Il virus
e
la diagnosi di laboratorio
Maria Rosaria Capobianchi
Antonino Di Caro
Concetta Castilletti
Laboratorio di Virologia
WHO Collaborating Center for clinical care, diagnosis, response and training on Highly Infectious Diseases
Il virus
• Particella virale pleiomorfa,
allungato, dotata di involucro,
dimensioni: 80nm x 13014,000nm long
• Famiglia filoviridae; il genere ebolavirus comprende 5 specie (Tai
Forest, Bundibugyo, Sudan, Reston, Zaire)
• Reston non è patogeno per l’uomo, anche si sono verificate infezioni
• Genoma: singola catena di RNA, lineare, non-segmentata, polarità
negativa, dimensioni: 18,959 bp.
• Capacità codificante: 7 proteine
Le proteine codificate dal genoma virale, studiate in un sistema replicon
NP:
L:
GP:
proteina NP strutturale di 83.3 Kd
RNA-polimerasi RNA dipendente
glicoproteina GP (2 forme: trans-membrana e secretoria)
VP40: proteina di matrice per la sua carica positiva facilita la gemmazione
VP30: proteina fosforilata con funzione di attivazione e modulazione della
trascrizione (incapsidamento RNA)
VP35: proteina coinvolta in eventi trascrizionali; inibisce l’attivazione del sistema
IFN contribuendo alla patogenicità dei filovirus
VP24: proteina associata alla matrice; la funzione rimane ambigua
Ebola: patogenesi.1
Il virus, veicolato dalle
secrezioni infette, penetra
per via mucosale o
percutanea
Il virus si diffonde
attraverso il torrente
circolatorio e si replica
attivamente in:
• macrofagi/monociti
• cellule dendritiche
• cellule endoteliali
Principali organi bersaglio:
fegato, rene, milza, ovaio,
testicoli ed organi linfatici
Le lesioni principali
sembrano essere a carico
dell’endotelio vascolare,
con conseguente aumento
della permeabilità vasale
Feldmann, Lancet 2011
Ebola: patogenesi.2
Le informazioni sulla patogenesi derivano principalmente da studi su modelli animali
(non human primates).
I meccanismi patogenetici principali si esplicano su due versanti:
Inibizione del sistema
immunitario, che impedisce
l’attivazione di una risposta
immune protettiva efficace
Danno del sistema vascolare,
con conseguente perdita di
sangue (emorragie) ed
ipotensione, seguite da
shock e morte
Ebola: immmunopatogenesi
Gli elementi essenziali della immunopatogenesi si estrinsecano
in due direzioni opposte:
Negli stadi iniziali dell’infezione, il virus, grazie ad alcune
proteine codificate dal suo genoma, blocca la risposta
immune; questo determina una massiccia replicazione virale
e un ritardo nella produzione degli anticorpi e nell’attivazione
di altri meccanismi antivirali
La risposta immune inizia quando la replicazione virale è fuori
controllo; ne risulta una iper-attivazione immunitaria, che da
una parte non è più efficace nel contenere la replicazione del
virus , e dall’altra innesca effetti dannosi per l’organismo (ad
esempio tempesta citochinica)
I segni conclamati
La diagnostica di laboratorio
Outline
• Diagnostica di base
• Diagnostica differenziale
• Diagnostica specifica per Ebola
FAQ 1. Possono essere eseguiti
test diagnostici nei laboratori
locali (urgenza, microbiologia,
virologia, ecc.) prima di avere il
risultato del test per Ebola?
SI: se si adottano le adeguate misure di protezione.
Il rischio per i laboratoristi è molto basso in caso di
“bassa probabilità” di MVE, e basso in caso di
“elevata probabilità” .
• La circolare del Ministero della Salute 002670806/10/2014 dispone che per gli esami ematochimici
ed i test per le diagnosi differenziali, nei casi
sospetti/probabili di MVE, sia individuato un
laboratorio di riferimento che, in base alla valutazione
del rischio, effettuata dalla struttura di malattie
infettive di riferimento regionale, definisca le
procedure per il trasporto ed il processo dei campioni
• E’ opportuno che il personale sanitario, in tutte le fasi
del percorso assistenziale, anche in presenza di un
caso sospetto a basso rischio, rispetti
scrupolosamente le precauzioni standard per la
prevenzione delle infezioni, operando in modo tale da
evitare assolutamente qualsiasi contatto diretto con
liquidi biologici dei pazienti
•Limitare i prelievi al minimo indispensabile
•Valutazione del rischio
I campioni dei pazienti che rientrano nella definizione di caso
sospetto di malattia da virus Ebola (MVE) dovrebbero essere
trattati utilizzando un strategia di stratificazione dei rischi, che
tenga conto di
• esistenza ed entità del link epidemiologico
provenienza da zone dove l’epidemia ha un’alta diffusione
aver frequentato strutture ospedaliere
aver avuto contatti diretti con persone infette
• gravità della sintomatologia
• eventuale mancato miglioramento dei sintomi a seguito dei
trattamenti terapeutici
persistenza della febbre nonostante il trattamento
antimalarico in pazienti con parassitemia
•
Un buon documento di riferimento per la stratificazione dei rischi è stato
prodotto da PHE, ed è consultabile al sito
http://www.hpa.org.uk/webc/HPAwebFile/HPAweb_C/1194947382005
Prelievi
•Valutazione del rischio
Improbabile che si tratti di MVE
Bassa probabilità che si tratti di MVE
Alta probabilità che si tratti di MVE
MVE confermata
• Avvisare il laboratorio locale del rischio assegnato, per consentire
l’adozione di adeguate misure di biosicurezza
•Inviare i campioni al laboratorio locale
in contenitori primari chiusi, ermetici,
non in vetro, racchiusi in un secondo
contenitore infrangibile, a sua volta
contenuto in un terzo contenitore rigido,
rispettando la regola del triplo imballo
Indagini chimico cliniche.1
Emocromo
elettroliti
transaminasi
PCR
coagulazione
ecc.
•
La circolare del Ministero della Salute 0026708-06/10/2014
dispone che i laboratori per l’effettuazione dei test
ematochimici (oltre che per la diagnosi differenziale e per la
diagnosi di MVE) siano appositamente individuati.
Indagini chimico cliniche.2
• Le indagini chimico-cliniche possono essere eseguite in loco,
nei laboratori appositamente individuati, privilegiando POCT
(Point of Care Testing) o sistemi chiusi che consentano ad es.
di forare la provetta e di centrifugarla, ove necessario, in
modo automatico. Tali sistemi, se utilizzati con la piena
osservanza delle precauzioni standard, offrono un elevato
livello di biosicurezza
• le precauzioni di biosicurezza attuate in ogni laboratorio, in
ottemperanza del D. Lgs. 81/08, sono sufficienti a controllare
il rischio di qualsiasi agente infettivo, incluso il virus Ebola
Indagini chimico cliniche.3
•La struttura di malattie infettive di riferimento dovrà definire,
d’intesa con il laboratorio di riferimento, un protocollo che
preveda corrette modalità di richiesta dei test e flussi
informativi specifici
•È necessario che tale laboratorio venga avvisato in anticipo
dell’invio di un campione proveniente da un caso di MVE
•È altresì opportuno che le direzione dei laboratori condividano
con gli ospedali individuati per il ricovero dei casi sospetti, la
valutazione del rischio per adottare i percorsi e le procedure
più appropriate per il trasporto ed il processo dei campioni
•I campioni biologici devono essere confezionati e conferiti al
laboratorio di riferimento nel rispetto delle “Raccomandazioni
per la sicurezza del trasporto di materiali infettivi e di campioni
diagnostici” (Circolare Ministeriale n. 3 del 3 maggio 2003)
Indagini chimico cliniche.4
In laboratorio
• Se necessaria, la centrifugazione dei campioni va eseguita in
centrifughe che posseggano cestelli chiusi. I cestelli vanno aperti
preferenzialmente sotto cappa biohazard di classe II (BSC II)
• L’apertura delle provette deve essere eseguita sotto cappa BSC II,
evitando la formazione di aerosol
• In caso di necessità di procedure che generano aerosol,
l’operatore deve adottare le precauzioni standard, da contatto e
droplets
Indagini chimico cliniche.4
In laboratorio
• L’analisi dei campioni dovrebbe essere seguita dalla
disinfezione dello strumento secondo le procedure suggerite
dalla ditta produttrice
• Gli scarichi degli strumenti analitici, dedicati o meno, devono
essere trattati e smaltiti come rifiuti a rischio infettivo,
secondo le procedure aziendali, tenuto conto che andrebbero
privilegiati sistemi che producano una ridotta quantità di rifiuti
speciali;
• I campioni residui dovranno essere smaltiti come rifiuti a
rischio infettivo, secondo le procedure aziendali
La diagnostica di laboratorio
Outline
• Diagnostica di base
• Diagnostica differenziale
• Diagnostica specifica per Ebola
Perché la diagnosi differenziale
•La sintomatologia iniziale è molto
aspecifica, ed è comune a molte altre
condizioni patologiche.
•La comparsa dei sintomi emorragici è
in genere tardiva, e talvolta può essere
non apprezzata, perché si può trattare
di emorragie interne.
•La lista delle principali eziologie
infettive da considerare nella diagnosi
differenziale include le patologie più
comuni nei paesi dove è in corso
l’epidemia africana
Diagnostica differenziale
• Malaria
• Dengue
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Febbre tifoide
Shigellosi
Colera
Leptospirosi
Peste
Rickettsiosi
Febbre ricorrente
Borreliosi da pidocchi
Meningiti e sepsi
• Epatiti
• Altre febbri emorragiche virali
La circolare del Ministero della
Salute 0026708-06/10/2014 dispone
che i laboratori per l’effettuazione
dei test per la diagnosi differenziale
(oltre che i test ematochimici e
quelli per la diagnosi di MVE) siano
appositamente individuati
FAQ 2. Il test di malaria può
essere eseguito in loco?
Si, se si adottano adeguate
precauzioni
• Privilegiare il test rapido (POCT)
le positività vanno confermate con i test convenzionali
• In pronto soccorso l’operatore è protetto dai dispositivi di
protezione e dalle procedure
• In laboratorio il POCT va eseguito a livello BSL2, sotto cappa BSC
II, proteggendo gli occhi e le mucose da eventuali spruzzi.
• L’operatore deve essere protetto da guanti e camice
impermeabile
• Nel caso non sia possibile l’utilizzo della cappa BSC II, l’operatore
dovrà indossare visiera o occhiali a tenuta e mascherina
chirurgica idrorepellente
In caso di impossibilità di eseguire il test in loco, o in caso di elevata
probabilità di MVE, la ricerca del parassita malarico può essere eseguita
nel laboratorio di riferimento regionale o nazionale
La diagnostica di laboratorio
Outline
• Diagnostica di base
• Diagnostica differenziale
• Diagnostica specifica per Ebola
Il virus ebola, come gli altri
filovirus, è un virus di gruppo di
rischio 4
•Alta contagiosità
•Elevata mortalità
•Assenza di terapia specifica
•Assenza di vaccini
La diagnostica per virus di gruppo di rischio 4
non è assimilabile ad analoghe procedure per
microrganismi di gruppo inferiore, in quanto
presenta requisiti strutturali, professionali ed
organizzativi peculiari
La circolare del Ministero della Salute
0026708-06/10/2014 indica i seguenti
criteri di laboratorio, almeno uno dei
quali è necessario per la conferma di un
caso di MVE
CRITERIO DI LABORATORIO:
La positività ad uno dei seguenti:
• Individuazione di acido nucleico del virus Ebola in un campione
clinico e conferma mediante sequenziamento o un secondo test su
una diversa regione del genoma;
• Isolamento del virus Ebola da un campione clinico;
• Evidenza di sieroconversione
Difficoltà del laboratorio
Necessità, specie in assenza di un sospetto clinico ben indirizzato, di una
diagnosi differenziale ad ampio spettro
Scarsità di materiali di riferimento per lo sviluppo e la validazione dei metodi
diagnostici specifici per MVE
Scarsità/assenza di kit commercialmente disponibili, sufficientemente validati
Necessità di test accessori per la conferma dei risultati dei test iniziali, dovuti
allo scarso potere predittivo positivo in situazioni di bassissima prevalenza,
come quella attuale al di fuori delle zone epidemiche
Necessità di partecipare a network internazionali per poter accedere a: metodi,
materiali/agenti, EQA, assistenza/conferme dei risultati
Necessità di sviluppare, spesso in fretta, metodi nuovi e, in assenza di standard
di riferimento, di sviluppare metodi di conferma
Necessità di laboratori ad alto biocontenimento
Considerazioni sui livelli di biosicurezza
• La ricerca dell’acido nucleico virale viene effettuata con metodi molecolari
• I tamponi di lisi utilizzati per l’estrazione degli acidi nucleici (es. AVL) inattivano
l’infettività virale
• L’aggiunta del tampone di lisi al campione clinico deve essere effettuata ad un livello
di biosicurezza commisurato alla valutazione del rischio; è raccomandato come
livello minimo il BSL3
• Le fasi di estrazione ed amplificazione possono essere eseguite in condizioni di
biosicurezza 2 (BSL2)
• L’isolamento del virus va effettuato in laboratorio a livello di biosicurezza 4
• Allo stesso livello deve essere effettuata la manipolazione e la conservazione di tutti
i campioni positivi
• La sieroconversione viene valutata mediante metodi non commerciali, il cui
allestimento richiede la disponibilità di colture virali, e quindi di laboratorio a livello
di biosicurezza 4
•In base a queste premesse, la circolare del Ministero della Salute
0026708-06/10/2014 dispone che la ricerca degli acidi nucleici virali
venga eseguita in laboratori identificati dalle regioni, dotati almeno di
livello di biosicurezza 3
•I laboratori abilitati alla manipolazione degli agenti di gruppo di rischio 4
possono effettuare i test che necessitano la coltura del virus e conservare i
campioni biologici positivi
•I laboratori di riferimento identificati dalle regioni e comunicati al Ministero
della Salute saranno inseriti in un processo di qualificazione con la
collaborazione del centro di riferimento nazionale per la diagnosi di Febbri
Emorragiche Virali, presso l’Istituto Nazionale per le Malattie Infettive
“L.Spallanzani”.
•In attesa della conclusione di tale processo di qualificazione, i campioni per
la diagnosi eziologica di MVE devono essere inviati contemporaneamente
anche all’INMI “L. Spallanzani
Quindi
• Per la diagnosi virologica di Ebola, bisogna inviare i
campioni al laboratorio regionale di riferimento o,
ove questo non fosse stato identificato, al
Laboratorio Nazionale di Riferimento dell’INMI “L.
Spallanzani”
• Contemporaneamente all’invio del campione al
laboratorio regionale di riferimento per la diagnosi di
MVE, un campione dovrà essere inviato anche al
Laboratorio Nazionale di Riferimento dell’INMI “L.
Spallanzani”
Capacità diagnostiche per Ebola al centro di
riferimento Nazionale individuato dal Ministero
• Ricerca diretta del virus mediante metodi molecolari basata su un
test iniziale di screening e vari test successivi di conferma
• Caratterizzazione molecolare mediante sequenziamento ed analisi
filogenetica
• Ricerca diretta del virus mediante metodi colturali
• Ricerca diretta del virus mediante microscopia elettronica
• Ricerca degli anticorpi mediante Immunofluorescenza indiretta
(IgM e IgG)
• Ricerca di anticorpi mediante test di neutralizzazione
• Misura della risposta cellulare virus-specifica
• Diagnosi differenziale verso le principali eziologie alternative,
nonché verso altre cause di sindromi emorragiche, incluse Lassa,
Dengue, Alkhurma, febbre gialla, ecc.
• Nel corso degli anni sono stati allestiti numerosi metodi
molecolari, basati su PCR classica o in real time, capaci
di riconoscere il virus Ebola ed eventualmente di
differenziarlo dagli altri filovirus
• Tali metodi devono essere continuamente aggiornati per
riconoscere eventuali nuove varianti virali, e vengono
cross-validati attraverso circuiti di controlli di qualità
gestiti all’interno di network di laboratori che hanno
familiarità ed esperienza sulla diagnostica dei virus di
gruppo di rischio 4
Metodi molecolari commerciali
• Recentemente si sono resi disponibili alcuni kit commerciali che rilevano l’RNA
virale
• Alcuni kit sono in grado di differenziare Ebola dagli altri filovirus
• Alcuni kit sono specifici per le diverse specie di virus Ebola (5 specie, di cui
una non patogena per l’uomo), o per Marburg
• Le performance analitiche e cliniche di questi kit non sono ancora descritte in
letteratura.
•Filovirus
Altona Real Star®Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0;
•Ebola
Genekam Ebola (Common) PCR kit, (Zaire) PCR kit, (Reston) PCR kit, (Zaire) PCR kit,
(Sudan) PCR kit
Liferiver (Vacunek) (EBOV) Real Time RT-PCR kit
Lipsdiag LIPSGENE® SEBOV Kit (Sudan) / ZEBOV Kit (Zaire)
Sacace Ebola Zaire Real Time PCR kit
Genesig Ebola Real Time PCR kit, Path-EBOV (Zaire) / Path-SUDV (Sudan)
Tib Molbiol Ebola (Zaire) Real Time PCR kit
•Marburg
Liferiver (Vacunek) (MBV) Real Time RT-PCR kit
Genekam Marburg PCR kit
Cinetica dell’RNA virale
•L’esperienza accumulata negli anni ( l’andamento riportato nella figura è relativo
all’epidemia di Ebola del 2000 in Uganda sostenuta dalla specie Sudan) ha indicato che
l’RNA virale è presente ad alti titoli fino a 10 giorni dopo inizio dei sintomi
•Questo suggerisce che la sensibilità dei test non è un problema rilevante
•Non bisogna dimenticare che in situazione di bassa prevalenza, anche in caso di
specificità elevata del test impiegato, il potere predittivo positivo può essere basso,
per cui è necessario ricorrere a test accessori di conferma
Towner, J Virol 2004
Definizione di caso
confermato
Individuazione di acido nucleico del virus Ebola in
un campione clinico e conferma mediante
sequenziamento o un secondo test su una diversa
regione del genoma
Flusso di lavoro adottato per la diagnosi
molecolare di MVE nel Laboratorio di
riferimento Nazionale
Rilevazione di una sequenza genica di EBOLA
con RT-PCR Real-Time
Conferma dei positivi con un metodo basato su una
regione target diversa
Esecuzione di una PCR classica
Caratterizzazione mediante sequenziamento della
regione amplificata con PCR classica
La sequenza ottenuta viene confrontata con le
sequenze disponibili nelle banche dati accessibili
via Web
38
Tempi di risposta
Dall’arrivo dei campioni al laboratorio di virologia
dello Spallanzani, attivo h24
Test rapido malaria 1 ora
Real Time PCR Filovirus (Ebola) 4-6 ore
A meno di imprevisti….
A proposito di imprevisti
•Il campione è fuoriuscito dalla provetta primaria
Necessità di bonificare la superficie esterna
Difficoltà a recuperare il campione residuo
disponibile
• Le informazioni sull’etichetta sono
incongruenti con quelle della scheda
Necessità di contattare chi ha inviato il
campione per escludere scambi di provette
• Il campione contiene inibitori o sostanze che interferiscono
con il saggio
Necessità di ricominciare dall’estrazione
• Altre circostanze impreviste (es. Scheda all’interno della
confezione)
Anticorpi
Benché fra i criteri di laboratorio sia indicata la evidenza di
sieroconversione, la ricerca degli anticorpi in genere ha valore di
documentazione retrospettiva
• Le IgM compaiono dopo 3 giorni e sono fugaci (< 3 settimane)
• Le IgG persistono a lungo e sembrano essere protettive
I grafici mostrano l’andamento della risposta anticorpale osservata
nell’epidemia di Ebola nella Repubblica Democratica del Congo del 1995
IgM
IgG
Ksiazek, JID 1999
Immunofluorescenza indiretta
Cellule non infette
• Non esistono metodi commerciali per la
ricerca di anticorpi specifici per il virus Ebola
Cellule infette con
virus Ebola
• Nel laboratorio di riferimento nazionale viene
eseguita l’immunofluorescenza indiretta,
utilizzando vetrini allestiti in house, con
cellule infette mescolate con opportune
quantità di cellule non infette
• Questa preparazione richiede la coltivazione
del virus, e quindi viene effettuata in BSL4
Controllo negativo
Campione IgM-positivo
Campione IgG-positivo
42
Risposta cellulare specifica
• Per la risposta cellulare vengono eseguite colture di PBMC
esposti al virus; la rilevazione delle sottopopolazioni linfocitarie
attivate viene eseguita mediante rilevazione citofluorimetrica
delle citochine intracitoplasmatiche.
Identificazione del virus
• Isolamento virale in colture di tessuto (BSL4)
e successiva caratterizzazione degli isolati con
metodi immunologici o molecolari.
• In casi particolari è previsto anche lo studio
morfologico in Microscopia Elettronica, sia
sull’isolato che sul campione biologico iniziale.
44
Coltivazione del virus: BSL4
0<
0
-15
-5.1
-5,1
BSL3
-33
-10
-15
-33
-50
BSL3
-35
BSL4
POCT
Sono descritti alcuni test rapidi, le cui
performance non sono definite, o sono
deludenti
Preparazione dei campioni.1
• Il campione di scelta per la ricerca del virus è
sangue-EDTA (no eparina)
• I campioni vanno mantenuti a +4°C prima dell’invio
• Il trasporto al Laboratorio deve essere effettuato
entro il più breve tempo possibile, preferibilmente
entro le 24 ore e a temperatura refrigerata
• Per tempi di consegna più prolungati, concordare
con il Laboratorio le modalità di preparazione e
conservazione
Preparazione dei campioni. 2
• I prelievi devono essere accompagnati dalla scheda
dati, compilata in tutte le sue parti
• Su ogni singolo campione deve essere apposta
un’etichetta riportante a chiare lettere il nome del
paziente, la tipologia del campione (sangue, urine,
altro) e la data di prelievo.
• Le informazioni riportate sulle provette devono
essere coerenti con quelle inserite nella scheda dati
Confezionamento e trasporto
dei campioni.1
• Il campione va confezionato seguendo il principio del triplo
involucro
• Il trasporto dei campioni al laboratorio va eseguito secondo
le raccomandazioni per i campioni a rischio biologico
(Circolare Ministeriale n°3/2003 “Raccomandazioni per la
sicurezza del trasporto di materiali infettivi e di campioni
diagnostici”)
• L’invio va concordato con il Laboratorio
Confezionamento e trasporto
dei campioni.2
Se si utilizza un
corriere, la confezione
deve essere omologata
UN 2814 (categoria A)
Se si utilizza il trasporto
aziendale su strada la
confezione non richiede
l’omologazione UN 2814.
Il box frigorifero può
rappresentare il contenitore
terziario (esterno).
I contenitori primari
non vanno mai inviati
in bustine “transbag”
e senza essere
racchiuse in
conteniture
secondario e terziario
x
Scheda di raccolta dati per la diagnosi di
Laboratorio in caso di sospetta MVE
Recapito del richiedente (possibilmente tel. cellulare)__________
