donatori di sangue del CNTS - CRI. La Trasf del Sangue, 45, (Suppl 2), pag s79, 2000. 9) Palange M, Dionisi MG, Matteocci A et al: La fase solida nell'identificazione dei fenotipi Dmosaic (accettato per la pubblicazione come lavoro 42/2000 sulla Trasf del Sangue) 10) Patrocini S, Giachino O, Lisardi D et al.: Nuove metodiche in Immunoematologia. La Trasf del Sangue, 38, 207, 1993. 11) Plapp FV, Sinor LT, Rachel JM et al.: A solid phase antibody screen. Am J Clin Pathol, 82, 719, 1984. 12) Reali G, Perrone O: Nuove acquisizioni sul sistema Rh mediate dalla biologia molecolare. La Trasf del Sangue, 45, 60, 2000. 13) Stratton F: A new Rh allelomorph. Nature, 158, 25, 1946, 14) Tiburzi A, Bertolassi M, Consolandi O et al.: Identificazione della variante DFR dell'antigene Rh in una giovane donna.La Trasf del Sangue, 45, pag s212, 2000. 15) Tippett P: Variants of the D antigen. Proceed ESTM Resid Course Belgirate, pag 99, Ed ESTM, Milano, 1995. 4) Ernst M, Weber-Muscan MT, Lenhard V et al.: Human monoclonal antibodies for the differentiation of Rh-D categories. Transfusionmed Infusionth, 19, 9, 1992. 16) Tippett P, Lomas-Francis C, Wallace M: The Rh antigen D: partial D antigens and associated low incidence antigens. Vox Sang, 70, 123, 1996. 5) Knight RC, Cullen EC: Detection of Du by automated blood grouping. ISBT/AABB, Joint Congress, November 1990 (Abstract) 17) Van Rhenen DJ, Thijssen PM, Overbeeke MA: Serological characteristics of partial D antigen category VI in 8 unrelated blood donors. Vox Sang, 66, 133, 1994. 172