Caratteristiche sierologiche del fenotipo DFR in

Caratteristiche sierologiche
del fenotipo DFR in una famiglia
di donatori di sangue
Maria Palange, Antonella Matteocci, Maria Graziella Dionisi, Manuela Testi,
Katiuscia Castagna, Angela Collaretti, Lorella Donnini, Cinzia Mazzoli,
Letizia Rogai, Carla Gargiulo
Laboratorio di Immunoematologia Eritrocitaria
Centro Nazionale Trasfusione Sangue - Croce Rossa Italiana - Roma
Responsabile: Dott. Emilio Mannella
Classification of subjects with a Dmosaic antigen was
traditionally performed with immune anti-D sera. The
development of monoclonal antibodies enables a fine
analysis to be made of the specificity of the epitopes
that are present or missing in these cases. A
systematic search in a donor's population (Italian Red
Cross) revealed 3 related individuals with a red cell
phenotype characteristic of Dmosaic category FR without
anti-D in their serum. In this study the specimens were
all tested with two methods: solid phase and cards with
gel matrix. Clinical consequences for the prevention of
immunization of these subjects are mentioned.
Parole chiave: fenotipo Dmosaic, fenotipo DFR, fase solida,
agglutinazione su colonna.
Key words: Dmosaic phenotype, DFR phenotype, solid
phase, agglutination in gel matrix.
Introduzione
Il termine D debole (Du) è stato introdotto per la prima
volta da Stratton13 nel 1946 per descrivere globuli rossi D
positivi che venivano agglutinati debolmente e soltanto
da alcuni antisieri. È oggi generalmente accettato che questa
debole agglutinazione sia dovuta ad un numero ridotto di
molecole dell'antigene D sulla superficie dei globuli rossi.
Un'altra forma di espressione anomala del D è stata descritta
da Argall et al.1 nel 1953 come risultato della presenza di
anticorpi anti-D in soggetti D positivi che erano stati
trasfusi con globuli rossi D positivi. L'espressione anomala
Ricevuto: 1 febbraio 2001 - Accettato: 7 marzo 2001
Corrispondenza:
Dott.ssa Maria Palange
Laboratorio di Immunoematologia Eritrocitaria
Centro Nazionale Trasfusione Sangue - CRI
Via B. Ramazzini, 15
00151 Roma
dell'antigene D probabilmente riflette una lesione qualitativa
nel genoma e viene identificata come Dmosaic.
Il termine D debole, quindi, viene usato per indicare la
anormalità nel DNA che si manifesta solo in una riduzione
quantitativa dell'espressione di una molecola D normale,
mentre il termine Dmosaic viene usato per indicare la anormalità
nel DNA che induce fondamentalmente una variazione
qualitativa nella struttura del D nonostante il numero di
molecole presenti sulla superficie dei globuli rossi. Lo
sviluppo degli anticorpi monoclonali come reagenti in uso
per il fattore Rh permette una fine analisi dell'antigene D; i
patterns di reazione ottenuti identificano l'appartenenza
alle diverse categorie di Dmosaic secondo la classificazione
di Patricia Tippett15. In questo lavoro viene descritto il caso
di 3 soggetti, appartenenti alla stessa famiglia, che
esprimono il fenotipo DFR nell'ambito delle categorie Dmosaic.
Materiali e metodi
Materiali
I campioni raccolti in EDTA sono stati testati sul
Groupamatic 2000 (Kontron, Milano) usato in routine per
la tipizzazione automatica dei gruppi sanguigni. Sono stati,
poi, cimentati con un antisiero monoclonale anti-D IgM
(GTI, Milano), tre antisieri monoclonali anti-D blended
IgM+IgG (Dade, Milano; Menarini, Firenze; Ortho, Milano)
e un antisiero policlonale anti-D IgG (Sanofi, MI). I campioni
a siero (sangue coagulato) sono stati testati per la eventuale
presenza di anticorpi anti-D in fase solida. Si è poi proceduto
alla tipizzazione in fase solida con il kit commerciale "Partial
Rh Typing" della Immucor (Noverasco di Opera, Milano)
costituito da sei antisieri monoclonali di tipo IgG i cui
componenti fondamentali sono derivati da colture in vitro
di eteroibridomi uomo/topo.
In parallelo, la tipizzazione del Dmosaic è stata eseguita
LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 46 - num. 3 maggio-giugno 2001 (169-172)
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M Palange et al.
con il test di agglutinazione su colonna usando il kit "IDPartial RhD-Typing Set" della DiaMed (Usmate/Velate,
Milano) costituito da schedine a 6 microcolonne contenenti
antiglobuline umane polispecifiche immerse nella matrice
di gel. Fanno parte del kit i 6 antisieri monoclonali anti-D
delle seguenti linee cellulari: LDG76, LDG77, LDG70, LDG59,
LDG169, LDMI e l'ID-Diluent 2 che è un LISS modificato
per la sospensione dei globuli rossi.
Metodi
L'antisiero monoclonale anti-D IgM (GTI) è stato usato
per il test rapido su vetrino e in provetta con la metodica
descritta nel foglietto illustrativo della Ditta fornitrice. I tre
antisieri monoclonali anti-D blended IgM+IgG (Dade,
Menarini, Ortho) sono stati usati con le metodiche previste
per un anti-D incompleto, compreso il test all'antiglobulina
per determinare la presenza di una variante D debole o
Dmosaic. L'antisiero anti-D blended della Dade, inoltre, è stato
utilizzato anche per la tipizzazione con il Groupamatic 2000
(Kontron); per questo uso è stato diluito 1:85 in PBS usando
le emazie bromelinate.
L'antisiero policlonale anti-D IgG (Sanofi) è stato usato
per il test in provetta e per la conferma della variante D
debole o Dmosaic con il test all'antiglobulina.
Il Partial RhD Typing (Immucor) è stato adattato alla
fase solida, notoriamente più sensibile e specifica, con delle
modifiche rispetto al test eseguito in provetta sia nella
preparazione delle emazie dei soggetti da testare che nella
diluizione ottimale degli antisieri.
In breve, in ogni pozzetto si dispensano 50 µL di emazie
lavate 3 volte e risospese all'1%; si effettua, quindi, una
centrifugazione a 900 gpm per 5, minuti necessaria perché
si formi il monostrato. Segue un lavaggio con tecnica
manuale o automatica per eliminare l'eccesso di antigene.
A questo punto si dispensano 100 µL di LISS e 50 µL di
antisiero specifico pre-diluito (i sei antisieri di classe IgG);
si effettuano, quindi, una incubazione a 37 °C per 20 minuti
in incubatore a secco (necessaria perche avvenga la
reazione antigene/anticorpo) e successivi lavaggi. Si
dispensano, quindi, 50 µL di emazie indicatrici ricoperte da
anticorpi anti-IgG umane e si centrifuga a 1.900 gpm per 2
minuti; si leggono i risultati.
In assenza di legame antigene/anticorpo (test negativo),
le emazie indicatrici non sono ostacolate durante la loro
migrazione e si evidenziano come un bottone sul fondo dei
pozzetti; viceversa, se è avvenuto il legame tra le emazie
adese al fondo dei pozzetti, gli anticorpi IgG presenti
nell'antisiero specifico e le emazie indicatrici, il test risulta
positivo ed apparirà un velo più o meno uniforme di cellule.
Nel ID-Partial RhD-Typing Set (DiaMed) la sospensione
dei globuli rossi da testare deve essere preparata allo 0,8%
170
dispensando 1 mL di ID-Diluent2 in una provetta e
pipettando 10 µL di pappa di emazie. A questo punto si
dispensano 50 µL di questa sospensione in ogni
microcolonna; si aggiungono 25 µL di ciascun antisiero
anti-D (dall'1 al 6), si incuba la schedina per 15 minuti a 37
°C e si centrifuga per 10 minuti.
A questo punto si leggono i risultati; nel caso di un
test negativo si avrà un bottone compatto di globuli rossi
non legati sul fondo della microcolonna. Viceversa, nel test
positivo, apparirà una linea rossa di globuli rossi agglutinati
sulla superficie del gel o agglutinati dispersi nel gel.
I patterns di reazione ottenuti vengono confrontati con
la Master List inserita nel kit per identificare l'appartenenza
alle diverse categorie di Dmosaic.
Descrizione del caso e risultati
Sono giunte all'osservazione del Laboratorio di
Immunoematologia Eritrocitaria le donatrici di sangue NG
di anni 32 e LG di anni 30, sorelle, iscritte anche all'IBMDR
(Italian Bone Marrow Donor Registry).
L'identificazione del raro fenotipo DFR è stata
determinata inizialmente dal rilievo, in corso di tipizzazione
routinaria automatica ABO-Rh, di una reazione negativa
con il siero anti-D.
A questo punto è stato eseguito un test di Coombs
indiretto che è risultato debolmente positivo al microscopio.
Si è, quindi, proceduto all'identificazione dei fenotipi
Dmosaic sia in fase solida (Immucor) che con il test di
agglutinazione su colonna (DiaMed). I risultati di tali esami
hanno messo in evidenza l'appartenenza alla categoria DFR
secondo la classificazione di Tippett13.
Le donatrici sono state convocate per un ulteriore
controllo su un nuovo campione di sangue e informate
delle problematiche legate a tale fenotipo sia in campo
trasfusionale che nella prevenzione dell'alloimmunizzazione
materno-fetale. In considerazione di ciò, le stesse donatrici
si sono rese disponibili ad ampliare lo studio agli altri membri
della famiglia di origine (padre e madre) e acquisita (coniugi
e figli).
Tutti sono stati testati nelle stesse condizioni, con gli
stessi antisieri e con le stesse metodiche. I risultati ottenuti
sono quelli riportati nella figura 1.
Discussione
In tre membri di una stessa famiglia è stato messo in
evidenza il fenotipo DFR; in tutti i soggetti tale fenotipo
risulta associato al complesso cE e, come riportato da vari
Fenotipo Rh DFR
Figura 1: albero genealogico della famiglia G
Autori in letteratura, è responsabile della produzione di un
antigene a bassa frequenza, che è parte integrante del
complesso sistema Rh, denominato FPTT e osservato per
la prima volta in quattro donatori francesi. Per questo
fenotipo è stato selezionato il termine DFR perché la F
ricorda l'antigene FPTT e, essendo richiesto un minimo di
tre lettere per la nomenclatura, è stata aggiunta la R alla F
per ricordare l'iniziale collegamento francese.
I donatori con un fenotipo Dmosaic devono essere
considerati D positivi per evitare il rischio di immunizzazione
in pazienti D negativi; infatti, non è ancora conosciuta
l'immunogenicità degli antigeni Dmosaic . Solo un caso è stato
descritto in letteratura di una madre D negativa immunizzata
dal figlio DVa (secondo la classificazione di Tippett). D'altro
canto il fatto che molti Dmosaic siano D deboli non esclude
che possano essere immunogeni per i pazienti D negativi.
Come pazienti, i soggetti Dmosaic devono essere considerati
D negativi perché potrebbero a loro volta essere immunizzati
da trasfusioni di sangue D positivo portanti gli epitopi
mancanti. In campo trasfusionale, quindi, i soggetti portanti
un fenotipo D mosaic devono essere trasfusi con
emocomponenti D negativi e, per quanto riguarda le donne,
in caso di aborto o gravidanza o di altre manovre ostetriche
invasive legate alla stessa, è necessario eseguire
immunoprofilassi anti-D. Per tutte queste ragioni, la
conoscenza del Dmosaic nei donatori e nei pazienti è di
importanza clinica. Siccome l'incidenza dei soggetti Dmosaic
nella popolazione non è molto elevata, è necessario
innanzitutto che in un Laboratorio di tipizzazione vengano
usati almeno due differenti tipi di reagente anti-D. È ovvio
che solo reagenti policlonali o un'appropriata miscela di
anticorpi monoclonali sono capaci di reagire con tutti i
globuli rossi, parziali o no. Il secondo tipo di reagente deve
essere necessariamente monoclonale, capace di agglutinare
la maggior parte dei D deboli compresi quelli a basso grado.
Tuttavia, l'ideale sarebbe che tutti i campioni catalogati
in un primo momento come D deboli venissero studiati con
kit specifici costituiti da pannelli di anticorpi monoclonali
in grado di identificare le categorie più frequenti di Dmosaic.
Riassunto
La classificazione di soggetti con un fenotipo Dmosaic
viene comunemente effettuata con sieri immuni anti-D. Lo
sviluppo di anticorpi monoclonali permette di valutare
la specificità degli epitopi presenti o assenti in questi
casi. Una ricerca sistematica sui donatori di sangue del
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M Palange et al.
Centro Nazionale Trasfusione Sangue della CRI ha
permesso di identificare in due sorelle il raro fenotipo
DFR e, grazie alla disponibilità delle stesse, lo studio è
stato ampliato agli altri membri della famiglia di origine
e acquisita. In questo lavoro i campioni sono stati testati
con due metodiche alternative alla fase liquida: la fase
solida e l'agglutinazione su colonna. Sono state prese in
considerazione le conseguenze cliniche per la prevenzione
dell'immunizzazione di questi soggetti.
Ringraziamenti
Particolari ringraziamenti per la collaborazione vanno
alla famiglia G.
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