31/08/2009
Penetrazione dei virus nelle cellule
La replicazione dei virus
(dal
dal virus parentale ai virus della progenie)
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Prerequisito indispensabile:
indispensabile
• Essendo PARASSITI ENDOCELLULARI OBBLIGATI
i virus devono:
– trovare
– entrare in contatto (aderire)
– penetrare
in una cellula ospite dentro la quale si possa svolgere
il loro ciclo replicativo
La replicazione di un virus si può
dividere in diverse fasi:
• Attacco del virus alla cellula
• Penetrazione del virus nella cellula
Queste fasi sono le più restrittive, ma non le
uniche ad essere condizionanti l’ esito dell’
infezione
• Replicazione del genoma virale
• Assemblaggio delle neo-particelle
• Maturazione e rilascio dei virus neoformati
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La replicazione dei virus
Moltiplicazione dei virus
Le conoscenze di base che si susseguono nelle singole
cellule durante un ciclo di moltiplicazione virale sono
derivate da studi di curve di crescita one step di
preparazioni virali in colture di cellule. In questo
modello le varie fasi del ciclo replicativo virale vengono
sincronizzate infettando le cellule delle colture
simultaneamente e ad una alta molteplicità di infezione.
Tempo dopo l’infezione
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Replicazione virale: diagramma schematico
pfu/ml
Ore post-infezione
Adsorbimento e penetrazione
Eclisse
Maturazione
Rilascio
• Periodo di eclissi: piccole quantità di virus parentale
sono presenti. I virus sono scomposti nei vari costituenti
(uncoating) per liberare il genoma virale. La replicazione
del genoma è iniziata. Durata, minuti-hrs.
Replicazione virale: diagramma schematico
pfu/ml
Ore post-infezione
Adsorbimento e penetrazione
Eclisse
Maturazione
Rilascio
•
Periodo di maturazione:il materiale virale si accumula nelle cellule e nell’ambiente
extracellulare. Le cellule infettate con virus citocidi si disorganizzano e muoiono, la
produzione virale si interrompe. Il titolo virale, lentamente, decresce. Le cellule
infettate con virus non citocidi possono continuare a produrre particelle virali
indefinitamente.
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Replicazione virale: diagramma schematico
Virus totale
Virus intracellulare
Virus extracellulare
pfu/ml
Ore post-infezione
Adsorbimento e penetrazione
Eclisse
Maturazione
Rilascio
•
•
Un ciclo riproduttivo dura meno di un’ora nel caso di vari batteriofagi, 6-8hrs nel
caso di picornaviridae e più di 40 hrs nel caso di herpesviridae.
Cellule infettate con poliovirus, possono portare alla produzione di più di 100000 copie
di virus per cellula infetta.
Replicazione virale
• Un’infezione può essere:
• produttiva, i.e. penetrazione in cellule permissive seguita dalla
produzione
d
d
di una progenie virale.
l
• abortiva, i.e. penetrazione in cellule non permissive che non porta alla
produzione di una progenie virale. Possono esserci una serie di motivi
che rendono una cellula non permissiva, e.g. l’infezione ha inizio ma si
interrompe in una fase successiva: espressione del genoma virale,
maturazione, liberazione.
• restrittiva, una cellula è permissiva al virus solo transitoriamente,
quindi
i di poche
h particelle
ti ll virali
i li vengono prodotte.
d tt L
La produzione
d i
d
della
ll
progenie virale si interrompe, ma il genoma rimane nelle cellule,
esempi includono il virus di Epstein Barr e l’herpes simplex virus.
Questo tipo di infezione può avere conseguenze gravi, e.g
trasformazione cellulare.
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Replicazione virale
• Una proteina presente sul virione (anti-recettore) si lega al
recettore sulla superficie della cellula.
• Alcuni virus possono avere più di un anti-recettore.
anti-recettore
• I recettori cellulari sono spesso delle glicoproteine.
• L’espressione (oppure l’assenza) dei recettori sulla superficie
delle cellule determinano il tropismo dei virus, i.e. i recetori
rendono la cellula permissiva o meno alla replicazione virale.
A t t a c c o
recettore (cellulare) – recettore (virale)
L’attacco del virus consiste nel riconoscimento specifico
tra il recettore virale e il recettore cellulare.
Le molecole recettoriali possono essere
essere:
A) Proteine (di solito glicoproteine)
B) Residui di carboidrati
(presenti su glicoproteine o glicolipidi)
recettori specifici
recettori meno specifici
(la stessa configurazione
di catene laterali si può
ritrovare su differenti
molecole glicosilate delle
membrane)
Alcuni virus complessi usano più di un recettore e, quindi,
hanno
vie alternative di ingresso dentro le cellule.
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Adesione
•
•
L’adesione è un p
processo energia
g indipendente.
p
L’uptake (cioè l’insieme dei processi che porta
alla penetrazione del cappside nella cellula) è
invece dipendente dall’energia.
• Un fattore che accomuna tutti i
recettori virali:
Sono molecole di superficie le
cui funzioni fisiologiche vengono
sovvertite dai virus.
virus
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Strategie sperimentali per l’identificazione
di geni cellulari che codificano
per recettori virali
Recettori e corecettori costituiti da proteine
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Recettori costituiti da carboidrati
Recettori cellulari per i picornavirus
Diagramma schematico per le proteine cellulari che funzionano come recettori
per i diversi picornavirus.
Nella figura sono indicati i diversi domini: Ig-like, short consensus repeat-like
(SCR-like), low-density lipoprotein-like (LDL-like),
threonine/serine/proline (T/S/P).
Car = coxackievirus and adenovirus receptor
Vcam-1 = vascular cell adhesion molecule 1
Ldlr = low-density lipoprotein receptor
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Poliovirus/Rhinovirus (Picornaviridae)
Il legame avviene sul fondo di cosiddetti canyon
(depressioni alla superficie del virus )
Zone a sequenza costante
perchè non risentono della
pressione selettiva del
sistema immunitario, vista la
loro difficile accessibilità
Receptor, antibody, and drug binding to the picornavirus capsid
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Corecettori
• Alcuni virus usano un processo a due step per aderire
e penetrare
• Step 1: adesione a bassa affinità del virus ad un
primo recettore. Questo porta il virus in contatto con
il secondo recettore (corecettore)
• Step 2: Il recettore secondario promuove un legame
più forte tra virus e cellula e la fusione delle due
membrane
uno dei modi di
penetrazione dei
virus all’ interno delle
cellule alle quali hanno
aderito
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Corecettori
Interazione dell’HIV-1 con CD4
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Sialic acid receptors for influenza viruses
Close-up del sito di legame con una molecola di acido sialico
Struttura del monomero dell’HA
dell’influenza
virus e dettagli del sito di legame
con il recettore
Le subunità HA1 (blu) e HA2 (rosso) sone tenute insieme
da ponti disolfuro e da legami non-covalenti
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Cosa avviene dopo
l’adsorbimento del
virus sulle cellule?
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2) Penetrazione nella cellula ospite
Endocitosi
esterna
interna
Fusione
esterna
interna
Meccanismi per l’uptake di macromolecole dall’ambiente extracellulare
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Endocitosi recettore-mediata
Ruolo dell’endocitosi nella penetrazione dei virus
• Gli
endosomi
sono
normalmente
l
t
utilizzati
tili ti
dalla cellula per l’uptake di
nutrienti e fattori di
crescita
• I virus “dirottano” i
pathway cellulari
• La caratteristica principale
degli endosomi è la loro
progressiva
i acidificazione
idifi i
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Penetrazione dei virus
Penetrazione dei virus
Endocitosi
Fusione sulla membrana plasmatica
Influenza, togavirus rabdhovirus
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Alcuni virus senza pericapside non
fondono
Possono o meno essere endocitati
ma
I d
Inducono
lla F
Formazione
i
di porii
(es: Picornavirus )
Adenovirus cell entry
• La penetrazione
avviene mediante
endocitosi in
vescicole
s i l ricoperte
i p t
di clatrina.
• Invece di formare
pori, l’adenovirus,
rompe o lisa la
cellula.
• Lo stimolo è
rappresentato dal
b i pH.
bassi
H
• Il virus viene
tagliato
proteoliticamente
mediante proteasi
codificate dal virus.
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Meccanismo di penetrazione dei Reovirus
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Ruolo dell’endocitosi nella penetrazione dei virus
È uno dei meccanismi più diffusi per permettere ai virus di invadere le cellule
Non richiede nessuna proteina virale specifica (tranne quelle già utilizzate
per legare i recettori cellulari), ma avviene per formazione normale ed
internalizzazione di vescicole sulla membrana delle cellule
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• La fusione è necessaria per la
maggior parte dei virus con
envelope
• La fusione può avvenire
sulla membrana
citoplasmatica ( fusione in
esterno) oppure in vescicole
endocitiche (fusione in
interno)
• La
L ffusione
i
richiede
i hi d la
l
presenza di specifiche
proteine virali, che
promuovono l’unione tra le
membrane cellulari e virali
Evidenza dei penetrazione virale al microscopio elettronico
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Proteine virali specifiche di fusione
• Le proteine di fusione di I tipo sono le più
comuni e conosciute e sono presenti su molti virus
(Es: Influenza, VSV, Retrovirus)
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Misura dell’idrofobicità delle proteine E1 del SFV e F1 del Sendai virus.
FP = Peptide di fusione
TM = Dominio transmembrana
Kyte-Doolittle Hydropathy index (linea sottile)
Wimley-White interfacial hydrophobicity (linea doppia)
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Diagramma schematico delle proteine di fusione
IN
OUT
Orthomyxovirus
HR1
NH2
HR2
COOH
N-terminal
fusion peptide
HR2
HR1
COOH
NH2
N-terminal
fusion peptide
Internal
fusion peptide
Paramyxovirus
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Viral envelope
Six-helix bundle
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Low-pH-induced structural changes in the influenza virus HA
Proteine di fusione virali
TM
TM
HA
F
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Gp2
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Proteine di fusione di classe I
Paramyxovirus, orthomyxovirus, retrovirus, filovirus, rhabdovirus
Caratteristiche principali: sono composte da tre sub-unità identiche
generalmente prodotte a partire da un precursore
la sub-unità con dominio TM, presenta anche
il peptide di fusione
presenza di due
d heptad
h t d repeats,
t che
h sii dispongono
di
a formare dei coiled-coil
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Class 1
HA from influenza
gp120 from HIV
F proteins from paramyxoviruses
Gp2 from Ebola virus
Class 2
E proteins from TBE
E proteins from dengue virus
E1 protein from Semliki Forest virus
Proteine di fusione di classe II
Flavivirus, alphavirus, togavirus
Caratteristiche principali: presenza di pochissime eliche, ma elevata presenza
di foglietti β
le proteine sono distese sulla superficie del virus
presenza di peptidi di fusione interni
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Influenza HA
Influenza virus HA
pH neutro
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pH acido
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Penetrazione del virus dell’influenza
Penetrazione dei
paramyxoviruses
Modelli per la fusione di
membrana indotta dalla
proteina F
Modello del ruolo del recettore
per le chemiochine nella fusione
di membrana indotta dell’HIV-1
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Fusione di membrana mediata da HIV
Fusione di membrana mediata da HIV
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Fusione mediata dal virus Ebola
Ruolo del peptide di fusione nel portare a compimento
la fusione tra due membrane biologiche
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Fusione di membrana
a) Avvicinamento delle due membrane
b) Perturbazione dei lipidi dei foglietti esterni
c) Emifusione
d) Formazione del poro di fusione
EMIFUSIONE
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Quattro differenti modelli di fusione di membrana mediata da proteine
a)
Pori di fusione proteici: si forma una struttura proteica che apre un vero e proprio canale nella membrana.
In seguito le proteine si dissociano con infiltrazione di lipidi e completa fusione
b) Nel modello detto “a cancellata”
sono i lipidi a svolgere la maggior parte
del lavoro, con le proteine che si
di
dispongono
come una cancellata
ll t per
formare una sorta di anello.
Anche in questo caso dopo la
formazione del poro di fusione i
complessi proteici si dissociano
(a)
(b)
(c)
(d)
c) In questo modello, sono sempre i
lipidi i protagonisti principali, ma le
proteine intervengono in modo attivo
per forzare le due membrane ad
entrare in contatto e superare le
forze repulsive.
d) Molti peptidi anfifilici sono in grado di indurre la fusione di membrana, anche se il meccanismo
resto poco chiaro. Probabilmente causano una perturbazione locale del bilayer, in modo da
superare le barriere energetiche di attivazione
Meccanismi di penetrazione dei virus
e
diversa sede di replicazione
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