CANDIDATO: TADDEI LUCILLA ANALISI DEL SISTEMA DI

CANDIDATO: TADDEI LUCILLA
ANALISI DEL SISTEMA DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE NEL CICLO CELLULARE DI
Sinorhizobium meliloti
RELATORE: PROF. MARCO BAZZICALUPO
CORRELATORE: DR. ALESSIO MENGONI
Sinorhizobium meliloti è un batterio del suolo in grado di stabilire delle relazioni simbiotiche con piante
leguminose come l’erba medica (Medicago spp.), stimolando la formazione di una struttura specializzata della
pianta: il nodulo. All’interno del nodulo i batteri stabiliscono un’infezione intracellulare duratura che porta alla
fissazione dell’azoto da parte dei batteri, che diventano allungati, incapaci di duplicarsi, poliploidi e sono
definiti batteroidi. Tali caratteristiche suggeriscono un’alterazione della progressione del ciclo cellulare durante
la differenziazione in batteroidi. Secondo un modello di regolazione del ciclo cellulare proposto per
Caulobacter crescentus, ma valido anche per S. meliloti, il principale regolatore del ciclo cellulare è CtrA.
Poiché il mutante per deplezione di ctrA in S.meliloti mostra carattestiche simili al fenotipo del batteroide
(endoreduplicazione del genoma, arresto della divisione cellulare, cellule allungate e ramificate), è stata
proposta una relazione tra il blocco della progressione del ciclo cellulare mediante l’inattivazione di CtrA e la
differenziazione in batteroidi. E’ noto anche che CtrA è inibito da DivK in un modo ciclo cellulare-dipendente
e lo stesso DivK è attivato dalle istidine chinasi DivJ e CbrA, mentre PleC è la sua principale fosfatasi. Poiché
in Caulobacter, la delezione di divJ riduce il livello di fosforilazione di DivK e si ha quindi un incremento
dell’attività di CtrA, abbiamo ipotizzato che la ridotta efficienza della fissazione dell’azoto presentata dal
mutante divJ in S. meliloti, sia dovuta proprio a un aumento dell’attività di CtrA. Questo può suggerire che
durante il processo di differenziazione, CtrA debba essere regolato negativamente e quindi DivJ, controllando il
livello di fosforilazione di CtrA, sia indirettamente coinvolto nella differenziazione nei batteroidi.
In questo lavoro è stato analizzato il ruolo di alcuni membri della famiglia Pdh (pleC, divJ homologue)
nella regolazione del ciclo cellulare in S. meliloti e il loro possibile coinvolgimento nella differenziazione dei
batteri a vita libera in batteroidi. A tale proposito, mediante l’utilizzo della trasduzione fagica, è stato
dimostrato che la delezione di divJ combinata con l’overespressione di ctrA è una condizione letale per i batteri,
probabilmente perché blocca la progressione del ciclo cellulare. Sono stati inoltre analizzati i mutanti ottenuti
dall’overespressione dei geni divJ e divK. L’overespressione di questi due geni genera mutanti con
caratteristiche simili: morfologia cellulare ramificata e vitalità ridotta (in divJ queste caratteristiche sono più
pronunciate), in particolare l’overespressione di divJ è letale mentre quella di divK mostra un effetto
batteriostatico. Particolarmente interessante è la forma allungata e ramificata simile al batteroide data
dall’overespressione del gene divJ. Queste caratteristiche fanno ipotizzare che un’aumentata espressione di divJ
potrebbe essere coinvolta nella differenziazione dei batteri nei batteroidi, anche se per completare il programma
di sviluppo sono necessari altri cambiamenti (ad esempio l’endoreduplicazione del genoma). Abbiamo poi
confrontato le caratteristiche fenotipiche del mutante divJ con quelle del mutante cbrA. Entrambi i mutanti
hanno in comune delle alterazioni negli LPS, sensibilità allo stress ossidativo e una maggiore affinità per il
calcofluor, che evidenzia una maggiore concentrazione di esopolisaccaridi sulla superficie delle cellule.
Successivamente si è costruito il doppio mutante (divJ, cbrA) per osservare se questa combinazione genera
cellule vitali o un fenotipo letale. E’ stato dimostrato che la combinazione è letale. Infine abbiamo analizzato un
altro membro della famiglia Pdh: pleC. Per prima cosa, è stata effettuata la delezione di pleC ed è stata ottenuta
solo in un ceppo, complementato con una extracopia di pleC e del suo promotore. Ciò suggerisce che la
delezione di questo gene è letale e per confermare questo dato abbiamo effettuato la trasduzione della delezione
di pleC sia in un ceppo contenente un plasmide per la complementazione della mutazione, che in un ceppo con
il vettore vuoto. Da questo esperimento abbiamo ottenuto batteri trasdotti solo dal primo ceppo, dimostrando
che pleC è un gene essenziale in S. meliloti.