Assorbimento dei nutrienti

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Sulfate assimilatory pathway
Family of transmembrane proton
sulfate coco-transporters (ST)
The first step of S assimilation is the
activation of the sulphate ion by ATP and
the reaction is catalyzed by the enzyme
ATPATP-sulphurylase (ATPS)
Lewandowska and Sirko, 2008
The enzyme OAS
OAS--(thiol
thiol))lyase (OASTL) catalyzes the
transfer of the –SH group to acetylserine, which is
split into acetate and the amino acid cysteine
2 ) Fe deficiency modulates S uptake and assimilation rate
Exposure
of plants to
low S
medium
• Leaf chlorosis
• Decrease in biomass
• Increase in root proliferation
• Increase of root/shoot ratio
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Regulation of sulfate uptake and assimilation
The assimilation pathway is regulated by sulfur demand.
Specifically, it is repressed when reduced sulfur or thiols are
available, and it is quickly activated by sulfur deficiency.
Takahashi et al., 2011
The control of the S assimilatory pathway:
-the step of sulfate uptake
-the APS reduction
-the synthesis of cysteine
2 ) Fe deficiency modulates S uptake and assimilation rate
Sulfate transporters
can be divided into
five groups.
Hawkesford M.J. (2003)
Group 1 consists of high affinity, often root-expressed transporters, responsible
for the uptake of sulfate from the soil. Group 2 comprises low affinity
transporters expressed in vascular tissues and thus are considered to be
responsible for transport of sulfate inside the plant. Group 3 is enigmatic,
probably representing multiple “types” with one example being involved in
modulation of the activity of the Arabidopsis Group 2 sulfate transporter Sultr2.1.
Group 4 contains transporters that regulate the efflux of sulfate from the vacuole
into the cytoplasm across the tonoplast. Finally, members of the Group 5 seem to
be involved specifically in molybdenum transport and accumulation.
2 ) Fe deficiency modulates S uptake and assimilation rate
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Assorbimento ed Assimilazione dell’azoto
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Assorbimento ed Assimilazione dell’azoto
Tra i nutrienti minerali, quello assorbito in maggiori quantità dalla
soluzione del terreno risulta essere l’azoto.
Nei suolo ben aerati alle nostre latitudini, sebbene le piante siano
capaci di assorbire sia N-NH4+ che N-NO3-, il nitrato è la forma di
N maggiormente assorbita dalle radici delle piante coltivate.
Nella soluzione del terreno, lo ione
nitrato giunge alla superficie delle
radici prevalentemente per flusso
di massa, e da qui viene assorbito
nel simplasto delle cellule
epidermiche e corticali.
Assorbimento ed Assimilazione dell’azoto
* Somministrazione di 265 kg N ha-1 (sotto forma
di calcio-ammonio-nitrato) il 25 febbraio ed il 25
marzo. Da Barraclough, 1989.
Valori di concentrazione di NO3- nella soluzione del
terreno. Dati ottenuti dall’analisi di 879 campioni di
terreno (Reisenauer, 1964).
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Assorbimento ed Assimilazione dell’azoto
L’assorbimento di nitrato è mediato da
trasportatori ed avviene attraverso
meccanismi di simporto 2H+/1NO3-
Nel sistema radice-suolo, salvo situazioni particolari, l’assorbimento del nitrato da
parte degli apparati radicali costituisce un processo di trasporto attivo secondario (è
necessaria quindi una fonte di E per il trasporto dell’anione attraverso la membrana)
che coinvolgerebbe la H+-ATPasi della membrana plasmatica
L’H+-ATPasi di membrana, estrudendo H+
all’esterno delle cellule, crea un gradiente di
pH ed elettrico.
Il trasportatore del nitrato co-trasportando
2 o più H+ per ciascuna molecola di NO3-,
garantisce l’influsso del nutriente nella cellula
contro gradiente di concentrazione (≈1mM Vs
20mM) e di carica (≈ -120mV nel citoplasma).
Assorbimento ed Assimilazione dell’azoto
Trasporto dell’azoto
I trasportatori di NO3- si caratterizzano per diversa capacità di trasporto e diversa
affinità per il substrato
1. CHATS: trasportatori costitutivi ad alta affinità e bassa capacità di trasporto. Sono
responsabili dell’assorbimento dell’anione a basse concentrazioni (< 1 mM). KM = 620µM; Vmax 0.3-0.82µmol g-1 h-1
2. IHATS: trasportatori inducibili ad alta affinità ed alta capacità, responsabili
dell’incremento transitorio di assorbimento del nitrato KM = 20-100µM; Vmax 38µmol g-1 h-1
3. LATS: trasportatori a bassa affinità che trasportano il nitrato quando è presente a
concentrazioni > 0.2 mM. Presentano cinetica lineare non saturabile a concentrazioni
estremamente elevate (50 mM NO3-)
Cinetiche di assorbimento
del nitrato. L’nflusso è stato
misurato in funzione della
concentrazione esterna in
radici di orzo indotte con
0.1mM di nitrato.
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I MECCANISMI DI ASSORBIMENTO DEL NITRATO
Il sistema di assorbimento del nitrato è complesso
Destino del nitrato assimilato
1. Efflusso dalle cellule.
2. Conservazione nel vacuolo.
3. Riduzione ad ammonio per azione di NR e NiR.
4. Traslocazione via simplasto verso lo xylema per la successiva
riduzione ed assimilazione.
Il nitrato, una volta all’interno della cellula
radicale, può essere qui assimilato,
trasportato ed accumulato nel tonoplasto
(anche più di 20mM) oppure traslocato alle
foglie via xilema e quindi assimilato.
Nelle cellule radicali o fogliari, a livello
citosolico il NO3- viene ridotto per via
enzimatica (Nitrato Riduttasi) a NO2- che
successivamente nei plastidi viene
ulteriormente ridotto ad NH4+.
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Assimilazione del nitrato
Radici (piante delle zone temperate),
Germogli (piante di origine tropicale o subtropicale)
Riduzione del nitrato
Il nitrato come tale non viene introdotto nei composti organici, ma deve essere
prima ridotto ad NH4+ attraverso un processo a due fasi
NO3- + 2H+ + 2e-
NR
NO2- + H2O
NO2- + 8H+ + 6e-
NIR
NH4+ + 2H2O
Durante questo trasferimento
di e-, lo stato di ossidazione
dell’N passa da +5 a -3.
Le piante riducono il nitrato ed
il nitrito sia nelle radici sia nelle
foglie
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Riduzione del nitrato
Nitrato riduttasi (NR)
Il primo passaggio nella via di assimilazione del nitrato è la sua riduzione a nitrito
NADH o NADPH servono come agenti riducenti nella reazione con consumo di un protone
La reazione è catalizzata dalla NR, un complesso metalloenzima che forma omodimeri e omotetrameri,
ed avviene a livello citoplasmatico.
La NR possiede siti di legame per il
NAD(P)H e per il nitrato
Tre cofattori (FAD, Fe-eme, cofattore Mo
MoCo) forniscono i centri redox che
facilitano la catena di reazioni di trasporto
degli e-.
MoCo è uno ione molibdeno complessato
con la molibdopterina
Ogni subunità di NR contiene 1000 aa e
contiene tutti tre i cofattori.
La maggior parte delle NR usano NADH,
ma alcune usano anche NADPH
Riduzione del nitrato
Nitrato riduttasi (NR)
La NR si trova nel citosol delle cellule dell’epidermide e della corteccia radicale e anche
nelle cellule del fusto e del mesofillo.
Catalizza il trasferimento di 2 e- dal NADPH al nitrato attraverso 3 centri redox
Ogni regione funzionale della NR
può essere considerata una unità
indipendente, appartenente ad una
distinta famiglia di proteine
Regione che lega il FAD: è simile
alla ferredossina-NADP+ riduttasi,
famiglia delle ossidoriduttasi
flaviniche
Dominio centrale dell’eme, formato
da 75-80 residui, è simile a quello
della famiglia delle emoproteine del
citocromo b5
La voluminosa regione N-terminale
contenente il MoCo (360-370
amminocidi) appartiene ad una
classe speciale di proteine che
legano il MoCo
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Riduzione del nitrito
NO2- + 8H+ + 6e-
Nitrito riduttasi (NiR)
NIR
NH4+ + 2H2O
Il passaggio successivo nella via di assimilazione del nitrato è la riduzione del nitrito ad ammonio,
reazione catalizzata dalla nitrito-riduttasi (NiR), che avviene a livello dei plastidi
In questa fase vengono trasferiti 6 e- e la fonte di e- è la ferridossina ridotta (Fdxrid), prodotta nei
cloroplasti dal trasporto fotosintetico non ciclico degli eNei plastidi dei tessuti non fotosintetici, come le radici, il NADPH che deriva dalla via ossidativa dei
pentosio fosfati riduce la ferridossina in una reazione catalizzata dalla ferredossina-NADP+ riduttasi
La NiR è un monomero (60-70kDa) con due centri redox:
1) un centro eme con cluster Fe-S (4 Fe - 4S),
2) un dominio ferridossina.
Regolazione: trascrizionalmente, normalmente in coordinazione con la NR
Riduzione del nitrito
Nitrito riduttasi (NiR)
Poiché il nitrito è tossico, le cellule devono contenere sufficiente NiR per ridurre tutti il nitrito prodotto dalla NR.
Le piante quindi mantengono un eccesso di attività NiR ogniqualvolta la NR è presente, inducendo l’espressione del
gene NiR in risposta a lune e nitrato
Donatore di elettroni
Ferridossina
Ridotta nella fase luminosa
della fotosintesi (cloroplasti)
Ridotta da NADPH proveniente dal ciclo dei
pentoso fosfati plastidico nelle radici
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Alte concentrazioni di ammonio possono risultare tossiche
L’ammonio dissipa il gradiente protonico transmembrana indispensabile
per il trasporto degli elettroni sia della fotosintesi sia della
respirazione, come nell’accumulo di metaboliti nel vacuolo
I Protonofori
H
+
Lato P
A-
HA
A-
HA
Lato N
H
+
•Sono acidi deboli organici lipofilici
• La base coniugata è stabilizzata per risonanza e la
solubilità nelle membrane è dovuta alla delocalizzazione
della carica all’interno della molecola.
• Trasportano protoni mediante un meccanismo a navetta
(uniporto elettrogenico)
Assimilazione dell’ammonio
Vista d’insieme degli enzimi che
partecipano all’assimilazione dello ione
ammonio in glutammato, glutammina,
aspartato e asparagina, gli a.a. che
trasportano azoto nelle piante
L’azoto NH4+ è organicato
mediante 2 reazioni
principali:
1) Glutamina sintetasi (GS) che
provoca la amminazione
del Glu a Gln dipendente
da ATP e Mg2+ con alta
affinità per NH4+ (KM =
3-5 µM). Richiede Mn2+ o
Co2+, è costituita da 8
subunità identiche
2) Glutamato deidrogenasi
(GDH) (coinvolta
principalmente in
reazioni di deamminazione degli
amminoacidi)
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Reazione di GS e GoGAT
Il ciclo GS/GOGAT
La glutammina sintetasi
(GS) catalizza
l’assimilazione ATPdipendente dell’NH4+ nella
glutammina, usando il
glutammato come
substrato.
La GS funziona in un ciclo
con la glutammato sintasi
(glutammina-2oxoglutarato
amminotransferasi,
GOGAT) che catalizza il
trasferimento riduttivo
del gruppo ammidico dalla
glutammina all’achetoglutarato, formando
due molecole di
γ-glutamil-P
glutammmato.
Le piante assimilano l’azoto inorganico nei seguenti amminoacidi di trasporto
dell’azoto: glutammato, glutammina, aspartato e asparagina
Questi a.a. sono usati per trasferire l’azoto dagli organi di origine ai tessuti di
deposito e per costituire le riserve durante i periodi di disponibilità di azoto per
l’uso successivo della crescita, nella difesa e nei processi produttivi.
L’azoto assimilato nel glutammato e nella glutammina è efficientemente distribuito
nel metabolismo della pianta, in quanto questi a.a. forniscono l’azoto per la biosintesi
di a.a., acidi nucleici e altri composti azotati. Alternativamente, l’azoto assimilato nel
glutammato e nella glutammina può essere incorporato nell’aspartato e
nell’asparagina.
L’aspartato è un a.a. metabolicamente reattivo che serve come donatore di azoto in
numerose reazioni catalizzate da amminotransferasi; l’asparagina è metabolicamente
inerte e serve soprattutto come trasportatore di azoto e composto di riserva.
Glutammato, glutammina, aspartato e asparagina sono gli i principali a.a.traslocati nel
floema di moltissime specie vegetali
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SINTESI DEGLI AMMINOACIDI
•Organismi animali: incapaci di sintetizzare tutti gli a.a. necessari per la costruzione
delle loro proteine;
•Organismi vegetali: non presentano tale limitazione.
•Amminoacidi essenziali: quelli
che non sono sintetizzati da un
determinato organismo
•Amminoacidi semiessenziali: la
loro velocità di sintesi non è
sufficiente a rifornire un
organismo
Vie d’insieme della biosintesi degli a.a. nelle piante
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SINTESI DEGLI AMMINOACIDI AROMATICI
Le piante superiori, attraverso le vie biosintetiche
degli a.a. aromatici, producono numerosi metaboliti
aromatici:
•l’ormone vegetale auxina;
•pigmenti (antocianine);
•fitoalessine di difesa;
•alcaloidi bioattivi e lignina strutturale
Via biosintetica
localizzata nei
cloroplasti (esperimenti
con 14CO2)
Sintesi degli a.a. aromatici nelle piante. Oltre alle loro funzioni nelle proteine, la fenilalanina, la tirosina ed il triptofano fungono da
precursori per la sintesi di numerosi metaboliti primari e secondari
Assorbimento ed Assimilazione dello zolfo
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Lo S è considerato il quarto tra i nutrienti richiesti dalla pianta, dopo azoto,
fosforo e potassio. La sua funzione nei vegetali è legata alla sintesi degli
amminoacidi cisteina e metionina, di oligopeptidi, vitamine e cofattori e di
una vasta gamma di metaboliti secondari coinvolti nella detossificazione di
xenobiotici e nella risposta a vari tipi di stress ambientali
In condizioni di S-carenza si verifica una serie di disturbi metabolici associati
alla diminuzione della sintesi proteica, con conseguente accumulo di composti
azotati nelle cellule, e la pianta presenta una velocità di crescita ridotta, che,
interessando prevalentemente la parte aerea, determina la diminuzione del
rapporto “radice/parte aerea” (“root/shoot”).
La carenza di S provoca, inoltre, variazioni nella composizione delle proteine
che presentano un minor contenuto di aminoacidi solforati.
Un altro caratteristico sintomo
delle piante sottoposte a S-carenza
è la clorosi fogliare dovuta alla
diminuzione della sintesi della
clorofilla. La carenza di S si
manifesta con un particolare
fenotipo, caratterizzato da foglie
giovani clorotiche e foglie mature
verdi, dovuto alla scarsa mobilità
di questo nutriente nella pianta
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Lo S inorganico è generalmente molto meno abbondante di quello organico
nella maggior parte dei suoli agricoli. Lo ione solfato (SO42-) è la forma più
comune di S inorganico e può essere diviso in SO42- presente nella soluzione
del suolo, SO42- adsorbito e S minerale. Lo S può precipitare in forma di
SO42- come calcio, magnesio o sodio solfato. Il solfato si trova anche come
impurità cocristallizzata o coprecipitata con il CaCO3 ed è un’importante
frazione dello S totale nei suoli calcarei. Il solfato nella soluzione del suolo
si trova in equilibrio con le forme presenti nella fase solida adsorbite ai
minerali argillosi ed ai sesquiossidi. La quantità di SO42- che può essere
adsorbita è importante dal punto di vista della conservazione di adeguate
quantità di solfato nel suolo per evitare le perdite di S per lisciviazione.
Il solfato presente nel terreno può avere in parte origine atmosferica
(anidride solforosa e solforica).
La fonte principale di S per le piante è rappresentata dal solfato acquisito dalla
soluzione del suolo per mezzo delle radici. Il principale sito di assorbimento del
solfato è la regione dei peli radicali.
Il trasporto del solfato dall’apoplasto attraverso la membrana plasmatica fino
all’interno della cellula radicale è un processo attivo che avviene sia contro
gradiente chimico, visto che la concentrazione del solfato all’interno delle
cellule è da 100 a 1000 volte più alta rispetto a quella della soluzione del
terreno, sia contro gradiente elettrico, essendo il solfato carico negativamente.
Quindi, il trasporto del solfato avviene con un meccanismo di tipo secondario
che prevede consumo di energia ricavata dall’idrolisi dell’ATP.
Specifiche proteine trasportatrici presenti a
livello della membrana plasmatica sono in grado
di riconoscere e legare lo ione solfato e quindi di
mediarne successivamente il trasporto nel
citoplasma attraverso un meccanismo di simporto.
Questo evento è, infatti, accompagnato dal
contemporaneo rilascio di tre protoni necessari a
bilanciare le cariche negative del solfato. Lo
squilibrio di cariche, che si viene a creare durante
il trasporto, determina una depolarizzazione
della membrana che porta all’attivazione di una
pompa H+ATPasica del plasmalemma, la quale
riequilibra lo scompenso di cariche positive
estrudendo protoni verso l’esterno della cellula.
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I trasportatori del solfato sono costituiti da una singola catena
polipeptidica di circa 70-74 kDa.
- gruppo 1: trasportatori ad alta affinità, quasi esclusivamente espressi
nelle membrane plasmatiche delle cellule radicali;
- gruppo 2: trasportatori a più bassa affinità localizzati nella membrana
plasmatica dei tessuti vascolari e probabilmente coinvolti nella
distribuzione tissutale del solfato;
- gruppo 3: non è stato ancora del tutto caratterizzato, ma sembra essere
caratteristico dei tessuti fogliari;
- gruppi 4 e 5: trasportatori localizzati nella membrana del tonoplasto.
Il trasporto è soggetto a meccanismi di
induzione ed inibizione: carenze di solfato nel
mezzo
esterno
possono
provocare
un
incremento dell’attività di trasporto, a causa
dell’aumentata sintesi di carriers, mentre
l’accumulo di alcuni solfocomposti nella cellula,
come ad esempio la cisteina od il glutatione,
può inibire questo processo bloccando
l’induzione della sintesi di carriers e/o
stimolando una rapida demolizione degli stessi
Una volta nella cellula, il solfato
viene
convertito
in
composti
organici oppure viene rapidamente
traslocato nel vacuolo dal quale può,
in un secondo momento, essere
rimobilizzato.
Nelle piante superiori gli enzimi
responsabili dell’assimilazione del
solfato
sono
localizzati
nei
cloroplasti delle cellule delle foglie e
nei proplastidi delle cellule del
parenchima corticale delle radici,
anche se il processo assimilativo
avviene prevalentemente a livello
fogliare.
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Assorbimento ed Assimilazione del solfato
Le piante sono in grado di utilizzare lo zolfo inorganico, assorbito dalle
radici in forma di SO42- presente nel suolo
1) Attivazione del
solfato
2) Riduzione del solfato
attivato a solfito
3) Riduzione del solfito
a solfuro
4) Incorporazione del
solfuro in cisteina
Trasportatori del
solfato
Riduzione assimilativa
del solfato
Il solfato è chimicamente molto stabile e quindi per
poter essere organicato deve prima essere attivato.
L’attivazione di questo ione avviene attraverso una
reazione fortemente endoergonica e tramite
l’intervento di un enzima specifico, l’ATPsulfurilasi
(ATPS), che catalizza la formazione di un composto
solforato
intermedio,
l’APS
(adenosina
5’fosfosolfato), utilizzando come substrati il solfato e
l’ATP e liberando pirofosfato inorganico (PPi). Il
solfato deve prima essere ridotto a solfuro, passando
così dallo stato di ossidazione +6 a quello –2. In un
primo passaggio il solfato viene ridotto a solfito
(SO32-) nella reazione catalizzata dall’APSriduttasi
(APR), in cui il donatore di elettroni potrebbe essere
il glutatione (GSH). A questo punto, l’enzima solfito
riduttasi (SiR) catalizza la riduzione del solfito a
solfuro in una reazione in cui la ferredossina agisce
da donatore di elettroni. Una volta prodotto, il
solfuro viene incorporato nell’aminoacido cisteina
nella
reazione
catalizzata
dall’enzima
Oacetilserina(tiol)liasi (OASTL), che porta alla
formazione di cisteina ed alla liberazione di acetato
e che costituisce l’ultima fase del processo di
riduzione assimilativa dello S.
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La cisteina rappresenta il primo prodotto stabile del processo di riduzione del
solfato ed è un elemento di grande importanza nei sistemi biologici, sia come
costituente essenziale delle proteine, delle quali influenza fortemente
struttura e funzione, sia come precursore di tutti gli altri composti
contenenti S ridotto. La presenza del gruppo tiolico di questo aminoacido
permette, infatti, la formazione reversibile di ponti disolfuro tra due residui
cisteinici adiacenti in una catena polipeptidica e questo tipo di legame è
importante per la stabilizzazione della struttura terziaria della proteina.
Inoltre, la cisteina è il precursore dell’altro aminoacido solforato, la
metionina, che riveste particolare importanza per la pianta, in quanto è sia
donatore di gruppi metilici che iniziatore della sintesi proteica.
Particolare importanza tra le molecole biologiche contenenti S che si formano
dalla cisteina è rivestita dal glutatione, che nella pianta riveste un ruolo
importante come antiossidante: in particolare nei cloroplasti, insieme
all’ascorbato, è coinvolto nel meccanismo di detossificazione dei radicali
tossici dell’ossigeno e del perossido d’idrogeno, come dimostrato dal rapido
aumento della sua concentrazione nelle piante sottoposte a stress ossidativo.
Inoltre, il glutatione è anche il precursore delle fitochelatine, che svolgono
un ruolo nella risposta delle pianta alla tossicità da metalli pesanti, come ad
esempio il cadmio e lo zinco.
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