Applicazione di tecniche innovative di RNA-Seq per lo studio dei meccanismi di azione di un biofungicida R.M. De Miccolis Angelini, D. Digiaro, C. Rotolo, S. Pollastro, F. Faretra Dipartimento di Scienze del Suolo, della Piante e degli Alimenti Studiare nel complesso i meccanismi di riposta della pianta attivati a seguito dell’esposizione ad un induttore di resistenza e studiarne l’evoluzione temporale al fine di comprenderne i meccanismi di azione e migliorarne l’efficacia Allestimento della prova Esperimento di RNA-Seq Purificazione dell’mRNA • Campionamenti: • 1, 3 e 7 giorni dopo 1° e 3° trattamento • n. 5 foglie/campione Frammentazione dell’mRNA Sintesi della prima elica di cDNA Sintesi della seconda elica di cDNA • Estrazione di RNA totale Riparo e adenilazione delle estremità 3’ Legame degli adattatori St • Preparazione di librerie di cDNA Amplificazione in PCR 500 Validazione delle librerie 300 100 N T St Sequenziamento e analisi dei dati Sequenziamento (Illumina, Single Reads 50 cicli) Analisi bioinformatica Analisi RNA-Seq Allineamento su genoma di riferimento Quantificazione dei valori di espressione (RPKM) http://genomes.cribi.unipd.it/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=vitis+vinifera Vitis vinifera (12x) – PN40024 genoma: 486.265.420 bp geni annotati (V1): 23.984 Analisi di espressione genica differenziale Analisi funzionale dei geni selezionati 6 Dati RNA-Seq Regioni introniche 5,7% Regioni intergeniche 5,8% Sequenze non allineate 3,5% Giunzioni esone-esone 13,2% 100 80 Regioni esoniche 71,8% 60 % 40 20 0 Allineate Corte sequenze (Read) totali Read per libreria Coverage Trascritti rilevati 344 M (17,2 Gb) 27-30 M ≥ 31x 22.926 (95,6%) Specifiche Non specifiche Isoforme di trascritti Cromosoma 4 LOC100255883 - Sequence-specific DNA binding transcriprion factor Gene mRNA Myb/SANT-like DNA-binding domain 1 2 Variante 1 Variante 2 1° trattamento 3° trattamento Livello di espressione (RPKM) Livello di espressione (RPKM) 1° trattamento 300 250 200 150 100 50 0 1 3 7 1 3 300 250 200 150 100 50 0 7 1 Controllo 3° trattamento Trattato 3 7 1 3 7 Analisi dell’espressione differenziale RPKM = 0 nel controllo e ≥ 20 nel trattato 67 62 63 59 53 45 3° trattamento 1° trattamento 1 3 7 1 3 7 3° trattamento 1° trattamento 62 71 78 61 58 121 RPKM = 0 nel trattato e ≥ 20 nel controllo Analisi dell’espressione differenziale 80 FC ≥ 8 up 59 48 43 32 27 1° trattamento 3° trattamento 1 3 30 56 7 1° trattamento 1 3 7 39 42 133 3° trattamento FC ≥ 8 down 562 Geni differenzialmente espressi N. geni totali Inibiti Indotti FC≥8 1.541 1.067 489 FC≥2 7.269 3.714 3.555 Indotti Inibiti 1 giorno I (156) 3 giorni J (109) IJ (32) 1 giorno 3 giorni IJK (14) LM (23) M (103) JK (46) IK (80) L (179) LMN (14) MN (27) K (615) LN (28) 7 giorni N (115) 7 giorni Totale 1.052 geni Totale 489 geni Up-regulated (FC≥8) and induced genes GO: biological processes Stress and stimulus responses Oxidation-reduction processes Regulation Transport Cellular processes Metabolic processes Proteine PR FC 140,7 1° trattamento 1 via di segnale dell’SA 3 7 3° trattamento 1 3 7 Proteine PR FC 12,6 FC 4,3 1° trattamento 1 via di segnale dell’SA 3 7 3° trattamento 1 3 7 Proteine PR via di segnale dell’JA FC 15,9 FC 12,6 1° trattamento 1 3 7 3° trattamento 1 3 7 Livelli di espressione (RPKM) Proteine PR 5000 4000 Taumatine (PR-5) 1° trattamento 3° trattamento 3000 2000 1000 0 Controllo Trattato Livelli di espressione (RPKM) Proteine PR 40 30 Proteine SRG1 (PR-10) 1° trattamento 3° trattamento 20 10 0 Controllo Trattato Categorie funzionali Proteine di difesa • Stilbene sintasi • Osmotine • Lipossigenasi (LOX) • Salicilato O-metiltransferasi Ricezione e trasduzione del segnale • Proteine LRR (Leucine-Rich Repeat) • Serina/treonina protein chinasi •Protein-chinasi dipendente da Ca2+/calmodulina • Diacilglicerolo chinasi (DGK) • Fosfoinositide fosfolipasi C Stress ossidativo • Superossido dismutasi • Xantina deidrogenasi/ossidasi • Perossidasi • Glutatione-S-transferasi (GST) • Transaldolasi Biosintesi dell’acido jasmonico (JA) • Linoleato 13S-lipossigenasi • Acyl-coenzyme A oxidase 4 Metabolismo dell’etilene (ET) • 1-aminociclopropano-1-carbossilato ossidasi (ACO) • Fattori di risposta ad etilene (ERF) Metabolismo dell’auxina • Proteine indotte e di risposta all’auxina (AUX/IAA; ARF1; PCNT115) • Trasportatore di auxina (Auxin Efflux Carrier) Trasporto • Trasportatori di membrana di ioni, amminoacidi/oligopeptidi, ABC/PDR, • Proteina non specifica di trasferimento dei lipidi (nsLTPs) (PR-14) Categorie funzionali Biosintesi dei terpenoidi • 1-deossi-D-xilulosio-5-fosfato sintasi • Ent-copalil difosfato sintasi • (E)-beta-ocimene sintasi • Mircene e terpineol sintasi • (3S,6E)-nerolidol sintasi 1 • (E,E)-α-farnesene sintasi • S-linalolo sintasi • Valencene sintasi Metabolismo dei fenilpropanoidi e della lignina • Fenilalanina ammonio liasi (PAL) • Perossidasi • 4-Cumarato-CoA ligasi • Diidroflavonol 4-reduttasi/flavonone 4reduttasi • Laccasi Biosintesi di alcaloidi • Strictosidina sintasi • Iosciamine 6-diossigenasi Biosintesi di flavonoidi e carotenoidi • Caffeoil-CoA O-metiltransferasi • Miricetina O-metiltransferasi • Tabersonina 16-O-metiltransferasi • Fitoene sintasi • Carotenoide diossigenasi Regolazione • Fattori di trascrizione (Myc, Myb, bHLH, SPT5) • Ubiquitine Fotosintesi • Proteina che lega clorofilla a/b (CABbinding protein) • Fotosistema I • Fotosistema II Livello di espressione (RPKM) Proteina che lega clorofilla a/b (CAB-binding protein) 200000 Controllo Trattato 150000 1° trattamento 100000 3° trattamento 50000 0 1 3 7 1 3 7 Conclusioni 1) ~ 340 milioni di sequenze (17 Gb) complessivamente generate; ~27,5 milioni di sequenze/libreria allineate sul genoma di riferimento (12X Vitis vinifera) 2) Elevato grado di sensibilità e risoluzione della metodica di analisi adottata: trascritti poco espressi e discriminazione tra isoforme di trascritti 3) Numerosi geni differenzialmente espressi (7.269 geni FC≥2; 1.541 geni FC≥8) nei campioni di foglie a confronto (trattate/non trattate) correlati con meccanismi di difesa della pianta 4) Attivazione della via di segnale dipendente da SA e di dipendenti da JA/ET. Induzione di altri segnali di difesa, ad esempio mediati da auxina o fitocromo A 5) L’analisi RNA-Seq può contribuire a comprendere i meccanismi d’azione degli induttori di resistenza e a razionalizzare il loro impiego