una molecola segnal

Molecole segnale e secondi
messaggeri
L’accumulo di molecole segnale avviene:
• per stimoli legati alla disponibilità di sostanze
nutritive (carboidrati per cAMP, amino acidi per
ppGpp)
• Per stimoli legati alla densità cellulare (quorum
sensing)
• Per stimoli non ancora identificati legati alla
produzione di sostanze di riserva e/o di
differenziamento cellulare(acetil-fosfato, di-cGMP)
AMP ciclico: una molecola segnale
estremamente conservata
Procarioti:
Segnale di “fame”
Sintetizzato in assenza di glucosio
tramite “coupling” con il sistema di
trasporto PtsG
ATP ATP
Adenilato
ciclasi
Adenilato
ciclasi
cAMP
LA LORO BIOSINTESI E MECCANISMO D’AZIONE
MOSTRANO CONNESSIONI MOLTO STRETTE CON
SISTEMI DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE
AMP ciclico: una molecola segnale
estremamente conservata
Procarioti:
Segnale di “fame”
Sintetizzato in assenza di glucosio
tramite “coupling” con il sistema di
trasporto PtsG
Si lega alla proteina CAP
(regolatore globale) per attivare la
trascrizione di geni per l’utilizzo di
fonti di carbonio alternative al glucosio
(disaccaridi, glicerolo, glicogeno) IN
COMBINAZIONE CON PROTEINE
SPECIFICHE (es. MalT, LacI)
Ruolo più vasto ancora da definire
AMP ciclico: una molecola segnale
estremamente conservata
cAMP
Eucarioti:
Segnale di “fame” nel fegato
σ70
Secondo messagero: sintesi stimolata
da ormoni (es. adrenalina)
Il suo ruolo è innescare l’attività delle
kinasi dando il via a processi di
trasduzione del segnale
Adenilato
ciclasi
Le adenilato ciclasi sono bersagli di
numerose tossine batteriche
(tossina colerica)
L’analogo di CAP in Pseudomonas
(Vfr) è un regolatore di fattori di
virulenza
1
AMP ciclico: una molecola segnale
estremamente conservata
Procarioti:
Segnale di “fame”
ppGpp: cross-talk tra sintesi proteica e trascrizione
La sintesi di ppGpp è
strettamente collegata alla
disponibilità intracellulare di
amminoacidi per la sintesi
proteica.
Eucarioti:
Segnale di “fame” nel fegato
Sintetizzato in assenza di glucosio
Secondo messagero: sintesi stimolata
da ormoni (es. adrenalina)
Si lega alla proteina CAP
(regolatore globale) per attivare la
trascrizione di geni per l’utilizzo di
fonti di carbonio alternative al glucosio
(disaccaridi, glicerolo, glicogeno) IN
COMBINAZIONE CON PROTEINE
SPECIFICHE (es. MalT, LacI)
Generalmente il sito di
formazione del ppGpp è il
ppGpp
ribosoma.
Il suo ruolo è innescare l’attività delle
kinasi dando il via a processi di
trasduzione del segnale o attivare la
trascrizione di geni specifici (VIA
CREB)
Eccezione: Mycobacterium
tubercolosis
Ruolo più vasto ancora da definire
Le adenilato ciclasi sono bersagli di
numerose tossine batteriche
(tossina colerica)
L’analogo di CAP in Pseudomonas
(Vfr) è un regolatore di fattori di
virulenza
L’accumulo di ppGpp blocca la sintesi di
RNA ribosomale
Il ppGpp influenza la trascrizione mediante
un’interazione diretta con l’RNA polimerasi
Dissociazione dell’RNA polimerasi
(E) dal fattore sigma principale
14000
3H-uridine incorporation
RelA/SpoT activation and
ppGpp biosynthesis
Stalled ribosome
12000
Eσ70
10000
8000
argH-
6000
argH-; relA-
E+ σ70
4000
2000
0
0
10
20
30
40
time (minutes)
Stimolazione dell’assemblaggio
dell’RNA polimerasi (E) con fattori
sigma alternativi (σS, σN)
Tempo 0: risospensione di un ceppo auxotrofo per arginina in un
terreno privo di questo amminoacido
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Principali effetti del ppGpp sui
processi cellulari
Proteine asociate
con i ribosomi
(cross-talk regolativo
traduzione/trascrizione)
Effetto negativo:
Blocco della sintesi
proteica e della
biosintesi dei ribosomi
Il di-c-GMP: da Cenerentola delle molecole
segnale a segnale primario di differenziamento
Principali effetti del ppGpp sui
processi cellulari
Proteine asociate
con i ribosomi
(cross-talk regolativo
traduzione/trascrizione)
Ridirezione
dell’espressione genica
Il di-c-GMP viene identificato originariamente
come segnale di produzione della cellulosa
In Glucanacetobacter xylinum
l’intensa produzione di cellulosa
comporta la formazione di “foglietti
galleggianti” in culture statiche
La produzione di cellulosa nei batteri è relativamente ben conservata:
Agrobacterium tumefaciens (patogeno vegetale)
E. coli (compresi ceppi patogeni)
Salmonella typhi
Dove la cellulosa funge da agente di protezione contro stress ambientali
e come meccanismo di colonizzazione dell’ospite
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Meccanismo di attivazione della sintesi di
cellulosa da di-c-GMP
Attivazione della cellulosa sintasi
tramite legame con di-c-GMP
Motivi GGDEF ed EAL
Modulazione della produzione di
cellulosa in Salmonella
diguanilato ciclasi
fosfodiesterasi
Motivi DUF-1 (GGDEF) e
DUF-2 (HD-GYP) si
ritrovano in un numero
significativo di proteinachinasi, sensori di sistemi
a due componenti e ad
altre famiglie di proteine.
La funzione del di-c-GMP
trascende quindi la
semplice funzione di
regolatore della sintesi
della cellulosa; sembra
invece avere un ruolo
importante in diversi
processi cellulari,tra cui:
GGDEF
EAL
Formazione del biofilm
Espressione di fattori di
virulenza
Differenziamento
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Conservazione delle DCG nei batteri
• Le di-c-GMP-sintetasi sono altamente conservate e
rappresentate in grande numero nei microrganismi:
Specie
Nr. DCG
Vibrio vulnificus
Shewanella oneidensis
Escherichia coli
GGDEF
59
41
27
nd
18
Altre molecole segnale dello stato
fisiologico ed energetico della cellula
EAL
nd
Acetil-fosfato (prodotto da
intermedio della glicolisi)
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Esempi:
rpfG (Xanthomonas campestris): produzione enzimi extracellulari
wspR (Pseudomonas aeruginosa): formazione del biofilm
hmsT (Yersinia pestis): colonizzazione della pulce (ospite)
pleD (Caulobacter crescentus): divisione cellulare
Referenze x molecole segnale
Omoserin-lattoni (indicatori di
densità cellulare e derivati dalla
biosintesi degli aminoacidi)
Replicazione cellulare tramite
“divisione ineguale”: la spora
• cAMP:
Kolb et al., Annu. Rev. Bioch. 1993, 62:749-765
Johansson et al., Cell, 2000, 102:475-485
• ppGpp
Chatterji and Ojha, Curr. Opin. Microbiology 2001, 4:160–165
Gentry et al., Journal Bacteriol. 1993, 175:7982-7989
• di-c-GMP:
Ross et al., Microbiological reviews, 55:35-58, 1991
Jenal, Current Opinion in Microbiology 2004, 7:185–191
5
Caulobacter crescentus:
ciclo cellulare
La replicazione cellulare tramite
“divisione ineguale” è la norma in C. crescentus
Il C. crescentus: un modello batterico di
differenziamento cellulare
PleC e DivJ sono proteine sensori parte di
sistemi di regolazione a due componenti
(Regolatori di risposta: DivK e PleD)
1
2
3 4 5
DivJ
DivK(-P)
PleC
PleD(-P)
6
Autofosforilazione di DivJ (1-2) e di PleC (3-4) e
fosforilazione DivJ-dipendente di PleD (5-6)
6
Funzione di DivK e PleD
Importanza dei sistemi PleC/PleD e
DivJ/DivK
• Proteine regolatrici di risposta in sistemi a due
componenti
• Non coinvolte direttamente in regolazione della
trascrizione
• PleD appartiene alla famiglia GGDEF ed è una di-cGMP-sintasi
Mutazioni nei sistemi a due
componenti pleC/pleD e/o in
divJ/divK risultano nella perdita
dell’organizzazione del ciclo
cellulare e della divisione
cellulare in C. crescentus
• DivK trasduce il segnale (trasferisce il gruppo fosfato) ad
altri fattori coinvolti nel ciclo cellulare
La localizzazione polare delle proteine sensore è
la chiave del processo di divisione cellulare
Divisione ineguale in tutto e per tutto…..
Riposizionamento di PleC al polo della
Fosforilazione
Sintesi
di PleD
del
peduncolo e inizio
cellula
figlia
e completamento
della
e posizionamento
della cellulare
divisione
di DivJcellulare
divisione
PleC
PleD-P
Le cellule derivanti
dalla divisione
cellulare hanno
densità cellulare
differente
7
La localizzazione polare di diverse proteine
(componenti di TCRS) è un processo chiave
della duplicazione cellulare
CtrA: un regolatore fondmentale nella
divisione cellulare
Proteine marcate con un reporter
visualizzabile (Green Fluorescent
Protein) possono essere seguite
nella loro localizzazione cellulare
La presenza di CtrA inibisce la replicazione del DNA
La concentrazione di CtrA viene
regolata a diversi livelli
Regolazione trascrizionale
p1 p2
1) Regolazione trascrizionale
ctrA
GA-meTC
CTme-AG DNA rep.
GA
TC
CTme-AG
GA-meTC
CT
AG
2) Compartimentazione
3) Proteolisi differenziata per compartimento
Promoter1: attivo solo se emi-metilato
(Solo al momento della replicazione del DNA)
8
L’espressione di CtrA è finemente
sincronizzata con la replicazione del DNA
Emimetilazione
Promotore attivo
Metilazione di p1 p1 p2
(inattivazione)
Accumulo di CtrA
ctrA
CtrA
CtrA
P
Il fato di CtrA è diverso nelle cellule
ST e SW
CtrA
CtrA
CtrA
CckA
CcrM
(metil-trasferasi)
ccrM
“Invecchiamento” nelle cellule ST
Degradazione di CtrA
dipendente dalla
proteasi ClpXP
Il C. crescentus come modello di
sviluppo cellulare
• “Maturazione” (transizione swarmer>stalked)
• Divisione ineguale (differenziamento cellula
madre/cellula figlia)
• Inefficienza crescente a nuovi eventi di
duplicazione nella cellula stalked
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Referenze
http://caulobacter.stanford.edu/shaplab/
McGrath et al., Curr. Opinion Microb., 7:192-197 (2004)
McAdams and Shapiro, Science 301:1874-1877 (2003)
Aldridge et al., Mol. Microbiol. 47:1695-1708 (2003)
Paul et al., Genes Develop. 18:715-727 (2004)
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