Riassunto del progetto 01/12 IRP Responsabile: Dr Paolo De Coppi
1.Cellule staminali amniotiche e di muscolo scheletrico caratterizzate attraverso la tecnica
della multiplex PCR su singola cellula.
L’analisi di singola cellula sta acquisendo sempre più importanza, in particolare nel campo
delle staminali. Infatti è ora chiaro che anche una popolazione definita di cellule staminali è
eterogenea a livello di singola cellula e uno studio genico a livello di popolazione non è
informativo. Per questa ragione sono state sviluppate tecniche di biologia molecolare
sempre piu’ sofisticate a livello di singola cellula. Tra tutte, abbiamo pensato di applicare la
tecnica di reazione a catena polimerasica (PCR) multiplex a singola cellula, per analizzare il
profilo genico delle cellule staminali del liquido amniotico e del muscolo scheletrico- le
cellule satelliti.
Il nostro gruppo focalizza la sua ricerca sulle cellule staminali del liquido amniotico e delle
membrane selezionate per un antigene di superificie, ckit, e sulle cellule staminali del
musoclo scheletrico, le cellule satelliti. Noi disegneremo un set di primers per cellule di topo
e di uomo che permetteranno di fare la PCR su singola cellula per avere delle informazioni,
nel caso delle cellule amniotiche sulla variazione di espressione di marcatori in base al
tempo gestazionale e mettere a punto così le condizioni di espansione in vitro. Nel caso delle
cellule satelliti ci occuperemo di analizzare il profilo genico dei cloni isolati e che da nostre
predenti ricerche hanno dimostrato di essere distinti in due diverse sottopopolazioni, con
diversa capacità proliferativa e differenziativa.
2. Creazione di matrice decellularizzata per riparare il diaframma attraverso un approccio
di ingegneria tissutale
Il numero dei bambini nati con malformazioni congenite è in crescita, mentre le procedure
per la correzione di tali malformazioni non sono cambiate in modo sostanziale negli ultimi
15-20 anni. Nella maggioranza dei casi, interventi chirurgici complessi e multipli
rappresentano ancora l’unica soluzione praticabile. Lo sviluppo di nuove strategie
terapeutiche riguardo alle malformazioni congenite è un’area di ricerca che richiede un
attento approfondimento. La chirurgia intrafetale, che inizialmente sembrava una
prospettiva incoraggiante, è una procedura ad alto rischio sia per la madre sia per il feto e,
secondo gli ultimi studi pubblicati, non ha ancora portato a risultati del tutto soddisfacenti.
Attualmente, i neonati con anomalie congenite riescono a trarre dei benefici soltanto da
procedure chirurgiche molto complesse, o da trapianti d’organo. Nonostante i progressi
della chirurgia post-natale, i risultati di tali interventi sono funzionalmente scarsi, lasciando i
bambini con inabilità di vario stadio. Il nuovo approccio che prevede l’impiego di cellule
staminali del liquido amniotico per generare tessuti o organi ingegnerizzati apre una
interessante prospettiva nel trattamento delle anomalie congenite complesse. L’ernia
diaframmatica congenita, anomalie cardiache, l’onfalocele e la gastroschisi hanno in comune
la presenza di un grande difetto muscolare. Varie matrici di polimero sono state utilizzate
con scarso successo. Infatti, serve una riparazione diaframmatica senza tensione muscolare
per contenere la crescente pressione addominale. Oltre al rischio delle infezioni,
l’inconveniente maggiore nell’utilizzo della chiusura con un materiale sintetico rimane il
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rischio di dislocamento con successiva rierniazione. Un’altra possibile tecnica impiegata è
stata l’utilizzo di materiali non-degradabili, ma queste procedure sono accompagnate da un
alto rischio di reazioni da corpo estraneo e conseguente rigetto.
L’obiettivo dell’ingegneria tessutale rimane l’impiego di tessuti naturali colonizzati da cellule
vitali per recuperare e/o ricostituire organi e tessuti danneggiati. Questa è una tecnica
alternativa alla ricostruzione chirurgica e al trapianto d’organi, quest’ultimo limitatodalla
disponibilità degli organi e dalla reazione immunitaria. L’ingegnerizzazione in vitro di un
tessuto muscolare scheletrico può prevenire l’infezione e il dislocamento e potrebbe
offrire dei risultati migliori a lungo termine. L’ingegneria tessutale in vitro si basa su tre
punti fondamentali: le cellule, gli scaffolds tridimensionali e i bioreattori. La scelta delle
cellule adatte per una cultura in vitro si basa principalmente sulla loro capacità di proliferare
conservando la loro attività biologica. Le cellule staminali sono delle popolazioni cellulari
uniche nella loro capacità di auto rinnovarsi e differenziarsi. Diverse fonti di cellule staminali
sono state identificate sia in modelli animali sia nell’uomo. Possono essere identificati in
molti tessuti adulti nei mammiferi, come ad esempio il midollo, il muscolo scheletrico, la
cute, il tessuto adiposo, dove queste cellule contribuiscono alla reintegrazione delle cellule
perdute per senescenza naturale o danno . Le cellule staminali adulte presentano una
rigenerazione cellulare limitata o un turnover tale da rappresentare una limitazione per
l’applicazione dell’ingegneria dei tessuti, in quei casi dove un gran numero di cellule
staminali è richiesto.
Il campionamento dei villi coriali e il prelievo del liquido amniotico tramite amniocentesi
sono delle tecniche consolidate per ottenere cellule per una diagnosi prenatale delle
malattie genetiche nell’uomo. Risultati di ricerche presentati dal nostro gruppo hanno
creato la base di partenza all’utilizzo dei villi coriale e liquido amniotico come fonte di cellule
staminali. Recenti pubblicazioni nostre edi altri gruppi di ricerca, hanno evidenziato, a vario
titolo, le potenzialità delle cellule staminali multipotenti provenienti dal liquido amniotico.
Con questo progetto noi proponiamo un’ approccio di ingegneria tissutale come terapia
post natale per l’ernia diaframmatica. Useremo una matrice decellularizzata, un
bioreattore e le cellule staminali come nuovo sostituto tissutale. Creeremo un modello di
danno diframmatico sul topo per provare a studiare l’efficienza di tale approccio di
ingegneria tissutale: in una prima fase(i) prenderemo dei diaframmi da donatori murini sani,
(ii) attraverso un processo di decellularizzazione le cellule del donatore saranno tolte dal
tessuto per rimanere solo con la matrice del muscolo. Tale supporto sarà sistemato
all’interno di un bioreattore, un apparecchio che conterrà le cellule staminali amniotiche e il
terreno necessario per farle crescere. In questo modo le cellule dovrebbero colonizzare il
diaframma del donatore. Nella seconda fase, sarà creato un buco nel diaframma del topo
ricevente, per mimare in questo modo l’ernia diaframmatica presente nei bambini appena
nati. Il buco sarà riparato dal nuovo diframma del donatore in cui sonostate seminate e sono
cresciute le cellule staminali amniotiche. Si dovrebbe così formare nuovo tessuto muscolare
sano e capace di seguire la crescita dell’organo come accade in un bambino.
Analisi funzionali e di biologia molecolare forniranno i dati scientifici che ci permetteranno di
valutare la bontà di tale approccio di medicina rigenerativa.
Padova, 21 settembre 2012
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