Applicazione di tecniche innovative di RNA

Applicazione di tecniche
innovative di RNA-Seq per lo
studio dei meccanismi di azione
di un biofungicida
R.M. De Miccolis Angelini, D. Digiaro, C. Rotolo, S. Pollastro, F. Faretra
Dipartimento di Scienze del Suolo,
della Piante e degli Alimenti
Studiare nel complesso i meccanismi di
riposta della pianta attivati a seguito
dell’esposizione ad un induttore di
resistenza e studiarne l’evoluzione
temporale al fine di comprenderne i
meccanismi di azione e migliorarne
l’efficacia
Allestimento della prova
Esperimento di RNA-Seq
Purificazione
dell’mRNA
• Campionamenti:
• 1, 3 e 7 giorni dopo
1° e 3° trattamento
• n. 5 foglie/campione
Frammentazione
dell’mRNA
Sintesi della prima elica
di cDNA
Sintesi della seconda
elica di cDNA
• Estrazione di RNA
totale
Riparo e adenilazione
delle estremità 3’
Legame degli adattatori
St
• Preparazione di
librerie di cDNA
Amplificazione in PCR
500
Validazione delle
librerie
300
100
N
T
St
Sequenziamento e analisi dei dati
Sequenziamento
(Illumina, Single
Reads 50 cicli)
Analisi
bioinformatica
Analisi RNA-Seq
Allineamento su
genoma di riferimento
Quantificazione dei
valori di espressione
(RPKM)
http://genomes.cribi.unipd.it/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=vitis+vinifera
Vitis vinifera (12x) – PN40024
genoma: 486.265.420 bp
geni annotati (V1): 23.984
Analisi di espressione
genica differenziale
Analisi funzionale dei
geni selezionati
6
Dati RNA-Seq
Regioni
introniche
5,7%
Regioni
intergeniche
5,8%
Sequenze non
allineate
3,5%
Giunzioni
esone-esone
13,2%
100
80
Regioni
esoniche
71,8%
60
%
40
20
0
Allineate
Corte sequenze (Read) totali
Read per libreria
Coverage
Trascritti rilevati
344 M (17,2 Gb)
27-30 M
≥ 31x
22.926 (95,6%)
Specifiche
Non specifiche
Isoforme di trascritti
Cromosoma 4
LOC100255883 - Sequence-specific DNA binding transcriprion factor
Gene
mRNA
Myb/SANT-like DNA-binding domain
1
2
Variante 1
Variante 2
1° trattamento
3° trattamento
Livello di espressione (RPKM)
Livello di espressione (RPKM)
1° trattamento
300
250
200
150
100
50
0
1
3
7
1
3
300
250
200
150
100
50
0
7
1
Controllo
3° trattamento
Trattato
3
7
1
3
7
Analisi dell’espressione differenziale
RPKM = 0 nel controllo e ≥ 20 nel trattato
67
62
63
59
53
45
3° trattamento
1° trattamento
1
3
7
1
3
7
3° trattamento
1° trattamento
62
71
78
61
58
121
RPKM = 0 nel trattato e ≥ 20 nel controllo
Analisi dell’espressione differenziale
80
FC ≥ 8 up
59
48
43
32
27
1° trattamento
3° trattamento
1
3
30
56
7
1° trattamento
1
3
7
39
42
133
3° trattamento
FC ≥ 8 down
562
Geni differenzialmente espressi
N. geni totali
Inibiti
Indotti
FC≥8
1.541
1.067
489
FC≥2
7.269
3.714
3.555
Indotti
Inibiti
1 giorno
I (156)
3 giorni
J (109)
IJ (32)
1 giorno
3 giorni
IJK (14)
LM (23)
M (103)
JK (46)
IK (80)
L (179)
LMN (14)
MN (27)
K (615)
LN (28)
7 giorni
N (115)
7 giorni
Totale 1.052 geni
Totale 489 geni
Up-regulated (FC≥8) and induced genes
GO: biological processes
Stress and stimulus responses
Oxidation-reduction processes
Regulation
Transport
Cellular processes
Metabolic processes
Proteine PR
FC 140,7
1° trattamento
1
via di segnale dell’SA
3
7
3° trattamento
1
3
7
Proteine PR
FC 12,6
FC 4,3
1° trattamento
1
via di segnale dell’SA
3
7
3° trattamento
1
3
7
Proteine PR
via di segnale dell’JA
FC 15,9
FC 12,6
1° trattamento
1
3
7
3° trattamento
1
3
7
Livelli di espressione (RPKM)
Proteine PR
5000
4000
Taumatine (PR-5)
1° trattamento
3° trattamento
3000
2000
1000
0
Controllo
Trattato
Livelli di espressione (RPKM)
Proteine PR
40
30
Proteine SRG1 (PR-10)
1° trattamento
3° trattamento
20
10
0
Controllo
Trattato
Categorie funzionali
Proteine di difesa
• Stilbene sintasi
• Osmotine
• Lipossigenasi (LOX)
• Salicilato O-metiltransferasi
Ricezione e trasduzione del segnale
• Proteine LRR (Leucine-Rich Repeat)
• Serina/treonina protein chinasi
•Protein-chinasi dipendente da
Ca2+/calmodulina
• Diacilglicerolo chinasi (DGK)
• Fosfoinositide fosfolipasi C
Stress ossidativo
• Superossido dismutasi
• Xantina deidrogenasi/ossidasi
• Perossidasi
• Glutatione-S-transferasi (GST)
• Transaldolasi
Biosintesi dell’acido jasmonico (JA)
• Linoleato 13S-lipossigenasi
• Acyl-coenzyme A oxidase 4
Metabolismo dell’etilene (ET)
• 1-aminociclopropano-1-carbossilato
ossidasi (ACO)
• Fattori di risposta ad etilene (ERF)
Metabolismo dell’auxina
• Proteine indotte e di risposta all’auxina
(AUX/IAA; ARF1; PCNT115)
• Trasportatore di auxina (Auxin Efflux
Carrier)
Trasporto
• Trasportatori di membrana di ioni,
amminoacidi/oligopeptidi, ABC/PDR,
• Proteina non specifica di trasferimento
dei lipidi (nsLTPs) (PR-14)
Categorie funzionali
Biosintesi dei terpenoidi
• 1-deossi-D-xilulosio-5-fosfato sintasi
• Ent-copalil difosfato sintasi
• (E)-beta-ocimene sintasi
• Mircene e terpineol sintasi
• (3S,6E)-nerolidol sintasi 1
• (E,E)-α-farnesene sintasi
• S-linalolo sintasi
• Valencene sintasi
Metabolismo dei fenilpropanoidi
e della lignina
• Fenilalanina ammonio liasi (PAL)
• Perossidasi
• 4-Cumarato-CoA ligasi
• Diidroflavonol 4-reduttasi/flavonone 4reduttasi
• Laccasi
Biosintesi di alcaloidi
• Strictosidina sintasi
• Iosciamine 6-diossigenasi
Biosintesi di flavonoidi e carotenoidi
• Caffeoil-CoA O-metiltransferasi
• Miricetina O-metiltransferasi
• Tabersonina 16-O-metiltransferasi
• Fitoene sintasi
• Carotenoide diossigenasi
Regolazione
• Fattori di trascrizione (Myc, Myb,
bHLH, SPT5)
• Ubiquitine
Fotosintesi
• Proteina che lega clorofilla a/b (CABbinding protein)
• Fotosistema I
• Fotosistema II
Livello di espressione (RPKM)
Proteina che lega clorofilla a/b (CAB-binding protein)
200000
Controllo
Trattato
150000
1° trattamento
100000
3° trattamento
50000
0
1
3
7
1
3
7
Conclusioni
1) ~ 340 milioni di sequenze (17 Gb) complessivamente generate;
~27,5 milioni di sequenze/libreria allineate sul genoma di
riferimento (12X Vitis vinifera)
2) Elevato grado di sensibilità e risoluzione della metodica di analisi
adottata: trascritti poco espressi e discriminazione tra isoforme di
trascritti
3) Numerosi geni differenzialmente espressi (7.269 geni FC≥2; 1.541
geni FC≥8) nei campioni di foglie a confronto (trattate/non trattate)
correlati con meccanismi di difesa della pianta
4) Attivazione della via di segnale dipendente da SA e di dipendenti da
JA/ET. Induzione di altri segnali di difesa, ad esempio mediati da
auxina o fitocromo A
5) L’analisi RNA-Seq può contribuire a comprendere i meccanismi
d’azione degli induttori di resistenza e a razionalizzare il loro impiego