enzima partire -quando

Corso di Bioinformatica e Statistica A.A. 2016-2017
parte V (Bioinformatica per la Biologia Sintetica e
l’ingegnerizzazione biotecnologica)
Domain engineering:
- simple repeat domains (ankyrin, LRR etc):
convolti in legami omo-eterofilici e
multimerizzazione
- modulazione superfici di contatto: variazione
specificità di binding (ricordano gli Ab...)
- esempio DARPins
(Designed Ankyrin Repeat Proteins)
- esempio vNAR
(shark variable Ig-New Antigen Receptor)
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parte V (Bioinformatica per la Biologia Sintetica e
l’ingegnerizzazione biotecnologica)
DARPins:
- simple repeat domain (ankyrin, LRR)
- più piccole degli Ab monoclonali...
- progettabili direttamente self! (human sequence)
- Next Gen anticancer tools
vNAR: Ig-like fold within single chain antibody
pharma target: Aurora kinase (neuroblastoma)
natural binder: TPX2 (allosteric activation)
biotech binder: selected vNAR (allosteric inhibition)
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parte V (Bioinformatica per la Biologia Sintetica e
l’ingegnerizzazione biotecnologica)
StaRProtein:
predittore web della stabilità di Repeat Proteins/domains
basato su (come al solito in bioinformatica...):
-valutazioni chimico fisiche
(potenziali all-atom distance-dependent)
-confronto con dati empirici in database
(database generale di proteine α+β,
αonly e β only)
α- calcolo di potenziali repeat-specific
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parte V (Biocatalisi) e parte VI (Bioinformatica
per le Biotecnologie Ambientali)
Biocatalisi:
esiste da sempre? (enzimi e ribozimi catalizzavano reazioni molto prima che i biotecnologi - e l’uomo esistessero .....). In realtà la biocatalisi comprende vari approcci per:
- potenziare l’attività di enzimi
- modularne (ampliare/restringere) la specificità substrato
- modificarne (sostituzione) la specificità substrato
- integrare catene multienzimatiche (bridge, chimere)
- spostare l’attività in un nuovo sistema cellulare
-creare (più o meno ex novo) attività nuove
Spesso è parte di progetti di green chemistry (sostituire la catalisi inorganica/organica per ridurre
impatto ambientale e/o costi). Talora, invece, ha l’obiettivo di:
- migliorare la resa di processi già esistenti
- rendere scalabili industrialmente processi che sono mediati in natura in organismi non facilmente
coltivabili o da elementi difficilmente purificabili.
Viene realizzata con tecnologie ricombinanti di tre tipi:
- non guidate dalla bioinformatica
- guidate dalla bioinformatica
- combinazione di guidate e non
Un esempio del primo tipo è la directed evolution (trattata con altri esempi nel corso di Tecnologie
Ricombinanti Avanzate); queste lezioni trattano, invece, approcci “computer-aided”.
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parte V (Biocatalisi) e parte VI (Bioinformatica
per le Biotecnologie Ambientali)
Biocatalisi:
gli approcci di biocatalisi “computer-aided” possono:
- partire da un enzima naturale e usare la bioinformatica (ed anche approcci non bioinformatici) per
ingegnerizzare tale enzima nel senso voluto (rational engineering)
- progettare in silico (tramite modeling, MD etc.) attività enzimatiche nuove (computational design)
Un esempio di enzimi ingegnerizzati in biocatalisi sono le aldolasi, capaci di mediare condensazioni
aldoliche in condizioni favorevoli (alta resa, stereospecificità modulabile)
La sintesi organica di prodotti delle aldolasi è problematica dalla presenza in essi di numerosi gruppi
funzionali; tuttavia, non esistono aldolasi naturali in grado di catalizzare tutte le condensazioni di
interesse -> ingegnerizzazione.
Una modifica in senso biotecnologico delle aldolasi (ma di tipo generalizzabile a tutti gli enzimi) è
l’incremento di stabilità: ciò può essere realizzato per DNA shuffling, creando chimere tra il gene
della specie “ cell factory” (ad es. E. coli) e ortologhi di specie con aldolasi/enzimi “più resistenti”. In
questo processo, la selezione dei frammenti per il lavoro di “taglia e inserisci” è guidato da fasi di
allineamento multiplo di sequenza e di creazione di modelli da sovrapporre.
L’incremento di stabilità può essere ottenuto in due modi:
- partendo da enzimi molto processivi per renderli più resistenti con “trapianti” da geni ortologhi termofili
- trapianto inverso nel gene che codifica una proteina resistente, per renderla più processiva.
Combinando rational design e directed evolution talora si arriva ad ottenere enzimi che sono perfino
più processivi e resistenti di entrambi i prodotti dei geni parentali!
Ciò è particolarmente favorito/guidato da simulazioni MD.
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parte V (Biocatalisi) e parte VI (Bioinformatica
per le Biotecnologie Ambientali)
Biocatalisi:
- modulazione e cambiamento di specificità sono traguardi di vari progetti, per ottimizzare la
processività, rendendola più ampia (o più specifica) o creandone una nuova
-confronto per allineamento multiplo e sovrapposizione strutturale possono identificare
fingerprint motifs (gruppi di residui specificamente associati a sottofamiglie dell’enzima aventi
differenti specificità)
E’ molto importante nei casi di modulazione fine della specificità (ad es. stereospecificità)
confrontare (a) strutture reali o (b) modelli “di qualità” (homology modeling seguito da cicli di
quality assessment e optimization).
Solo strutture affidabili nei dettagli rendono sensati studi ad alto zoom in a livello di catene laterali,
spazi interatomici e ponti/coordinazione tra i residui chiave del sito di legame al substrato
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parte V (Biocatalisi) e parte VI (Bioinformatica
per le Biotecnologie Ambientali)
Biocatalisi:
Un esempio noto (pubblicato su Science nel 2008) di computational design è il progetto de novo di
un’aldolasi: l’enzima ottenuto, inizialmente poco attivo (ma funzionale), è stato migliorato per
mutagenesi random del sito attivo (combinazione di approccio guidato ed evoluzione diretta).
Successivamente (approccio generalizzabile ad altri enzimi) cicli rational design & directed evolution
possono essere guidati dalla selezione per la capacità di legare in silico (MD + docking simulation) e
in vitro (X-ray) un ligando specifico.
In biocatalisi, ed in generale nell’ingegneria proteica, gli approcci di computational design sono sempre
più utilizzati grazie ai progressi in biologia (e bioinformatica) strutturale: la presenza di un numero
crescente di strutture PDB e la notevole affidabilità dei modelli ora ottenibili consentono di disegnare ex
novo siti catalitici nuovi in backbone polipetidici di vario tipo.L’attività iniziale talora è bassa, ma si può
guidare l’evoluzione dell’enzima con cicli multipli di mutagenesi razionale/random.
Un aspetto molto promettente del computational design è la possibilità di disegnare il “trapianto” di siti
catalitici in proteine (o loro domini) di tipo diverso (altri enzimi o perfino non enzimatiche) con fold
sovrapponibile (DALI comparison):
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parte V (Biocatalisi) e parte VI (Bioinformatica
per le Biotecnologie Ambientali)
Computational Protein Design: può impiantare un sito catalitico in un backbone/fold artificiale disegnato
ex novo con cicli di MD e fragment assembly da librerie di frammenti e rotameri.
EzCatDB: in aggiunta agli strumenti analitici e predittivi, un grande aiuto ai progetti di ingegnerizzazione
di enzimi viene dai DB ordinati e curati da esperti (knowledgebase). EzCatDB per ciascun enzima integra
informazioni prese: (1) da UniProtKB, (2) strutturali da PDB, (3) sulla catalisi da RLCP. Inoltre, fornisce i
tools di ricerca specifici EzCat-BLAST (ricerche standard) e EzCat-FORTE (ricerca di omologhi lontani)