Regolazione espressione genica

Regolazione
dell’espressione
genica
1
Eucarioti pluricellulari
-un singolo organismo, utilizzando un unico genoma, deve produrre
centinaia di tipi cellulari differenti e specializzati.
-le cellule differenziate sono prodotte da popolazioni di cellule immature,
non specializzate, dette cellule staminali, attraverso un processo noto come
differenziamento cellulare.
2
I meccanismi di controllo usati per regolare l’espressione dei
geni umani a differenza di quelli dei procarioti, devono
riuscire a gestire quantità molto superiori di DNA,
“impacchettati” in strutture apparentemente inaccessibili.
3
•Regolazione trascrizionale
•Regolazione post-trascrizionale
•Meccanismi epigenetici e controllo
dell’espressione genica a lunga distanza
4
Cellula umana contiene circa 24000 geni
RNA genes (rRNA, tRNA, miRNA o MIR)
Geni per proteine
Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola
parte di questo potenziale (˜ 5000 geni)
Geni housekeeping
metabolismo
biosintesi
membrane cellulari
istoni
RNA ribosomiali
Geni tessuto - specifici
DIFFERENZIAMENTO
CELLULARE
5
Esistono molteplici livelli di regolazione
dell’espressione genica negli eucarioti
NUCLEO
Meccanismi epigenetici: controllo a lungo raggio
DNA
mediante rimodellamento della struttura della
cromatina
controllo trascrizionale: legame di fattori
trascrizionali tessuto specifici, legame diretto
di ormoni, fattori di crescita o elementi
Trascritto primario
intermedi a elementi responsivi di geni
(precursore)
inducibili
controllo post-trascrizionale: splicing alternativo,
polyA alternativo, RNA editing tessuto-specifico
mRNA
CITOPLASMA
controllo del trasporto
mRNA
controllo
traduzionale
traduzione
controllo della stabilità
degradazione
PROTEINA
controllo post-traduzionale
PROTEINA attiva o inattiva
6
Controllo Genomico
Decondensazione della cromatina e
espressione genica
7
Se
si procede all’estrazione della cromatina dalle
cellule, la si tratta con endonucleasi aspecifiche e si
procede quindi all’estrazione del DNA, si nota, dopo corsa
elettroforetica, che la maggior parte del DNA viene rotto in
frammenti di 200 bp o in multipli di tale lunghezza.
Il
DNA cromosomico è protetto dall’azione delle
nucleasi perché associato alle proteine istoniche.
8
Negli eucarioti superiori i geni inattivi da un punto di vista trascrizionale hanno una
struttura cromatinica meno accessibile
BamHI
4,6 kb
Globina
DNAseI
Eritroblasto embrionale di 14 giorni
BamHI
BamHI
4,6 kb
BamHI
Globina
DNAseI
Cellule non differenziate MSB
Isolamento dei nuclei e digestione con quantità crescente di DnasiI.
Estrazione DNA
digestione con BamHI
Analisi mediante Southern Blot
Ibridazione con globina
9
Geni attivi da un punto trascrizionale sono più suscettibili di quelli inattivi alla digestione
con DNAsiI
Sono in una conformazione cromatinica particolare che li rende più accessibili a
DNAsiI
Il DNA trascrizionalmente inattivo assume una conformazione cromatinica più
condensata che protegge il gene globinico dalla digestione con DNAsiI
DNA da Eritroblasti di 14 giorni
DnaseI (µg/ml)
0
0,01
0,05
0,1
0,5
1
1,5
DNA da cellule
MBS
1,5
4,6kb
10
Esistono
anche siti di ipersensibilità alla DnasiI,
evidenziabili con trattamenti più blandi.
Sono
siti probabilmente localizzati al 5’ dei geni
nelle regioni regolatorie dei geni e sono considerate
regioni in cui i nucleosomi sono stati rimossi e quindi
più accesibili alle proteine regolatorie
11
Gene Expression
La regolazione dell’espressione
genica può avvenire ad ogni
passaggio
Per la maggior parte dei geni
avviene a livello dell’inizio
della trascrizione.
Esso coinvolge cambiamenti
della struttura della
cromatina al promotore,
accompagnati dal legame
del apparato basale di
trascrizione (inclusa RNA
polymerase II) al promotore.
Eventi successivi possono
modificare il tipo di proteina
che viene espressa.
12
La decondensazione della cromatina
rappresenta un prerequisito
dell’attivazione trascrizionale
13
CROMATINA
•EUCROMATINA -> TRASCRIZIONE POTENZIALE
a) geni housekeeping
b) geni tessuto-specifici
•ETEROCROMATINA FACOLTATIVA -> inattiva quando condensata.
Fornisce un meccanismo di compensazione:
rapporto geni autosomici/geni X-linked
•ETEROCROMATINA COSTITUTIVA ->
sempre inattiva; Localizzata nelle regioni
peri - e centromeriche
14
I meccanismi epigenetici
Fattori che vengono trasmessi alla progenie, ma che non sono
direttamente attribuibili alla sequenza del DNA.
I geni mappano tutti in regioni le cui caratteristiche
generali possono essere definite inizialmente
eucromatiche.
In questa regioni, ancora una volta, agiscono i
meccanismi epigenetici per tenerle più o meno aperte e
quindi più o meno disponibili ad interagire con i
meccanismi di controllo trascrizionale.
Durante il differenziamento alcune di queste regioni
possono eterocromatizzare definitivamente.
15
L’INATTIVAZIONE DEL CROMOSOMA X
È UN PROCESSO EPIGENETICO
16
L’inattivazione del cromosoma X è un processo epigenetico, cioè un
processo che influenza l’espressione di geni specifici ed è ereditato dalle cellule
figlie senza che avvenga alcuna variazione nella sequenza del DNA.
L’attività dei geni del cromosoma X nelle femmine dei mammiferi è
controllata da strutture cromatiniche piuttosto che dalla sequenza
nucleotidica del DNA che forma il cromosoma.
Il cromosoma X inattivato (sia esso Xmaterno o Xpaterno) è mantenuto nello
stato di cromosoma inattivo nella progenie che deriva dalle future divisioni
cellulari poiché gli istoni, modificati in modo da determinare repressione
trascrizionale, sono fedelmente ereditati in questo stato ad ogni divisione
della cellula.
17
I meccanismi epigenetici
•Metilazione del DNA
Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a carico della Citosina.
Solo il 3% delle Citosine sono metilate ed in genere è bersaglio
della metilazione la Citosina della doppietta CpG (dinucleotide
citosina-guanina).
•Modificazioni degli istoni
Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni,
cambiamenti conformazionali della cromatina.
responsabili
di
18
Meccanismi epigenetici: Metilazione del DNA
La metilazione del DNA è un processo post-replicativo. L’estensione delle modificazioni riguardanti
la metilazione del DNA è fondamentalmente decisa durante lo sviluppo. La metilazione del DNA è
quindi uno dei meccanismi correlati con il differenziamento cellulare, tramite l’inibizione
dell’espressione genica a livello trascrizionale.
19
CpG islands sono bersagli di
regolazione
• CpG islands circondano i promotori di geni
espressi costitutivamente e sono non-metilate.
• Si trovano anche ai promotori di qualche gene
tessuto-regolato.
• Ci sono ~29,000 CpG islands nel genoma
umano.
• La metilazione di una CpG island impedisce la
attivazione di un promotore.
• La repressione è causata da proteine che si
legano alle doppietta CpG metilate.
20
Quali regioni sono bersaglio della metilazione?
•Nel genoma umano il 56% dei geni sono associati a isole CpG: tutti i geni housekeeping ed
il 40% dei geni con espressione tessuto-specifica
•I geni tessuto-specifici sono metilati in CpG nei tessuti dove non sono espressi in quanto i
geni metilati sono silenti.
(B)
21
Cambiamenti dello stato di metilazione del DNA
durante lo sviluppo dei mammiferi
Durante la segmentazione si ha subito una fase di
demetilazione, seguita da una metilazione “de novo”
dispersa su tutto il genoma, dopo l’impianto.
La metilazione de novo è rara dopo la gastrulazione, ma è
stata vista frequentemente durante la stabilizzazione
di colture in vitro e nei tumori.
22
Metilazione del DNA e divisione cellulare
La metilazione del DNA è mantenuta
durante la replicazione
23
espressione genica è associata
alla demetilazione
• Demetilazione al 5 ′ del gene è
necessaria per la trascrizione.
24
Meccanismi epigenetici: Modificazioni degli Istoni
I residui amminoacidici all’N-terminale di ciascun istone (20-60 residui) si
estendono al di fuori della superficie del nucleosoma.
Queste regioni sono particolarmente ricche in lisina (K) che può essere
reversibilmente modificata mediante acetilazione, fosforilazione e
metilazione.
25
26
Modificazioni degli istoni H3 e H4
La lisina 9 di H3 può essere sia acetilata che metilata.
L’acetilazione è associata alla cromatina trascrizionalmente
attiva, ma se la regione cromatinica viene metilata a livello del
DNA (CpG).
Le proteine che si legano al DNA metilato richiamano le
deacetilasi istoniche, che rimuovono i gruppi acetile e le
metil transferasi istoniche, legate alle CpG binding protein,
metilano gli istoni.
Il risultato è la condensazione della cromatina.
27
L’acetilazione degli istoni è associata al controllo
dell’espressione genica.
Il grado di acetilazione degli istoni regola l’espressione genica.
Gli istoni acetilati hanno un’affinità ridotta per il DNA, quindi la cromatina è più aperta.
La repressione delle sequenze CpG metilate nei promotori è legata a due proteine
che si legano a CpG metilati ed attivano la deacetilazione degli istoni.
MeCP1 e MeCP2 (methylated Cpg-binding proteins 1 and 2)
28
L’acetilazione degli istoni è associata al controllo
dell’espressione genica
MeCP2 acts as a trascriptional repressor and recruits a corepressor complex
consisting of the tracription factor repressor mSin3A and histone deacetylase.
MeCP2 è essenziale per lo sviluppo embrionale e si comporta
come repressore funzionale.
MeCP2 silenzia l’espressione di geni mediante il
reclutamento dell’attività di HDAC (histone deacetylase)
che causa il rimodellamento della cromatina.
La rimozione del gruppo acetile dell’istone 3 lisina 9 (H3-K9) è seguita dalla
metilazione che rappresenta il segnale per proteine quali HP1 che causa la
condensazione della cromatina
29
Nelle cellule umane, la proteina HP1 si
lega alle code dell’istone H3, metilato a livello della lisina 9
HP1
Me
9
Me
9
30
Silenziamento del telomero
• I telomeri (e centromeri) sono generalmente
nell’eterocromatina. I geni sono silenziati
• Nel telomeri agisce la prot Rap1 che recluta SIR. Sir2
è una deacetilasi, Sir3 e 4 reclutano altri SIR ed
espandono il silenziamento
• SIR = Silent Information Regulator
31
Le modificazioni delle code istoniche sono importanti per il
successivo assemblamento di fattori di eterocromatinizzazione.
In lievito, le proteine SIR si legano
alla coda di H4 non acetilata
Me
9
Me
9
32
Le proteine eterocromatiniche condensano
la fibra di 30nm in una struttura
maggiormente impaccata
33
Le modificazioni delle code istoniche controllano la
condensazione e la funzione della Cromatina
Le code istoniche sono necessarie affinchè la cromatina possa
condensarsi da una struttura a filo di perle ad una fibra di 30nm.
Recenti esperimenti indicano che le estrmità N-terminali dell’istone
H4, in particolare la lisina 16, sono elementi cruciali per la formazione
della fibra da 30 nm.
Le code istoniche sono soggette a modificazioni post-trduzionali
multiple, quali acetilazione, metilazione, fosforilazioe, e ubiquitinazione.
Una proteina istonica non ha mai tutte queste modificazioni
simultaneamente, ma gli istoni di un singolo nucleosoma possono
contenere diversi tipi di modificazioni.
34
Attivazione per alterazione della
struttura della cromatina
L’attivatore recluta:
– Istone acetilasi o chromatin remodeling complexes
– Facilita il reclutamento di proteine con bromodomini (es. TFIID)
35
Legame cooperativo
degli attivatori
• Gli attivatori agiscono in
modo sinergico.
• Ciò può avvenire in
diversi modi, e con
legami cooperativi
36
Modificazioni covalenti delle code degli istoni
alterano l’accessibilità della cromatina.
Lisine: acetilate o metilate
Serine: fosforilate
Acetilazione: trascrizione attiva
Deacetilazione: trascrizione repressa
Metilazione: sia attivazione che repressione
Proteine con bromodominio riconoscono code
istoniche acetilate
Proteine con cromodominio riconoscono code
istoniche metilate
37
Il cromodominio HP1 lega la coda N-terminale dell’ istone H3 solo quando
la lisina 9 è trimetilata.
HP1 contiene un secondo dominio, chiamato dominio cromo-ombra, che
si trova frequentemente in proteine che contengono cromo domini.
Il dominio cromo-ombra, lega altri domini cromo-ombra ed è per
questo che la cromatina con la lisina 9 di H3 trimetilata tende a
condensarsi per mezzo di HP1.
Oltre a legare se stesso il dominio cromo –ombra lega l’enzima che
metila la lisina 9 di H3, noto come meliltrasferasi istonica H3K9 (HMTH3K9).
38
Gli attivatori alterano la cromatina
• Acetilazione
degli istoni e
rimodellament
o dei
nucleosmi
sono indotti
dagli attivatori
39
Acetilazione degli istoni
• L’attivatore lega HAT la
cui attività chiama altri
attivatori
• Il bromodomain di TFIID
riconosce alcune lisine
acetilate della coda di
H4, che sono associate
a regioni della cromatina
attive nella trascrizione
40
CARATTERISTICHE DELLA CROMATINA
Caratteristica
Cromatina
attiva
Cromatina
inattiva
Conformazione Estesa, aperta Condensata
della cromatina
Metilazione del Pocometilata Metilata
DNA
specialmente
nelle regioni
del promotore
Acetilazione
Istoni acetilati Istoni non
degli istoni
acetilati
41
Controllo Trascrizionale
Il metodo principale col quale avviene il
controllo dell’espressione genica negli
eucarioti è una trascrizione selettiva, che
si ottiene grazie a specifiche “DNA
binding proteins”.
42
REGOLAZIONE GENICA A LIVELLO
TRASCRIZIONALE
LA REGOLAZIONE GENICA A LIVELLO TRASCRIZIONALE
AVVIENE ATTRAVERSO IL LEGAME DI FATTORI PROTEICI A
SEQUENZE NUCLEOTIDICHE DI REGOLAZIONE.
I
FATTORI
PROTEICI
IMPEGNATI
A
REGOLARE
L’ESPRESSIONE GENICA AGISCONO IN TRANS LEGANDOSI
ALLE SEQUENZE DI DNA CHE SONO IN PROSSIMITA’ DEL
GENE (IN CIS)
43
Fattori coinvolti in
gene expression
• I fattori basali insieme alla RNA
polymerase, si legano allo startpoint e
TATA box
• Gli Attivatori sono fattori di trascrizione
che riconoscono specifici elementi di
corte sequenze consenso.
• Si legano a siti nel promotore o negli
enhancers.
• Le sequenze che legano vengano
chiamate response elements.
• I Coattivatori danno un collegamento tra
gli attivatori e l’apparato basale.
• Non legano il DNA
• Alcuni regolatori inducono cambiamenti
nella cromatina
44
Sinergia nella trascrizione
• Gli attivatori agiscono su molti passaggi
diversi e la loro azione è sinergica
45
Attivatori hanno domini di legano il DNAbinding e di attivazione
Le attività DNA-binding e di attivazione della trascrizione
sono in domini indipendenti di un attivatore. Il ruolo del
dominio DNA-binding è di portare il dominio di
attivazione della trascrizione vicino al promotore.
Gal4 regola la trascrizione del gene del galattosio in S.
cerevisiae. Si lega a un sito di 17 bp.
Ci sono 4 siti, ciascuno lega un dimero di Gal4, che
formano la UASG (Upstream Activating Sequence di
Gal)
46
Come fa un attivatore a stimolare
la trascrizione
Due modelli generali :
• Il modello di reclutamento implica che il
solo effetto è di aumentare il legame della
RNA polimerase al promotore.
• Un modello alternativo è che esso induca
dei cambiamenti conformazionali nel
complesso trascrizionale, che ne aumenta
l’efficienza.
47
Attivazione per reclutamento
• L’attivatore può legare il mediatore che è
associato alla pol-II o a fattori di trascrizione
(TFII-D)
48
• I coattivatori sono fattori di
trascrizione la cui specificità è
data dalla capacità di legare
DNA-binding transcription
factors invece di legare
direttamente il DNA.
• Quando un attivatore
funziona tramite un
coattivatore la connessione
prevede legami non covalenti
tra le due proteine
I contatti con l’apparato basale
possono essere fatti con ognuno
dei vari fattori basali,
tipicamente TFIID, TFIIB, or
TFIIA.
49
• Tutti i componenti necessari
per una trascrizione efficiente:
• basal factors,
• RNA polymerase,
• activators,
• coactivators
formano un apparato molto
grande, di >40 proteine.
• Alcuni attivatori, coattivatori, e
fattori basali possono
assemblarsi uno dopo l’altro
al promotore, ma poi possono
unirsi ad un complesso molto
grande fatto dalla RNA
polimerasi preassemblata con
altri attivatori e coattivatori.
50
• Una serie di fattori trascrizionali deve legarsi al
promotore prima che possa farlo la RNA
polimerasi.
• Quindi se la RNA polimerasi potrà iniziare la
trascrizione dipenderà anche dal legame di proteine
regolatorie, attivatori e repressori.
Elementi distali
Elementi
prossimali
Promotore
basale
51
Il promotore del gene umano dell’insulina
Nero: fattori ubiquitari
Rossi: fattori specifici delle cellule beta pancreatiche
52
Gli attivatori trascrizionali sono proteine modulari
composte da distinti domini funzionali
53
Repressori e attivatori possono dirigere la
deacetilazione/acetilazione degli istoni a
livello di specifici geni
Importanza della struttura modulare
e delle interazioni proteina-proteina
54
55
Attività a distanza: anse e isolatori
• Gli enhancers agiscono anche a 100 kb dal gene.
• Essi possono essere portati sul gene dalla
formazione di anse e dalla struttura della cromatina
• Gli insulators bloccano l’attivazione promossa dagli
enhancers
56
Enhancer
Una sequenza enhancer classica contiene al suo interno
parecchi elementi di controllo differenti, ognuno dei quali
è costituito da una corta sequenza di DNA che funziona
da sito di legame per uno specifico fattore di trascrizione
regolativo (attivatore).
Spesso i siti di legame possono essere gli stessi
presenti nelle sequenze prossimali.
I silencer sono meno abbondanti, legano fattori in grado
di ridurre l’efficienza di trascrizione (repressori).
57
L’enhanceosome dell’interferone
beta
• IFN-beta è indotto da
infezione virale
• Questa causa la
sintesi di NFkB, IRF e
Jun/ATF
• Questi si legano ad
unsito 1 kb upstream il
promotore in un
complesso cui
partecipa HMG, un
fattore strutturale
58
Insulators
• Gli insulators delimitano un dominio di espressione
• si localizzano preferenzialmente nelle interbande
• possono bloccare il passaggio degli effetti attivanti o
disattivanti dagli enhancers, silencers, o LCRs.
• possono agire da barriera contro la propagazione
della heterochromatin
59
Insulators e struttura della
cromatina
• Forse gli insulators
agiscono sulla
struttura del DNA
• Possono organizzare
anse di DNA che
limitano le interazioni
attivatore-promotore
60
Il cluster dei geni delle betaglobine
• L’espressione dei
5 geni cambia con
lo sviluppo
• Tutti i geni sono
sotto il controllo di
LCR
• LCR controlla la
condensazione
della cromatina
61
Regioni di controllo: LCR
• Il Locus Control Region (LCR) è 30-50 kb a monte
dei geni della beta-globina. Regola l’apertura della
cromatina per l’accesso dei fattori di regolazione
62
COMPETIZIONE
10_23_2.jpg
l’espressione di alcuni geni (geni umani delle globine) è coordinata da
una regione di controllo dominante LCR localizzata a monte dei geni
delle globine
63
z2e2, Emoglobina Embrionale (espressione nel sacco vitellino)
a2g2 HbF Emoglobina fetale (espressione nel fegato e nella milza)
a2d2 HbA2 Emoglobina dell’adulto
a2b2 HbA
Le LCR funzionano da enhancer per la trascrizione dei geni globinici
Altri siti ipersensibili nella regione dei promotori dei singoli geni ->
specificità dello stadio di sviluppo.
Siti ipersensibili a DNAsi I
Eritroide-specifici (enhancer)
Siti ipersensibili del fegato fetale
Siti ipersensibili nel midollo osseo adulto
64
Esempio: beta globina
• Proteine regolatorie:
• GATA-1 (fattore di trascrizione) è eritroidespecifica
• CP1 (fattore di trascrizione) ubiquitaria
65
Alcune proteine che legano il
promotore sono repressori.
• La repressione solitamente avviene
modificando la struttura della cromatina, ma
ci sono repressori che agiscono legandosi a
promotori specifici.
• repressori Eucariotici che bloccano la
trascrizione sono relativamente rari. Un esempio
è il repressore globale NC2/Dr1/DRAP1, un
eterodimero che lega TBP(TATA Box-Binding
protein) per impedirne la interazione con altri
componenti del apparato basale
66
Repressori
67
SWI/SNF: (proteine che rimodellano la cromatina)
HAT: (histon acetiltransferasi)
Gli attivatori interagiscono con i
coattivatori e stimolano il
rimodellamento della cromatina e
l’acetilazione degli istoni
Un grosso complesso multiproteico, detto
mediatore funge da ponte, legando sia le proteine
attivatrici, associate all’enhancer, sia la RNA pol., in
modo da connettere gli enhancer con i componenti
coinvolti nell’inizio della trascrizione genica.
68
Ciascun elemento presente in un promotore possiede una specifica sequenza
consenso che lega i fattori di attivazione ubiquitari della trascrizione.
Il legame dei fattori trascrizionali avviene nel sito consenso che include un
numero variabile di nucleotidi a seconda del promotore.
CTF è un membro di una famiglia proteica di fattori trascrizionali
NF-1 è un fattore nucleare-1
SP-1 è un fattore trascrizionale ubiquitario
69
Regolazione della trascrizione da glucocorticoidi
Gli ormoni lipofili diffondono attraverso la membrana plasmatica, ma
solo nelle cellule bersaglio trovano il loro recettore specifico ad elevata
affinità, con cui si associano.
Il complesso ormone-recettore va incontro ad una “reazione di
attivazione” temperatura e concentrazione salina dipendente, che ne
determina un cambiamento delle dimensioni, della conformazione e della
carica superficiale che lo rendono capace di legarsi alla cromatina.
In alcuni casi, come nel caso del recettore per i glucocorticoidi,
l’attivazione provoca la dissociazione del recettore da un’altra proteina
come la proteina 90 da shock termico (HSP 90).
70
HSP90 maschera il sito legante il DNA dei Recettori per
gli steroidi
DNA
SR
hsp90
Elementi di Fisiologia – A.A. 2004-2005
Attivazione della trascrizione genica operata da recettori
nucleari per gli ormoni steroidei (ER)
E2
hsp50
ER
hsp70
hsp90
hsp50
hsp70
ER
hsp90
ER ER
hsp90
hsp90
hsp50
hsp70
hsp50
HAT
Histone-Acetyl-Transferase
ER ER
TATA
Elementi di Fisiologia – A.A. 2004-2005
hsp70
Il complessso recettore-ormone si lega a specifici regioni del DNA
(dette elementi di risposta dell’ormone) determinando l’attivazione
oppure l’inattivazione di specifici geni.
Si ha cosi una selettiva modulazione della trascrizione di particolari
geni e della produzione delle corrispondenti molecole di mRNA, in
questo modo gli ormoni riescono a controllare la sintesi di specifiche
proteine e a influenzare i processi metabolici della cellula.
73
L’HRE deve associarsi con altri elementi per agire in modo ottimale.
Questi complessi di DNA sono detti unita’ di risposta all’ormone (HRU) .
Quindi una HRU è costituita da una o più HRE e uno o più elementi di DNA
asssociati con fattori accessori.
La comunicazione tra un HRU e l’apparato trascrizionale di base è resa
possibile dall’intervento di una o piu’ molecole appartenenti a una classe di
coregolatori.
La prima di queste molecole ad essere stata descritta è la proteina legante
CREB (la proteina legante l’elemento di risposta al cAMP) detta CBP.
74
CBP attraverso un dominio amminoterminale, lega il residuo fosforilato di
serina 137 di CREB mediante la transattivazione in risposta al cAMP.
CBP e un’altra proteina strettamente correlata, la P300, interagiscono
con
diverse molecole segnalatrici tra cui la proteina attivatrice-1 (AP-1), trasduttori
del segnale, attivatori della trascrizione (STAT), recettori nucleari e CREB.
E’ importante notare che il complesso CBP/P300 presenta
anche un’attivita’
intrinseca istone acetil-transferasica (HAT).
75
Regolazione della trascrizione da ormoni
steroidi
In molti geni regolati dagli ormoni steroidei è stato individuato un
secondo elemento di risposta (HRE) che si trova all’estremita’ 5’ rispetto
all’elemento promotore.
L’HRE presumibilmente modula la frequenza di inizio della trascrizione
e dipende in misura minore dalla posizione e dall’orientamento. Sembra
che sia simile agli elementi amplificatori della trascrizione presenti in altri
geni.
76
Diversi elementi hanno effetti diversi sul livello di trascrizione, alcuni con
effetti maggiori di altri, e alcuni possono anche attivare la risposta tessuto
specifica.
Il legame dei fattori trascrizionali all’elemento di risposta per gli steroidi,
modula la frequenza di trascrizione del messaggero.
MyoD è un fattore specifico delle cellule muscolari
GRE è l’elemento di risposta ai glucocorticoidi
77
Somiglianza fra i diversi recettori steroidei
Nei recettori steroidei, le regioni di legame per il DNA e quelle di legame per
gli ormoni condividono un alto grado di omologia.
Il recettore per gli estrogeni è meno simile al recettore dei glucocorticoidi di
quanto non lo siano gli altri recettori steroidei.
AR=recettore degli androgeni; ER=recettore per gli estrogeni; GR=recettore per i
glucocorticoidi; MR=recettore per i mineralcorticoidi; PR=recettore per il
progesterone.
I numeri indicano il grado di omologia
78
Come avviene
l’interazione DNAproteine?
Le proteine con DNA binding
domains hanno dei motivi
particolari:
A) Motivo helix-turn-helix (elicagiro-elica), consiste di due a
eliche
separate
da
un
ripiegamento
della
catena
polipeptidica.
Il motivo è sempre lo stesso: una a
elica di riconoscimento, che con
le catene laterali dei suoi
residui amminoacidici riconosce
specifiche sequenze di DNA
(posizionate nel solco maggiore
della doppia elica) alle quali si
lega
(leg.
idrogeno).
La
seconda a elica stabilizza la
conformazione generale.
C) Motivo Zinc finger (a dita di
zinco), è constituito da una a elica e
da due segmenti a foglietti b, tenuti
insieme da residui di cisteina o
istidina, posti in modo preciso, con
un atomo di zinco .
Il numero di zinc finger varia tra un
fattore di trascrizione e un altro. Le
strutture zinc finger protrudono dalla
superficie della proteina e servono
da punto di contatto con specifiche
sequenze di DNA posizionate nel
solco maggiore della doppia elica.
79
Le dita di zinco sono sequenze molto comuni che permettono alla proteina di legare il
DNA a doppio filamento.
X= qualsiasi amminoacido
80
D) Motivo leucine zipper (a cerniera di leucine), è
formato dall’interazione di due catene
polipeptidiche, ognuna contenente una α elica con
residui di leucina (a.a. idrofobico) regolarmente
spaziati.
Le leucine, interagendo tra di loro, provocano un
attorcigliamento delle due eliche. Il motivo è
utilizzato per unire due polipeptidi uguali o diversi.
Il legame al DNA è reso possibile dalla presenza di
due ulteriori regioni ad α elica che interagiscono
con le sequenze del solco maggiore.
E) Motivo helix-loop-helix (elicaansa-elica), consiste di due α
eliche una più piccola e una più
grande, separate da un’ansa.
I motivi helix-loop-helix
contengono regioni idrofobiche
che permettono di connettere due
polipeptidi uguali o diversi.
La formazione di un fascio di 4 α
eliche provoca la giustapposizione
dell’elica di riconoscimento di un
polipeptide con quella dell’altro,
creando così un dominio di legame
al DNA bipartito.
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Il legame dei fattori trascrizionali al DNA coinvolge una piccola
porzione di proteina, la quale entra in contatto con il solco maggiore
e/o solco minore della doppia elica del DNA che deve essere trascritto.
Le cerniere di leucina possiedono sempre dei residui idrofobici di
leucina da un lato dell’elica, che permettono a due cerniere di leucina
d’interagire tra loro attraverso legami idrofobici.
HTL= elica-ansa-elica; HTH= elica-giro-elica
82
Controllo post-trascrizionale
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L’uso di promotori alternativi, di splicing alternativi, di poliadenilazioni
alternative e di editing, può dare luogo a isoforme diverse con proprietà
differenti quali :
•Isoforme tessuto-specifiche. Gene DMD (gene mutato nella distrofia muscolare di
Duchenne) presenta otto promotori diversi a seconda del tessuto, che danno origine a
8 diverse proteine
•Isoforme stadio di sviluppo specifiche
•Isoforme transmembrana o solubili
•Diversa localizzazione cellulare
•Funzione cambiata -> isoforme di fattori trascrizionali che agiscono da attivatori o
repressori a seconda dei domini contenuti
Lo splicing alternativo è controllato da proteine che si legano alle molecole di premRNA e fanno in modo che alcuni siti di splicing non vengano utilizzati e altri siano
invece attivati.
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L’editing ( modifica ) dell’RNA del gene APOB nell’uomo genera
trascritti
tessuto-specifici
Nell’intestino tenue, l’editing del nucleotide 6666 del mRNA di ApoB, cambia
una citosina in uracile, converte un codone per la glutammina nel mRNA per
ApoB 100 in un codone stop prematuro e quindi produce la proteina troncata
ApoB 48.
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Il legame di proteine specifiche all’elemento di risposta per il ferro (IRE) dell’mRNA di un
gene che risponde alle variazioni delle concentrazioni di ferro, può alterare in diversi modi la
traduzione dell’mRNA in proteine funzionali.
Quando si manifesta una carenza di ferro, la proteina che lega l’elemento di risposta al ferro
(IRE-BP) è attiva e può legarsi all’estremità 3’ dell’mRNA per il recettore della trasferrina.
Questo evento previene la degradazione dell’mRNA e quindi aumenta la quantità di recettore
per la trasferrina che può essere sintetizzata (parte sinistra della figura) aumentando di
conseguenza la quantità di ferro che il recettore può inviare alla cellula.
La IRE-BP lega anche l’estremità 5’ dell’mRNA per la ferritina e blocca la traduzione.
La ferritina è una proteina che sequestra e immagazzina nel citoplasma il ferro e risulta meno
richiesta in condizione di carenza di ferro.
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I cromosomi sessuali sono di due tipi, X e Y, con l’X sostanzialmente più grande dell’Y.
Le femmine possiedono due cromosomi X, mentre i maschi hanno un cromosoma X e uno Y.
Una regione del cromosoma Y è identica a una regione del cromosoma X, ma il cromosoma X
contiene anche geni che non sono presenti sul cromosoma Y, per esempio SRY un gene
determinante il sesso.
Questi geni sono monoallelici e non hanno alcuna possibilità di scelta per quale allele verrà
scelto.
Nell’uomo, i geni sono stati identificati come biallelici, ma solo un allele, materno o paterno, è
espresso prevalentemente, nonostante entrambi gli alleli siano perfettamente normali e identici.
87
Il risultato è che il 50% dei prodotti genici viene sintetizzato, ma il prodotto è
funzionalmente attivo.
Quindi, in ogni caso , nelle femmine uno dei due cromosomi X è inattivato durante una fase
precoce dell’embriogenesi.
Il cromosoma X-inattivato può ancora esprimere alcuni geni, incluso l’XIST ( trascritto
specifico dell’X inattivato ) il quale codifica per un RNA che gioca un ruolo fondamentale nella
inattivazione dell’X.
Il cromosoma X-inattivato viene riattivato nelle femmine durante l’ovogenesi.
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Controllo della traduzione
La sintesi della globina nei reticolociti ( globuli rossi immaturi )
procede rapidamente, ma solo se è disponobile eme.
L’inibizione della sintesi della globina avviene a livello
dell’inizio della traduzione.
In assenza di eme i reticolociti accumulano una proteina detta
inibitore regolato dall’eme ( HRI).
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L’ HRI è una chinasi che fosforila un residuo di Ser 51 della
subunità α del fattore eIF2 ( il fattore d’inizio che trasporta GTP e
Met-tRNAimet sul ribosoma).
Il fattore eIF2 fosforilato può partecipare all’inizio della
traduzione così come il fattore eIF2 non fosforilato, ma non è
rigenerato.
Dopo aver completato il processo d’inizio, il fattore IF2 non
modificato scambia il GDP legato con il GTP, in una reazione
innescata da un altro fattore di inizio “eIF2B” .
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L’IF2 fosforilato forma un complesso
molto più stabile con il fattore “eIF2B”
rispetto a quello formato con il fattore
IF2 non foforilato.
Ciò determina il sequestro di “eIF2B”
che è presente in quantità inferiori
rispetto a eIF2, e impedisce la
rigenerazione del complesso eIF2GTP necessario per la traduzione.
In presenza di eme, i siti di legame
dell’eme su HRI sono occupati e la
chinasi è inattiva.
Le molecole di eIF2 già fosforilate sono
riattivate dalla eIF2 fosfatasi, che non è
influenzata dall’eme.
Il reticolocita coordina quindi la sua sintesi di globina e di eme.
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Le chinasi ciclina dipendenti regolano la
crescita cellulare
Le cicline presenti in molti eucarioti, si combinano con una proteina con una
massa di 34 kD e formano una proteina chinasi Ser/Thr attiva detta proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK) che per essere attiva può richiedere una sua
fosforilazione.
Il cico cellulare dell’uomo è governato da diverse CDK.
Esse fosforilano numerose proteine nucleari, tra cui l’istone H1, diverse
proteine oncogeniche e proteine coinvolte nell’organizzazione del citoscheletro
e nella disgregazione del nucleo.
CDK2 nell’uomo è stata determinata in diverse condizioni conformazionali:
(1) legata all’ATP
(2) legata all’ATP e al frammento C-terminale della ciclina A
(3) legata all’ATPγS ( un analogo dell’ATP che si idrolizza molto
lentamente) e al frammento C-terminale della ciclina A, e con il
residuo Thr 160 della CDK2 fosforilato.
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Fattori di trascrizione
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Fattori di trascrizione
La trascrizione del gene è iniziata e regolata da numerose e diverse
proteine che legano il DNA in maniera sequenza specifica, conosciute col
nome di fattori di trascrizione.
Questi fattori si legano a specifiche sequenze nucleotidiche e producono
la differente espressione del gene, non solo durante lo sviluppo, ma anche
all’interno dei tessuti e dell’organo adulto.
Molti fattori trascrizionali agiscono in maniera positiva, promuovendo la
trascrizione, mentre altri agiscono in maniera negativa promuovendo la
repressione.
I fattori di trascrizione qualche volta vengono chiamati fattori trans-agenti,
per enfatizzare che, come proteine solubili, essi possono diffondere all’interno
del nucleo e agire su più geni diversi localizzati su cromosomi diversi.
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Modello d’azione dei fattori di trascrizione
T1, T2, T3, T4, si legano alle loro sequenze di DNA bersaglio e
contemporaneamente in gruppi di due mediante interazioni relativamente non
specifiche al complesso di pre-inizio (PIC).
L’interazione fattore di trascrizione-PIC inizialmente debole, si rafforza
consentendo alla RNA polimerasi di attaccarsi al PIC e di iniziare la trascrizione.
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Struttura a raggi X del complesso CDK2ciclina A-ATPγγS, in cui la CDK2 è fosforilata
a livello del residuo di Thr 160
Il ciclo cellulare degli eucarioti
La progressione delle cellule nel ciclo è determinata da modificazioni covalenti quali
aggiunta o eliminazioni di gruppi fosfato.
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Alcune forme di cancro derivano dalla soppressione dei repressori
dei tumori
Uno dei bersagli delle CDK è la proteina del retinoblastoma (Rb), che
inibisce la crescita cellulare bloccando la funzione del fattore di trascrizione E2F.
Questo fattore attiva i geni che innescano la proliferazione cellulare,
compresi quelle delle cicline.
La fosforilazione della proteina Rb da parte di CDK blocca l’attività
antiproliferativa di Rb . La proteina Rb è nota come soppressore di tumori, in
quanto la sua assenza può portare al retinoblastoma ( un cancro della retina) e
altri tipi di tumori.
L’attività di E2F è anch‘essa inibita dalla fosforilazione catalizzata da alcune
forme di CDK.
Il fattore di trascrizione e soppressore di tumori p53 viene attivato, a
differenza di E2F, dalla fosforilazione catalizata da CDK. La proteina p53
fosforilata si lega a specifici geni e agisce come un potente fattore di trascrizione.
Nel 50% di tipi di cancro dell’uomo sono presenti mutazioni della proteina
p53.
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Alcune forme di cancro derivano dalla soppressione
dei repressori di tumori
Struttura ai raggi X del dominio che lega il DNA della proteina p53 dell’uomo
unita al suo DNA bersaglio
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FINE
100